Egr1信号途径参与NDRG1表达调节的机制研究

目的:研究人宫颈癌细胞中早期生长反应基因1(Egr1)信号途径参与N-myc下游调节基因1(NDRG1)表达调节的机制。方法:以人宫颈癌细胞株SiHa为研究对象,利用siRNA干扰技术使Egr1基因沉默,用RT-PCR和W estern blot检测转染前后Egr1表达的变化。通过RT-PCR和W estern blot检测细胞在低氧条件下,以及转染siRNA-Egr1后在低氧或低氧模拟物(DFX)条件下,Egr1与NDRG1表达的变化。结果:siRNA能有效地抑制Egr1基因表达(P0.001)。低氧条件下,Egr1、NDRG1的蛋白水平均明显升高(P0.001)。转染siRNA-Egr1 48h后,细胞在低氧条件下作用1h,Egr1 mRNA表达显著下降(P0.05)。细胞转染siRNA-Egr1 48h后,在低氧及DFX条件下作用24h,结果显示DFX使NDRG1 mRNA的表达显著高于低氧条件(P0.05)。同时也显示siRNA-Egr1能够使NDRG1 mRNA水平明显减少(P0.05)。结论:体内环境因素如低氧、DFX等上调NDRG1基因的表达,通过Egr1信号途径参与NDRG1在宫颈癌细胞中表达的调节。     

趋化因子CXCL5在前列腺癌组织表达的研究

目的:研究趋化因子CXCL5在前列腺癌组织样本的表达。方法:免疫组织化学方法检测CXCL5在前列腺癌样本与良性前列腺增生样本的表达差异。结果:CXCL5在前列腺癌样本和良性前列腺增生样本的阳性表达率分别为78.3%(18/23)和47.4%(9/19),两者差异有统计学意义(P<0.05)。结论:CXCL5与其上游分子NDRG3可能共同参与前列腺癌的发展。     

小鼠雄激素受体真核表达载体的构建与鉴定

目的:克隆小鼠雄激素受体(androgen receptor,AR)基因的cDNA,构建AR真核表达载体,并在睾丸支持细胞TM4中进行表达和鉴定。方法:应用RT-PCR法从小鼠睾丸中扩增AR,将测序正确的PCR产物克隆至pcDNA3.1(-)真核表达载体中,再将载体以脂质体方式转染至TM4细胞系中,通过G418筛选稳定转染AR的TM4细胞株,以RT-PCR法和Western blotting法检测转染前后AR在TM4细胞系中的表达情况。结果:RT-PCR法和Western blotting法检测的结果显示,转染pcDNA3.1(-)/AR质粒的细胞中AR基因的表达水平显著高于转染pcDNA3.1(-)质粒的对照组。结论:成功构建了小鼠AR真核表达载体pcDNA3.1(-)/AR和稳定转染的TM4细胞系,为进一步研究AR在睾丸支持细胞中的作用及其分子机制建立了细胞模型。     

过表达NDRG1通过调控Wnt/β-catenin信号通路促进滋养层细胞上皮-间质转化

目的:探讨N-myc下游调节基因1(NDRG1)过表达对滋养层细胞上皮-间质转化(EMT)的影响以及对Wnt/β-catenin信号通路的作用。方法:采用携带NDRG1基因的慢病毒感染人胎盘滋养层细胞系HTR-8/SVneo,建立NDRG1基因稳定过表达的HTR-8/SVneo细胞株。qRT-PCR和Western blot法检测慢病毒感染后细胞中NDRG1基因mRNA和蛋白的表达水平,Transwell小室法观察细胞侵袭和迁移能力,免疫荧光实验检测β-catenin蛋白核转位情况,Western blot法分析EMT相关蛋白、Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白及基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和MMP-9等蛋白表达。结果:慢病毒介导NDRG1过表达后,HTR-8/SVneo细胞中NDRG1 mRNA和蛋白表达水平显著上调。NDRG1过表达可显著增强细胞的侵袭和迁移能力,并上调MMP-2、MMP-9、波形蛋白(Vimentin)、神经性钙黏附蛋白(N-cadherin)、β-catenin、Snail1和环氧化酶-2(COX-2)等蛋白的表达水平,下调上皮钙黏蛋白(E-cadherin)和糖原合成酶激酶3β(GSK3β)磷酸化水平,同时促进β-catenin蛋白由细胞质向细胞核转位。结论:NDRG1过表达可促进HTR-8/SVneo细胞EMT过程,提高细胞侵袭和迁移能力,其机制可能与激活Wnt/β-catenin信号通路转导相关。     

