mTERT启动子调控的CD80-SEA基因重组腺病毒载体的构建及在不同肿瘤细胞中的表达研究

[目的]构建小鼠端粒酶反转录酶(mTERT)启动子调控的葡萄球菌肠毒素A(SEA)和CD80基因共表达重组腺病毒载体,并观察其介导的SEA和CD80在小鼠肝癌细胞Hepa1-6、结肠癌细胞CT26、黑色素瘤细胞B16和成纤维细胞NIH3T3中的表达情况。[方法]采用AdEasy腺病毒体系,亚克隆mTERT核心启动子区至穿梭质粒pShuttle2,并在其上游插入myc-Max反应元件MMRE,用来调控SEA及CD80基因的表达,构建SEA和CD80基因共表达重组腺病毒载体Ad-MMRE-mTERT-BIS,转化Ad293细胞制备病毒并纯化,然后将病毒以感染复数为100的浓度分别感染上述四种细胞。采用免疫荧光染色法及流式细胞术检测SEA和CD80在细胞膜表面的表达情况。[结果]以感染复数为100病毒量感染上述细胞后,CD80和SEA的不同肿瘤细胞上表达率不同,而病毒感染的NIH3T3细胞不表达SEA和CD80。[结论]成功地构建了mTERT启动子调控的SEA和CD80基因共表达重组腺病毒载体,能够调控SEA和CD80基因在不同肿瘤细胞中的靶向表达,但表达效率有所不同。为进一步采用同一腺病毒对不同肿瘤细胞的进行靶向基因治疗研究奠定了基础。     

hTERT启动子调控的SEA-CD80基因共表达重组腺病毒载体的构建及在不同肿瘤细胞中的表达鉴定

目的：构建肿瘤靶向性葡萄球菌肠毒素 A 和 CD80基因共表达重组腺病毒载体。方法：采用 PCR 技术从质粒 pShuttle - AFP - CD80扩增人 CD80全长 cDNA 片段,克隆至已构建载体 pMD18- T - BIS,取代小鼠CD80 cDNA 片段。重组质粒命名为 pMD18- T - hBIS。经酶切,将 CWV 增强子修饰的人端粒酶反转录酶启动子从已构建载体 pGL3- CWVE - hTP,亚克隆至穿梭质粒 pShuttle2,然后经酶切将片段 hCD80- IRES - SEA从 pMD18- T - hBIS 质粒亚克隆至 CWV 增强子修饰的人端粒酶反转录酶启动子下游,构建质粒 pShuttle2-CE - hTP - hBIS。再与腺病毒骨架质粒 pAdEasy -1共转化 E. coli BJ5183,以获得的重组子（命名为 Ad - CE- hTP - BIS）转染 Ad293细胞制备病毒并纯化。将病毒分别感染人肝癌细胞 H7721、宫颈癌细胞株 Hela 细胞和原代培养的人牙龈成纤维细胞,经免疫荧光染色后,激光共聚焦显微镜观察 SEA 和 CD80在细胞膜的表达情况。结果：重组腺病毒能够使 CD80和 SEA 在人肝癌细胞 H7721、宫颈癌细胞株 Hela 细胞膜上共表达,而在人牙龈成纤维细胞中不表达。结论：成功地构建了多肿瘤靶向性 SEA 和 CD80基因共表达重组腺病毒载体。为应用 SEA 和 CD80基因对人多种肿瘤进行靶向基因治疗奠定了基础。     

小鼠甲胎蛋白基因顺式调控元件的选择性克隆重组及功能研究

目的构建并选择肝癌特异性甲胎蛋白(AFP)基因启动元件。方法采用PCR方法从小鼠肝脏克隆AFP基因增强子I、抑制子和启动子,经过不同组合构建了两个真核表达载体:pEGFP-1-EP(含调控序列I:增强子I 启动子)和pEGFP-1-ERP(含调控序列II:增强子I 抑制子 启动子)。通过瞬时转染,采用荧光显微镜观察和流式细胞仪检测所构建调控序列分别在小鼠肝癌细胞株Hepa1-6、黑色素瘤细胞株B16和成纤维细胞株NIH3T3的活性。结果所得AFP基因增强子I、抑制子和启动子序列与Genebank中公布的相关序列一致;荧光显微镜下:pEGFP-1-EP和pEGFP-1-ERP转染Hepa1-6细胞呈强阳性反应,pEGFP-1(空载体)转染Hepa1-6和三种质粒转染的B16、NIH3T3细胞均呈阴性反应;流式细胞仪检测结果显示:pEGFP-1-EP转染Hepa1-6阳性细胞率和平均荧光强度高于pEGFP-1-ERP转染Hepa1-6细胞,两者阳性细胞率和平均荧光强度均高于pEGFP-1转染Hepa1-6细胞;pEGFP-1转染Hepa1-6和三种质粒转染B16、NIH3T3阳性细胞率和平均荧光强度均较低。结论我们所构建小鼠AFP基因调控序列I和调控序列II的启动活性均具有肝癌特异性,且前者高于后者,并选择调控序列I在下一步肝癌特异性基因治疗中使用。     

