树鼩原代细胞的分离及感染甲型流感病毒模型的构建

目的建立甲型流感病毒PR8株(A/PR/8/34,H1N1)对树鼩原代气管内皮细胞、树鼩原代肺细胞及树鼩原代肾细胞的体外感染模型。方法胶原酶蛋白消化法获得树鼩原代气管内皮细胞、树鼩原代肺细胞及树鼩原代肾细胞,用流感病毒PR8株感染树鼩原代细胞,测定24、48和72 h培养上清病毒载量,并观察细胞感染流感病毒后的形态变化,以确定流感病毒PR8株体外对树鼩原代气管内皮细胞、树鼩原代肺细胞及树鼩原代肾细胞的感染性。结果分离到的树鼩原代细胞经传代培养纯化和形态鉴别,对树鼩原代气管内皮细胞、原代肺细胞、原代肾细胞和犬肾传代细胞(MDCK)进行流感病毒易感性比较,培养48 h时显微镜下均能观察到明显的细胞病变(CPE);培养72h时病毒滴度可分别达到2.40×10~5 TCID_(50)/mL、1.20×10~3 TCID_(50)/mL、1.74×10~4 TCID_(50)/mL和1.79×10~7 TCID_(50)/mL。结论流感病毒可有效感染树鼩原代气管内皮细胞、原代肺细胞、原代肾细胞并有效增殖,且流感病毒对树鼩原代气管内皮细胞感染性最强,与流感病毒易感细胞MDCK相比具有统计学意义。确立了树鼩原代细胞的分离与培养方法,初步建立了流感病毒感染树鼩原代细胞的体外模型。     

采用体外侵袭实验分离侵袭性人原代肾细胞癌细胞

目的:体外分离肾细胞癌原代侵袭性和非侵袭性细胞.方法:消化法或植块法对32例临床新鲜肾细胞癌进行原代培养.在预实验确定铺胶浓度、消化回收时间的基础上,采用涂有Matrigel的Transwell对3例原代培养的肾细胞癌细胞进行体外侵袭实验,分离回收侵袭性和非侵袭性细胞.结果:(1)原代培养成功率为90.6%(29/32).(2)以1.0 mg/ml、20 μl/孔对Transwell铺胶,固定细胞悬液密度(5×105/ml),第5天消化回收细胞较为理想.非侵袭性细胞散在生长,侵袭性细胞多呈克隆样生长.侵袭性细胞倍增时间为36.1 h,非侵袭性细胞为50.6 h.结论:Transwell可体外快速分离及回收、培养不同侵袭性的肾癌原代细胞群.用原代肿瘤细胞进行体外侵袭实验代表性好,但难以突破肿瘤细胞的有限生存期.     

形觉剥夺树鼩视皮质17区的可塑性

目的 探讨肠道病毒71型(EV71)对树鼩肾细胞的感染特性.方法 通过组织块贴壁法分离培养树鼩原代肾细胞,观察细胞形态并进行传代培养,利用细胞角蛋白18对树鼩肾细胞进行间接免疫荧光鉴定.用EV71感染树鼩肾细胞,通过倒置显微镜观察细胞病变情况,结合间接免疫荧光实验观察细胞中病毒蛋白的表达情况,采用实时荧光定量PCR技术检测病毒载量,以Vero细胞为对照,研究EV71对树鼩肾细胞的感染情况.结果 通过组织块贴壁法可以快速获得树鼩原代肾细胞,并可进行多次传代培养,细胞为梭形,贴壁呈铺路石状,免疫荧光鉴定为肾上皮细胞.EV71可以感染树鼩肾细胞,使之出现明显的细胞变圆、脱落或解体等病变,免疫荧光实验可以观察到病毒蛋白的分布,实时荧光定量PCR检测病毒载量最高可达105拷贝/mL,病变情况和增殖趋势与Vero细胞相似.结论 EV71可以体外感染树鼩肾细胞,该细胞模型可为EV71药物筛选和感染机制研究提供平台.     

人肾细胞癌细胞的原代培养及癌基因表达初步分析

目的:研究人肾细胞癌(RCC)原代细胞生物学特性及其癌基因的表达情况。方法：应用改良的原代肿瘤细胞分离法分离培养7例人RCC原代细胞。应用染色体核型分析和免疫组化方法,分析原代细胞核型以及癌基因与抑癌基因的表达。结果：用本法培养的原代细胞比其他常规方法所得细胞既多且纯。所培养的人RCC原代细胞的癌基因表达分析发现bcl-2,c-erbB-2,c-met,表皮生长因子受体(EGFR)有轻度至中度表达,而p53没有表达。结论：人RCC原代培养及其癌基因表达检测,为应用原代RCC所开展exvivo的RCC基因治疗打下了初步的基础。     