miR-199a在卵巢癌中表达下调及其对卵巢癌生物学功能的影响

目的:检测mi R-199a在上皮性卵巢癌组织中的表达水平以及在卵巢癌中参与的功能,初步探讨mi R-199a在卵巢癌发生、发展中的作用和机制。方法:通过实时定量逆转录聚合酶链反应(q RT-PCR)检测上皮性卵巢癌20例、良性上皮性卵巢肿瘤组织15例以及正常卵巢上皮细胞IOSE和1组具有不同侵袭能力的卵巢癌细胞株中mi R-199a的表达;构建mi R-199a的逆转录病毒质粒p MSCVpuro-mi R-199a并筛选稳定过表达mi R-199a的SKOV3细胞株;分别用CCK8和Transwell小室法检测过表达mi R-199a的SKOV3细胞在增殖、侵袭及迁移方面的改变。结果:mi R-199a在卵巢癌组的表达低于良性卵巢肿瘤组(P=0.001),mi R-199a在卵巢癌细胞中的表达低于正常卵巢上皮细胞IOSE(P<0.05),且在SKOV3中表达最低(P<0.01);与转染空载质粒SKOV3细胞相比,稳定转染p MSCVpuro-mi R-199a质粒的SKOV3细胞增殖、侵袭和迁移力均降低(P<0.000 1)。结论:mi R-199a在卵巢癌组织中表达降低,并在卵巢癌细胞增殖、侵袭及迁移过程中起抑癌基因的作用。     

可遗传性表达人乳头瘤病毒18型E6发夹状RNA干扰质粒对宫颈癌细胞生长特性的影响

目的:探讨稳定转染可遗传性表达HPV18E6shRNA质粒对HPV18阳性的宫颈癌HeLa细胞株生长特性的影响。方法:实验组为稳定转染表达HPV18E6shRNA的pE6-1shRNA质粒和含E6基因突变点的pE6-2shRNA质粒的宫颈癌Hela细胞株,对照组为稳定转染pSUPER空质粒和未转染质粒的宫颈癌HeLa细胞株。MTS测各组细胞的生长曲线,流式细胞仪检测各组细胞周期的变化和增殖指数;软琼脂细胞培养分析各组细胞集落形成能力。结果:MTS显示pE6-1shRNA组较pE6-2shRNA、空质粒pSUPER组及未转染组的HeLa细胞增殖率低,差异有显著性(P<0.05);流式细胞仪检测,pE6-1shRNA组G0-G1期细胞数较pE6-2shRNA组增加了12.5%,较未转染的HeLa细胞组增加了13·3%(均P<0.05);pE6-1shRNA组进入S期的细胞数较pE6-2shRNA组减少了9·4%,较未转染的HeLa细胞组减少了8.5%(均P<0.05),G2-M期细胞数在各组差异无显著性(P>0.05)。转染pE6-1shRNA组细胞增殖指数23.7%;而pE6-2shRNA组细胞增殖指数36.1%,未转染组细胞增殖指数36.9%。细胞软琼脂培养2周,pE6-1shRNA组的HeLa细胞的克隆形成率4.2%,较未转染组的HeLa细胞克隆形成率7.2%低(P<0·05,χ2=5.56),也低于转染pE6-2shRNA和pSUPER组(P>0.05)。结论:稳定转染可遗传性表达HPV18E6shRNA质粒的宫颈癌HeLa细胞,其细胞增殖周期和细胞生长受到抑制。     