两种甲胎蛋白启动子调控下PNP基因载体的克隆和表达差异性分析

目的:分别构建甲胎蛋白(α- fetoprotein,AFP)启动子AF 0 3和AFP杂合启动子[HRE]AF调控的 PNP基因表达载体,检测并分析两者的表达差异性。方法: 将AF 0 3和[HRE]AF启动子插入载体 pcDNA- 3 .0 中,构建肝癌特异表达载体pAF- 0. 3 和 p[HRE]AF;将 PNP基因分别插入 pAF -0 .3 和 p[HRE] AF中,构建两启动子调控的 PNP基因表达载体;通过酶切、PCR及测序鉴定各重组体。用脂质体介导法将两重组体转染不同细胞株,RT PCR检测 PNP基因在各细胞株中表达,分析两者表达的特点。结果: 两目的片段均正确插入相应载体,pAF- 0 3/PNP中的 PNP基因在 AFP阳性肝癌细胞中实现了靶向性表达,而p[HRE] AF/PNP 中的 PNP 基因则在AFP阳性和阴性肝癌细胞中实现了靶向性表达。结论: 两种 PNP基因表达载体是肝癌基因治疗中新型、高效、特异性的治疗载体。两者的成功构建为利用PNP/Mep -dR系统进行肝癌的靶向性基因治疗奠定了坚实的基础。     

两种甲胎蛋白启动子调控下PNP基因载体的克隆和表达差异性分析

目的：分别构建甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)启动子AF0．3和AFP杂合启动子[HRF]AF调控的PNP基因表达载体，检测并分析两者的表达差异性。方法：将AF0．3和[HRE]AF启动子插入载体pcDNA3．0中，构建肝癌特异表达载体pAF0．3和p[HRE]AF；将PNP基因分别插入pAF0．3和p[HRE]AF中，构建两启动子调控的PNP基因表达载体；通过酶切、PCR及测序鉴定各重组体。用脂质体介导法将两重组体转染不同细胞株．RT-PCR检测PNP基因在各细胞株中表达，分析两者表达的特点。结果：两目的片段均正确插入相应载体，pAF0．3/PNP中的PNP基因在AFP阳性肝癌细胞中实现了靶向性表达，而p[HRE]AF/PNP中的PNP基因则在AFP阳性和阴性肝癌细胞中实现了靶向性表达。结论：两种PNP基因表达载体是肝癌基因治疗中新型、高效、特异性的治疗载体。两者的成功构建为利用PNP Mep-dR系统进行肝癌的靶向性基因治疗奠定了坚实的基础。     

含人AFP基因重组腺病毒载体的构建及其转染树突状细胞瘤苗的制备

目的：构建含人AFP基因的腺病毒载体,体外转染树突状细胞,制备树突状细胞肝癌瘤苗。方法：将AFP基因亚克隆到pIND载体和Shuttle2载体中,构建穿梭载体Shuttle2-AFP。用PI—SceⅠ和I—Ceu Ⅰ双酶切后将所获AFP基因片段再与线性化的腺病毒载体pAdeno—X连接,构成pAdeno—AFP重组腺病毒载体。其后,用重组腺病毒载体转染HEK293细胞,包装腺病毒表达载体。通过酶切、PCR对腺病毒载体进行鉴定。包装好的重组病毒载体pAdeno—AFP体外感染树突状细胞制备树突状细胞肝癌瘤苗后,FACS分析pAd-eno—AFP／DC表面分子的表达,酶联免疫吸附试验法（ELISA）检测AFP水平。结果：酶切、PCR鉴定证实,穿梭质粒插入片段为AFP基因。包装的腺病毒载体具有良好的感染性,可以在293细胞中形成病毒颗粒,腺病毒载体内携带AFP基因感染树突状细胞,pAdeno—AFP／DC能高水平的表达CD1a,CD11c,CD80,CD86以及HIA—DR,并分泌较高水平的AFP。结论：构建成功的含AFP腺病毒载体可以在树突状细胞中表达AFP,为DC瘤苗的进一步研究奠定了基础。     