消退素D1抑制内毒素诱导大鼠原代肺成纤维细胞环氧合酶-2及前列腺素E2表达的研究

目的 探讨消退素D1对原代肺成纤维细胞(LF)环氧合酶-2(COX-2)及前列腺素E2(PGE2)表达的影响.方法 分离、纯化、鉴定得到LF,用内毒素(LPS)干预建立成纤维细胞体外急性炎症模型,并利用细胞增殖/毒性检测试剂MTT检测出成纤维细胞急性炎症模型的最适LPS浓度和药物干预时间.分别应用不同浓度(0、10、50及100 nmol/ml)的消退素D1作用于经过LPS诱导的体外培养原代LF.采用酶联免疫法(ELISA)检测细胞上清液PGE2水平,同时应用Western-blot检测原代LF COX-2蛋白的表达.结果 用1μg/ml LPS干预体外培养的原代LF6h能建立较为合理的急性炎症模型.消退素D1能抑制LPS诱导的原代LF COX-2蛋白的表达及上清液PGE2水平,并呈剂量依赖性.结论 消退素D1能抑制LPS诱导的原代LF COX-2及PGE2的表达.     

人卵巢上皮癌细胞原代培养及细胞系BUPH:OVSC-1的建立

目的:为人卵巢上皮癌的研究提供更多体外研究模型,确立卵巢上皮癌原代培养的条件,建立细胞系.方法: 将25例卵巢上皮癌手术切除的肿瘤组织或腹水标本进行体外培养,比较不同组织培养方法的效果.对所建卵巢癌细胞系的形态学、染色体核型、生长增殖及裸鼠种植情况进行观察.结果: 建立一套人卵巢上皮癌原代培养方法,使其体外培养传代数扩展至10～15代.经原代培养得到一株人卵巢癌细胞系BUPH:OVSC-1,其形态学、染色体核型分析、接种致瘤性的观察结果表明,该细胞系符合人体恶性细胞特征.裸鼠种植瘤病理切片该细胞呈肉瘤样细胞形态,电镜及角蛋白免疫组化证实其为上皮起源.结论:应用改良的卵巢上皮癌原代培养方法能改善细胞的体外生存期.BUPH:OVSC-1是一株特殊的人卵巢癌细胞系,符合人卵巢肉瘤样癌细胞系的特征,可作为卵巢肉瘤样癌研究的实验模型.     

阳离子多聚物jetPEITM对原代培养的猪血管平滑肌细胞的转染效率研究

目的 研究转染试剂jetPEITM对原代培养的猪血管平滑肌细胞的转染效率.方法 原代培养小型猪胸主动脉血管平滑肌细胞,体外合成双链寡核苷酸,jetPEITM与寡核苷酸按不同的氨基与磷酸基的比例(N/P)混合转染细胞,采用流式细胞仪和共聚焦荧光扫描仪检测jetPEITM对寡核苷酸的转染效率及细胞内定位情况,MTT法检测jetPEITM的细胞毒性作用.结果 原代培养的猪血管平滑肌细胞jetPEITM转染率在N/P=10时可高达(90.89±2.23)%,转染底物主要分布在细胞浆内,核内转染效率极低,在N/P比值在5～10之间时,细胞毒性作用不高于20.00%.结论 在原代培养的猪的血管平滑肌细胞,jetPEITM可以高效运送寡核苷酸进入细胞浆内,细胞毒性作用低.     

原代培养大鼠肝细胞分离方法的比较研究

目的 探讨体外原代培养大鼠肝细胞的分离方法。方法 以Ｗｉｓｔａｒ大鼠做为肝细胞供体,分别采用直接分离法与胶原酶消化法分离获取肝细胞并原代培养;以台盼蓝染色法测细胞存活率,在位相关倒置显微镜下观察细胞形态变化,ＭＴＴ法测培养细胞活性,并检测不同时期培养上清液中白蛋白的含量。结果 直接分离法获取的肝细胞活性及功能欠佳,而胶原酶消化法所获取的肝细胞形态完整,贴壁良好、活性高、功能强。结论 经胶原酶消化分     

Caco-2细胞模型及其对黄酮类成分作用机制研究进展

Caco-2细胞模型作为ADME/Tox研究平台中肠吸收模型之一,已广泛用于药物动力学研究,可通过体外试验预测药物在体内的吸收和代谢,阐明药物在体内的吸收机制、毒性、药物吸收过程中的相互作用、药物的化学结构和体内转运关系以及药物代谢稳定性等。以黄酮类成分为代表,介绍Caco-2细胞模型在中药有效成分吸收代谢机制研究方面的应用进展。     