稳定转染短发夹状RNA后子宫颈癌细胞中人乳头状瘤病毒18型E6基因表达的变化

目的探讨宫颈癌细胞株HeLa细胞稳定转染表达短发夹状RNA(shRNA)的质粒后,HeLa细胞中人乳头状瘤病毒18型E6基因(HPV18E6)表达的变化。方法实验组将本实验室前期构建的可遗传性表达HPV18E6shRNA的pE6-1shRNA质粒和含E6基因突变点的pE6-2shRNA质粒分别转染HeLa细胞,对照组以空质粒pSUPER和不加质粒的脂质体分别转染HeLa细胞。稳定转染后,氨基糖苷抗生素(G418)筛选阳性细胞克隆,RT-PCR技术和免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接(SP)法分别检测HeLa细胞中HPV18E6mRNA和蛋白表达的变化。结果稳定转染后,G418筛选,实验组HeLa细胞有新的阳性细胞克隆形成,而对照组HeLa细胞最终全部死亡。实验组转染pE6-1shRNA质粒的HeLa细胞中HPV18E6mRNA表达水平为0·76±0·28,明显低于对照组转染脂质体者(1·14±0·45)和转染pSUPER质粒者(1·12±0·23,P<0·05);HeLa细胞中HPV18E6蛋白阳性表达强度较对照组转染脂质体者弱。实验组转染pE6-2shRNA质粒的HeLa细胞中HPV18E6mRNA和蛋白表达水平分别与对照组比较,差异均无统计学意义(P>0·05)。结论稳定转染表达HPV18E6shRNA的质粒后,宫颈癌细胞中HPV18E6mRNA和蛋白表达明显受到抑制。     

雄激素对前列腺中miR-204表达调控的研究

目的:探讨雄激素对前列腺癌细胞和组织中miR-204表达的影响。方法:采用荧光定量PCR方法检测前列腺癌细胞株(LNCaP、22RV1)和正常前列腺间质细胞(WPMY-1)在雄激素类似物R1881刺激下以及去势后不同时间的小鼠前列腺组织中miR-204表达量的变化。结果:在前列腺癌细胞LNCaP、22RV1中hsa-miR-204的表达量在雄激素刺激后下降了近2倍,而在去势小鼠的前列腺组织中,mmu-miR-204表达量增加了1.8倍。结论:miR-204受雄激素的负调控。     

子宫颈癌SiHa细胞中NDRG1基因的表达及其与肿瘤侵袭转移的关系

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤,其发病率及病死率居妇科恶性肿瘤的第2位,仅次于乳腺癌,严重威胁妇女的身体健康.近年来发现,人类N-myc下游调节基因1(NDRG1)与肿瘤侵袭转移密切相关,普遍分布于人体多种组织中,包括生殖、泌尿、消化、免疫系统,具有调节肿瘤细胞生长、分化、应激反应及侵袭转移的作用.NDRG1基因参与多种肿瘤的发生、发展,如乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、脑肿瘤、黑色素瘤等[1].本研究使用基因转染技术增加NDRG1基因在宫颈癌细胞中的表达,探讨NDRG1基因对宫颈癌细胞的生长及侵袭转移的影响.     

EGFR过表达降低人子宫内膜癌细胞孕激素敏感性的研究

目的:检测表皮生长因子受体(EGFR)基因在子宫内膜癌孕激素敏感细胞株Ishikawa及孕激素不敏感细胞株KLE的表达,探讨EGFR基因过表达对人子宫内膜癌细胞孕激素敏感性的影响。方法:实时定量PCR法和蛋白印迹法检测Ishikawa和KLE细胞中EGFR及PR-BmRNA和蛋白的表达。将EGFR全长cDNA真核表达质粒在脂质体介导下转染至Ishikawa细胞,同时以转染空载体和未转染的Ishikawa细胞为对照,分别应用实时定量PCR检测各组细胞EGFR、PR-BmRNA表达的变化,应用蛋白印迹法检测各组细胞EGFR、PR-B蛋白表达的变化;CCK-8法观察转染EGFR基因后Ishikawa细胞对孕激素敏感性的变化。结果:(1)Ishikawa细胞中,EGFRmRNA和蛋白的表达明显低于KLE细胞(P<0.001),而PR-BmRNA和蛋白的表达则显著高于KLE细胞(P<0.001);(2)稳定转染EGFR基因后,Ishikawa细胞中EGFRmRNA和蛋白的表达水平明显高于转染空载体和未转染的Ishikawa细胞(P<0.001),而PR-BmRNA和蛋白的表达水平则显著降低;(3)10-8、10-7、10-6、10-5mol/L的MPA对未转染和转染空载体的Ishikawa细胞的抑制作用显著(P<0.05),但对稳定过表达EGFR的Ishikawa细胞无明显抑制作用(P>0.05)。结论:转染EGFR基因能有效提高Ishikawa细胞内EGFR基因的表达,但可下调PR-B基因的表达使Ishikawa细胞对MPA不敏感。     