GM-CSF基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的：构建人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）基因的重组腺病毒载体，为进一步研究GM-CSF基因在肿瘤基因治疗中的应用提供实验基础。方法：采用PCR方法，从重组质粒pcDNA3．1-GM-CSF扩增出GM-CSF基因片段，通过穿梭质粒pShuttle，将带有CMV启动子的目的片段克隆入Adeno-X腺病毒DNA中，获得重组腺病毒DNA，通过脂质体转染HEK293细胞，经包装扩增后，获得重组腺病毒Adeno-X-GM-CSF，PCR鉴定，ELISA法检测表达产物。结果：含GM-CSF基因的重组腺病毒Adeno-X-GM-CSF构建成功，经PCR鉴定和DNA测序等证实了其正确性，重组腺病毒上清液中GM-CSF表达量达26ng／mL。结论：含GM-CSF基因的重组腺病毒构建成功。     

肝癌细胞中定向表达p16基因的腺病毒载体的构建及其活性表达

目的：克隆AFP启动子和p16基因全长cDNA,构建在肝癌细胞中定向表达p16基因的腺病毒载体,研究p16基因表达对肝癌细胞的影响。方法：采用分子生物学技术手段,克隆AFP启动子和p16基因全长cDNA,将其插入腺病毒载体质粒中,并在293细胞中重组出携带p16基因的腺病毒AdAFP-p16。Western Blot检测p16基因在肝癌细胞中的特异性表达。细胞病变效应（CPE）观察p16基因表达对肝癌细胞生长的抑制作用。结果：AdAFP-p16能够介导p16基因在肝癌细胞中特异性表达,而对正常细胞中p16的表达没有影响;p16基因表达能够特异性抑制肝癌细胞的生长。结论：采用AFP启动子可以实现p16基因的肝癌细胞中定向而特异性表达,提高基因表达产物在肿瘤局部的浓度,有利于提高治疗效果。     

人MUC4启动子驱动的HSV-TK重组腺病毒靶向杀伤SGC-7901胃癌细胞的实验研究

目的:构建人粘蛋白( MUC4)启动子驱动下的单纯疱疹胸苷激酶基因(HSV-TK)重组腺病毒,研究其对SGC-7901胃癌细胞的靶向杀伤作用.方法:克隆MUC4启动子区625 bp活性序列,构建重组荧光素酶报告基因载体pGL3-MUC4,检测其在SGC-7901胃癌细胞及NIH3T3成纤维细胞中的转录活性.以AdEasyTM腺病毒系统为载体,构建MUC4启动子驱动下的HSV-TK重组腺病毒rAdeno-MUC4-TK,感染SGC-7901及NIH3T3,经更昔洛韦(GCV)处理,MTT法检测细胞活力,TUNEL法检测细胞凋亡.结果:成功扩增出大小为625 bp的MUC4启动子序列.pGL3-MUC4在SGC-7901细胞中具有强转录活性,转录活性高于强启动子SV40 6.6倍,而NIH3T3成纤维细胞系中几乎无转录活性.构建重组腺病毒rAdeno-MUC4-TK,MTT法和TUNEL检测结果显示,其与GCV联合能够诱导SGC-7901细胞凋亡,产生靶向细胞毒作用.结论:人MUC4启动子驱动下的HSV-TK重组腺病毒联合GCV对SGC-7901胃癌细胞具有靶向杀伤作用,MUC4启动子可以作为胃癌靶向基因治疗的工具.     

蜂毒素基因重组腺病毒对肝癌细胞的杀伤作用

目的：构建携蜂毒素基因及甲胎蛋白（AFP）启动子（rAFP)的重组腺病毒载体，探讨rAFP驱动的蜂毒素基因在体外对肝癌细胞的特异性杀伤作用。方法：人工合成蜂毒素基因，置于rAFP之后，用细菌内高效同源重组法将目的基因重组入腺病毒质粒中，转染人胚肾293细胞进行腺病毒包装；采用MTT法测定蜂毒素基因转染对AFP阳性，阴性肝癌细胞及正常肝细胞增殖的影响。结果：携蜂毒素基因重组腺病毒载体构建成功，MTT实验证明携蜂毒素基因重组腺病毒转染后，AFP阳性肝癌细胞的增殖受到明显抑制，而对AFP阴性肝癌细胞及正常肝细胞无明显影响；无蜂毒素基因的重组腺病毒转染，则对各种细胞增殖均无抑制作用。结论：表达rAFP驱动的蜂毒素基因的重组腺病毒在体外可特异性地杀伤AFP阳性肝癌细胞。     