体外培养人牙周膜细胞方法的探讨

目的:研究如何提高体外培养人牙周膜细胞(hPDL)的成功率,为简便、快速地获得大量成活率高的hPDL膜细胞,建立体外细胞模型提供一定的实验方法.方法:利用3种不同方法(组织块法、酶消化组织块法、全牙消化法)进行牙周膜细胞的原代培养,用形态学、免疫细胞化学染色等方法鉴定细胞来源;通过生长曲线的测定研究体外细胞生长特性.结果:3种方法获得的细胞形态和生物学行为大致相同;波丝蛋白抗体染色阳性,角蛋白抗体染色阴性.组织块法培养的细胞同源性好,但初代培养时间长;全牙消化法的原代培养成功率高于其他2种方法.结论:通过对牙周膜细胞培养方法的改良,可以显著提高hPDL原代培养的成功率.     

肾近端小管细胞系在药物肾毒性评价中的应用

肾脏是药物毒副作用的主要靶器官,而肾近端小管拥有庞大的转运系统和丰富的生物转化酶,对外源性毒物的损害特别敏感,是研究药物肾毒性可靠的细胞模型.利用肾近端小管上皮细胞系在药物开发早期优化筛选先导化合物,并比较结构相似化合物的相对肾毒性,是近年来药物发现毒理学研究的重点和热点.本文就国内外常用的几株肾近端小管上皮细胞系的生理生化特点、常见检测终点和指标及其在药物研究开发中的应用作一简要综述.     

应用流式细胞仪研究培养肾小管细胞庆大霉素损伤及中药的防治

肾细胞培养是研究肾小管生理,病生及代谢调节的重要手段。我们建立了兔肾小管上皮细胞原代培养方法制作的体外庆大霉素(GM)损伤模型,采用流式细胞仪对其进行分析。观察了细胞分裂增殖指数(PI)、S期细胞敷、G_2M期细胞数变化及中药绞股蓝皂甙、AWS对GM肾毒性韵防治作用。肾小管上皮细胞培养及分离方法:将兔处死后无菌取肾,分离肾皮质,剪碎后移人80目钢网筛,研磨并用生理盐水冲洗于100目钢网筛上收集肾小管节段,离心后胰蛋白酶消化10min,中止消化后加入含10％小牛血清的RPM11640增养液,置于5％CO_2孵箱中培养、细胞贴壁后1天其外周开始长出细胞,6天左右细胞铺满培养瓶。取原氏培养第三天的细胞,倒去原培养液。实验分4组:(1)正常组即原代培养的肾小管细胞。(2)致伤组即暴露在含1mmol/L GM中的培养细胞。(3)绞股蓝皂甙组(GPS     

影响喉癌组织原代培养成功率因素的研究

目的研究不同组织分离方法、肿瘤TNM分期、细胞分化程度等因素对喉癌组织原代培养细胞生长率的影响。方法对17例喉癌组织分别应用组织块、胶原酶和机械分离法进行原代培养,观察以上3种组织分离法、肿瘤细胞分化程度以及TNM分期对喉癌原代培养细胞生长情况的影响,并用统计学分析其结果。结果组织块、胶原酶及机械分离法的细胞生长率分别为64.7%、58.8%和11.8%,其中组织块法和胶原酶法比较差异无统计学意义(P=1.000),而织块法和胶原酶法与机械分离法比较差异均有统计学意义(P=0.004和0.008)。鳞癌细胞高分化组细胞生长率为33.3%,中/低分化组为90.9%,2组比较差异有统计学意义(P=0.028)。结论细胞培养的生长率与肿瘤组织的分化程度和组织分离方法有关。在喉癌的原代培养中应尽量选取细胞分化程度差的标本并且选用组织块分离法进行培养。     

胃癌化疗体外药敏试验研究(附88例分析)

目的检测目前常用化疗药物对体外培养的原代胃癌细胞的敏感性.方法用改良MTT法对88例胃癌患者的新鲜标本进行体外肿瘤细胞原代培养和化疗药物敏感性检测,并对其结果进行比较.结果试验成功率为94.3%,以细胞抑制率30%为判断标准的14种化疗药物中,5-FU、MMC、PYM、VP-16和DDP具有较高的敏感性（P＜0.05）.以上5种药物之间比较,其敏感性差异无显著意义（P＞0.05）;肿瘤分化程度的高低与肿瘤药敏无明显关系.结论体外胃癌细胞原代培养及化疗药物敏感试验对指导临床医生选择敏感化疗药物开展个体化化疗具有指导作用.     