Edg4基因小分子干扰RNA载体的构建及其对卵巢上皮性癌细胞的沉默效应

目的构建针对Edg4基因的小分子干扰RNA（siRNA）载体,初步观察其对卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞的沉默效应。方法利用软件分析、设计针对人Edg4 mRNA的siRNA靶序列,合成发夹样DNA序列;退火成双链,克隆至真核表达载体pRNAT—U6．1质粒上,经PCR技术鉴定及DNA双向测序证实其序列无误后,用脂质体包裹并转染卵巢癌细胞系SKOV3细胞,用荧光显微镜初步观察其在SKOV3细胞中的转染率。采用实时荧光定量荧光定量PCR技术检测转染前后SKOV3细胞中Edg4 mRNA的表达,生化法测定转染前后SKOV3细胞上清液中溶血磷脂酸（LPA）含量的变化,流式细胞术检测转染后SKOV3细胞的凋亡率。结果经PCR技术鉴定及DNA双向测序证实重组真核表达载体的序列无误,并将此命名为pRNAT—U6．1—siEdg4。荧光显微镜下观察,转染后SKOV3细胞内有明显绿色荧光信号,转染率为64％;实时荧光定量PCR技术检测显示,转染后SKOV3细胞的Edg4 mRNA表达水平（0．05±0．01）明显低于转染前（0．29±0．04,P〈0．05）;SKOV3细胞上清液中LPA的含量,转染后明显低于转染前[分别为（3．0±1．0）、（7．5±2．2）μmol／L;P〈0．05];流式细胞仪检测显示,转染后SKOV3细胞的凋亡率明显高于转染前（分别为53．38％、0．51％;P〈0．05）。结论本研究成功构建了针对人Edg4基因的siRNA真核表达载体,并能较高效转染SKOV3细胞,转染后能明显抑制SKOV3细胞中Edg4 mRNA的表达,诱导卵巢癌细胞凋亡。     

抗人血管内皮生长因子发夹状核酶基因抑制卵巢癌细胞血管内皮生长因子表达

目的 :研究抗血管内皮生长因子发夹状核酶基因对人卵巢癌细胞血管内皮生长因子 (VEGF)表达的抑制作用 ,探讨卵巢癌基因治疗的新途径。方法 :人卵巢癌细胞SKOV3高表达VEGF ,将抗血管内皮生长因子发夹状核酶基因真核表达载体 (pcDNA3 RZ)转染人卵巢癌细胞SKOV3,经G4 18筛选获得阳性细胞克隆 ,RNA斑点杂交检测核酶基因是否在细胞中表达。采用免疫组化、间接免疫荧光、激光共聚焦显微镜荧光定量法及流式细胞仪结合间接免疫荧光检测转染前后细胞VEGF的表达情况。结果 :转染pcDNA3 RZ组细胞VEGF表达明显降低。结论 :抗人VEGF发夹状核酶基因真核表达载体可有效抑制卵巢癌细胞SKOV3中VEGF的表达 ,有望成为治疗卵巢癌的一种新方法。     

Study of the inhibitory effects of retrovirus-mediated p16 gene on human ovarian cancer cell line

OBJECTIVE: To study the inhibitory effects of retro-virus-mediated p16 gene on human ovarian cancer cell line CAOV3. METHODS: Recombinant eukaryotic expression vector pDOR-p16 containing exogenous human wt-p16 cDNA and vector with neomycin resistance gene only were introduced by lipofectamine-mediated gene transfection into CAOV3 cell line which does not express p16 endogenously. By using revert-polymerase chain reaction amplification, mRNA in situ hybridization and immunocytochemistry, the clones obtained were detected for their efficiency of transfection and effects of vector expression and observed for their biologic behavior. RESULTS: Exogenous wt-p16 had successfully been transferred into CAVO3 cells and obtained permanent expression. The growth rate of these transfected CAOV3 cells in regular medium and soft agar was inhibited, and the tumorigenicity in nude mice showed that two in four mice failed to form tumor and the others suffered from tumor later than contrast group by 7 to 14 days. The percentage of phase G1 cells increased and that of phase S cells decreased by analysing cell cycle. The ultrastructural changes of the cells were observed under electron microscope, revealing necrosis and growth retardation. CONCLUSIONS: p16 gene played an important role in generation and development of ovarian carcinoma. This study might provide the experimental evidence for the gene therapy in human ovarian cancer.     