GM-CSF基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建人粒细胞 巨噬细胞集落刺 激因子(GM CSF)基因的重组腺病毒载体,为进 一步研究GM CSF基因在肿瘤基因治疗中的应 用提供实验基础。方法:采用PCR方法,从重 组质粒pcDNA3.1 GM CSF扩增出GM CSF 基因片段,通过穿梭质粒pShuttle,将带有CMV 启动子的目的片段克隆入Adeno X腺病毒 DNA中,获得重组腺病毒DNA,通过脂质体转 染HEK293细胞,经包装扩增后,获得重组腺 病毒Adeno X GM CSF,PCR鉴定,ELISA法 检测表达产物。结果:含GM CSF基因的重组 腺病毒Adeno X GM CSF构建成功,经PCR鉴 定和DNA测序等证实了其正确性,重组腺病毒 上清液中GM CSF表达量达26ng/mL。结论: 含GM CSF基因的重组腺病毒构建成功。     

人MUC4启动子驱动的HSV—TK重组腺病毒靶向杀伤SGC-7901胃癌细胞的实验研究

目的：构建人粘蛋白（MUC4）启动子驱动下的单纯疱疹胸苷激酶基因（HSV-TK）重组腺病毒,研究其对SGC一7901胃癌细胞的靶向杀伤作用。方法：克隆MUC4启动子区625bp活性序列,构建重组荧光素酶报告基因载体pGL3MUC4,检测其在sGD790l胃癌细胞及NIH3T3成纤维细胞中的转录活性。以AdEasy。”腺病毒系统为载体,构建Muc4启动子驱动下的HsV—TK重组腺病毒rAdeno—MUC4一TK,感染SGC7901及NIH3T3,经更昔洛韦（GCV）处理,MTT法检测细胞活力,TUNEL法检测细胞凋亡。结果：成功扩增出大小为625bp的MUC4启动子序列。pGL3一MUC4在SGC一790l细胞中具有强转录活性,转录活性高于强启动子SV406．6倍,而NIH3T3成纤维细胞系中几乎无转录活性。构建重组腺病毒rAdeno—MUC4一TK,MTT法和TUNEI。检测结果显示,其与GCV联合能够诱导SGC-7901细胞凋亡,产生靶向细胞毒作用。结论：人MUC4启动子驱动下的HSV—TK重组腺病毒联合GCV对SGC一7901胃癌细胞具有靶向杀伤作用,MUC4启动子可以作为胃癌靶向基因治疗的工具。     

人MUC4启动子驱动HSV-TK腺病毒靶向杀伤胃癌细胞的研究

目的：构建人MUC4启动子驱动下的HSV-TK重组腺病毒,研究其对胃癌细胞的靶向杀伤作用。方法：免疫荧光法检测MUC4在胃癌细胞系中的表达。克隆MUC4启动子区625bp活性序列,利用重组荧光素酶检测系统检测其在SGC-7901胃腺癌细胞及NUGC4胃印戒细胞癌细胞中的转录活性。以AdEasyTM腺病毒系统为载体,构建MUC4启动子驱动下的HSV-TK重组腺病毒,与前体药物GCV联合,检测其对上述两种胃癌细胞的细胞毒作用。结果：MUC4蛋白在两种胃癌细胞的胞浆和胞膜均有表达,而在成纤维细胞中无表达。克隆的MUC4启动子片段在SGC-7901和NUGC4细胞中具有强转录活性,转录活性高于强启动子SV40,而NIH3T3成纤维细胞系中几乎无转录活性。MUC4启动子驱动下的HSV-TK重组腺病毒与GCV联合能够诱导SGC-7901和NUGC4胃癌细胞凋亡,产生特异性靶向细胞毒作用。结论：人MUC4启动子驱动下的HSV-TK重组腺病毒联合GCV对SGC-7901和NUGC4胃癌细胞具有靶向杀伤作用,MUC4启动子可以作为胃癌靶向基因治疗的工具。     

Cell-specific expression of the diphtheria toxin A-chain coding sequence under the control of the upstream region of the human alpha-fetoprotein gene