体外培养大鼠骨髓基质细胞生物学特性研究

目的:观察体外培养大鼠骨髓基质细胞生物学特性,为诱导骨髓基质细胞分化形成神经元及分化机制和移植治疗脑缺血大鼠的研究奠定基础.方法:取4周龄Wistar大鼠,全骨髓法体外培养骨髓基质细胞,利用倒置相差显微镜观察原代及不同传代细胞生长形态特点,并应用间接免疫荧光法鉴定原代及不同传代细胞表型.结果:培养的骨髓基质细胞第3代,细胞增殖能力已趋于稳定,骨髓基质细胞表面标志CD54、CD44阳性的细胞已占到95.18%、94.36%.造血干细胞表面标志CD14阳性的细胞已从原代的23.19%降低到2.37%.结论:传3代的细胞已适合于细胞诱导分化,可作为理想细胞移植治疗的细胞来源.     

人脑胶质瘤细胞的原代培养方法研究

目的探索人脑胶质瘤细胞原代培养的方法,成功地建立细胞模型,为临床和实验研究提供良好的实验模型。方法分别采用酶消化法和组织块培养法对16例人脑胶质瘤细胞进行原代培养,比较两种方法的培养效果;通过倒置相差显微镜观察细胞的形态学特点;通过生长曲线的测定研究体外培养细胞的生长特性。结果人脑胶质瘤细胞原代培养成功,并可传代。经组织块培养法成功率较低为43.8%;经酶消化法短期培养成功率为87.5%,明显高于组织块培养法。培养成功的细胞状态稳定,增殖活跃,有明显的对数生长期。结论用酶消化法进行人脑胶质瘤短期体外培养,成功率较高,适宜建立体外细胞培养模型。     

MTT比色法对40例原发性肝癌的化疗药物体外敏感试验研究

ＭＴＴ比色法对４０例原发性肝癌的化疗药物体外敏感试验研究王皓，王一，陈汉，吴孟超，丛文铭，张秀忠为探讨原发性肝癌对化疗药物敏感性的个体差异及抗药性规律，我们采用短期原代培养的肝癌细胞毒性试验对６种常用的化疗药物：阿霉素（ＡＤＭ）、丝裂霉素（ＭＭＣ）、...     

胎儿动脉导管、主动脉及肺动脉平滑肌细胞体外培养模型的建立

目的:建立胎儿动脉导管、主动脉及肺动脉平滑肌细胞体外培养模型.并了解它们的原代和继代细胞生长情况.方法:对平滑肌细胞传统的原代细胞贴块法培养进行了改进,并对胎儿动脉导管、主动脉及肺动脉平滑肌细胞的原代和继代细胞生长周期进行了观察.结果:改良贴块法比传统贴块法更容易原代培养平滑肌细胞,动脉导管的平滑肌细胞生长周期最长,其次是主动脉和肺动脉.结论:改良贴壁法培养平滑肌细胞有独创性,更适合于动脉导管平滑肌细胞的培养.     

三七总皂苷在抗肾纤维化细胞模型中剂量的研究

目的 研究三七总皂苷(PNS)在抗肾纤维化细胞模型中剂量选择.方法 原代培养大鼠肾小球系膜细胞(MC)作为细胞模型,用含有或者不含有胎牛血清的各浓度(0.05,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.6,3.2 mg/mL)三七总皂苷细胞培养刺激大鼠MC,MTT比色法观察其对细胞的增殖及毒性作用.结果 PNS浓度在0.1～0.6 mg/mL抑制大鼠MC细胞增殖(P<0.05),但对大鼠MC不具有细胞毒性作用(P>0.05),而PNS浓度≥0.8 mg/mL时具有细胞毒性作用(P<0.05),<0.1 mg/mL时对MC没有抑制增殖的作用.PNS浓度在0.1～3.2 mg/mL与大鼠MC增殖呈负相关(r=-0.838,P<0.01).结论 浓度0.1～0.6 mg/mL是PNS在抗肾纤维化细胞模型中理想剂量范围;在该范围内PNS抑制MC增殖的作用不是通过细胞毒性实现的.     

冬凌草甲素对急性白血病原代细胞的增殖抑制作用

目的研究冬凌草甲素对急性白血病原代细胞的增殖抑制作用。方法以人急性早幼粒细胞白血病(APL)患者的骨髓原代细胞为研究对象,以不同浓度的冬凌草甲素作用于体外培养的白血病细胞,MTT法检测细胞生长抑制率,应用流式细胞仪、台盼蓝染色及Hoechst33258荧光染色法观察细胞凋亡。结果冬凌草甲素体外可明显地抑制白血病原代细胞的增殖,并能诱导细胞发生凋亡,而且呈现出明显的量-效与时-效关系。结论冬凌草甲素能有效地抑制APL细胞的生长及诱导细胞发生凋亡,是一种潜在的抗白血病药物。