BACKGROUND AND OBJECTIVES: Development of the system to express a suicide gene selectively in tumor cells is essential for gene therapy. We constructed a plasmid containing the diphtheria toxin A (DTA) fragment linked to human alpha-fetoprotein (AFP) promoter and enhancer, and tested whether it can exert its cytocidal effect selectively on AFP-producing cells. METHODS: The chloramphenical acetyltransferase (CAT) reporter gene or DTA gene was linked to the 5' upstream region of the AFP gene. The plasmids were transfected into AFP-producing or non-producing cells by the lipopolyamine-coated DNA method. Expression of CAT activity and effects on cell growth of transfected cells were assessed. RESULTS: When the AFP-producing cells HuH-7 or HepG2 were cotransfected with CAT reporter plasmid and pAF5.1DTA plasmid, the CAT activity was greatly suppressed. In contrast, cotransfection with pAF5.1DTA-R, the inversely inserted DTA gene, did not inhibit CAT activity. Furthermore, cell growth of HuH-7 cells transfected with pAF5.1DTA plasmid was significantly inhibited compared with HuH-7 cells transfected with DTA-R plasmid. CONCLUSIONS: Our results indicate that selective killing of AFP-producing cells will be attained by introducing the DTA gene linked to the promoter and enhancer region of AFP.     

重组腺病毒rAD-mTERT-m4-1BBL与T淋巴细胞混合培养对小鼠肝癌细胞株Hepa1-6的免疫杀伤作用

目的 研究在T淋巴细胞混合培养条件下,腺病毒rAD-mTERT-m4-1BBL(简称rAD-mTERT)对小鼠肝癌细胞株Hepa1-6的免疫杀伤作用.方法 分别以rAD、rAD-CMV-m4-1BBL(简称rAD-CMV)和rAD-mTERT转染Hepa1-6和1929细胞,检测其生长和凋亡变化.将转基因细胞与小鼠脾T淋巴细胞混合培养,观察T淋巴细胞表型变化及转基因细胞的生长和凋亡变化.细胞生长的检测采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法,细胞凋亡的检测采用Annexin V-碘化丙啶(PI)双染色法.结果 rAD、rAD-CMV和rAD-mTERT病毒对Hepa1-6和L929细胞均有明显的生长抑制作用和轻度的促凋亡作用.与活化T淋巴细胞混合培养后,各组转基因Hepa1-6和L929细胞的生长均受到抑制,以rAD-CMV+T淋巴细胞组最为明显;rAD-CMV对Hepa1-6和L929细胞的促凋亡作用均十分明显,rAD-mTERT仅对Hepa1-6细胞有明显的促凋亡作用.混合培养后,CD4~+和CD8~+T淋巴细胞均出现一定程度的增殖,但CD8~+T淋巴细胞增殖明显强于CD4~+T淋巴细胞,CD4/CD8比值从混合培养前的1.27下降为混合培养后的1.08.结论 单纯腺病毒可以抑制靶细胞的生长,但不促进其凋亡.在与T淋巴细胞混合培养下,重组腺病毒载体rAD-mTERT可靶向抑制Hepa1-6细胞的生长并促进其凋亡,其促凋亡作用是通过T淋巴细胞的免疫杀伤作用实现的.     

腺病毒介导的HBsAg基因修饰树突状细胞瘤苗对HepG2.2.15肝癌细胞的免疫效应

目的研究腺病毒介导的HBsAg基因修饰树突状细胞(DC)体外诱导对HepG2.2.15肝癌细胞特异性的细胞毒效应。方法将HBsAg基因亚克隆到pIND和pShuttle载体中,构建重组载体pShuttle-S。将用PI-SceⅠ和Ⅰ-CeuⅠ双酶切后所获得的HBsAg基因片段与线性化的腺病毒载体pAdeno-X连接,构成腺病毒表达载体AdVHBsAg。经HEK293细胞包装腺病毒后,收获病毒并做滴度测定,再将AdVHBsAg转染人单核细胞来源的DC构建AdVHBsAg-DC肝癌瘤苗。采用Western blot法鉴定转染基因表达;流式细胞仪检测表面分子;3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)法检测T细胞增殖反应的能力;乳酸脱氢酶(LDH)法检测CTL活性。结果穿梭质粒插入片段为HBsAg基因;包装的腺病毒载体具有良好的感染性,可在HEK293细胞中形成病毒颗粒;HBsAg基因表达于AdVHBsAg- DC中,表明腺病毒介导的HBsAg基因转染的有效性;AdVHBsAg-DC可高表达CD1a、CD11c、CD80、CD86和HLA-DR;AdVHBsAg-DC刺激自体T细胞增殖功能明显高于AdVLacZ-DC组和未转染的DC组(P<0.05);AdVHBsAg-DC体外诱导CTL能够对表达HBsAg肝癌细胞起到特异性杀伤作用。结论AdVHBsAg可在DC中表达HBsAg肝癌相关抗原;AdVHBsAg-DC瘤苗可诱导T细胞产生高效的针对HepG2.2.15肝癌细胞的细胞毒效应。