外源性Rb基因对卵巢癌细胞株生长的抑制作用

目的 探讨外源性Ｒｂ基因对卵巢细胞生长的抑制作用，为卵巢癌的基因治疗提供实验依据，方法 通过腺病毒介导的Ｒｂ基因，于体外转染卵巢癌细胞株ＣＡＯＶ３。应用免疫组织化学，ＤＮＡ琼脂糖电泳等方法，检测外源性Ｒｂ基因的导入及其表达。通过四甲基偶氮唑蓝比色法及流式细胞术等，观察转染Ｒｂ基因的ＣＡＯＶ３细胞的生长情况。结果 重组腺病毒载体有可效于体外转染卵巢癌细胞株ＣＡＯＶ３；转染外源性Ｒｂ基因后，ＣＡＯＶ３     

KiSS-1基因对滋养细胞生物学行为影响的实验研究

目的 :探讨KiSS 1基因对滋养细胞生物学行为的直接影响 ,进一步证实妊娠高血压综合征患者胎盘“浅着床”与滋养细胞中肿瘤转移抑制基因KiSS 1表达增高有关。方法 :含有人KiSS 1基因全长cDNA的重组真核表达载体pcDNA3 KiSS 1经酶切和测序鉴定正确后 ,转染滋养细胞株JAR ,观察其KiSS 1mRNA表达、细胞生长和增殖能力和细胞侵袭力的变化。结果 :pcDNA3 KiSS 1成功转染JAR细胞 ,KiSS 1mRNA表达阳性 ,而亲本JAR细胞为阴性。转染目的基因后细胞生长曲线、软琼脂克隆形成率等与未转染之细胞无差异 ,但细胞侵袭能力明显下降 ,穿透Matrigel膜细胞数明显少于未转染组。结论 :KiSS 1基因对滋养细胞的生长、增殖能力无影响 ,但抑制其侵袭能力 ,这可能是导致妊高征“浅着床”的原因     

人HoxA10基因真核表达载体构建和表达产物的鉴定

目的:克隆人子宫内膜容受性标志分子HoxA10基因的cDNA,转入真核细胞载体,并在293T细胞中进行表达和鉴定。方法:应用RT-PCR法从人子宫内膜组织中扩增HoxA10基因的cDNA编码区序列,将PCR产物克隆至pCMV-HA真核表达载体中,测序鉴定该载体。以LipofectamineTM2000将该载体转染入293T细胞中,Western blotting检测HoxA10蛋白的表达。结果:PCR扩增出的人HoxA10基因cDNA正确克隆到了pCMV-HA载体,成功构建了pCMV-HA-HoxA10重组载体;将其转染入293T细胞,用HoxA10和HA抗体进行Western blotting,均检测到了融合蛋白的表达。结论:携带有HA蛋白标签的人HoxA10基因的真核表达载体pCMV-HA-HoxA10克隆及表达成功,为进一步研究HoxA10与其它蛋白质的相互作用以及建立HoxA10的荧光素酶报告基因分析系统奠定了基础。     

逆转录病毒介导的p16基因对人卵巢癌细胞系生长抑制作用的研究

目的研究逆转录病毒介导的ｐ１６基因对人卵巢癌细胞系ＣＡＯＶ３生长与致瘤性的抑制作用。方法应用脂质体介导法,将外源性野生型ｐ１６基因转染不表达ｐ１６的人卵巢癌细胞系ＣＡＯＶ３,对转染后细胞ＤＮＡ、ＲＮＡ和蛋白进行分析并观察其生物学行为变化。结果外源性野生型ｐ１６基因已整合于细胞并获稳定表达,表达有外源ｐ１６基因的细胞生长速度、集落形成率及裸鼠致瘤性均有部分抑制。细胞周期分析可见Ｇ１期增加,Ｓ期下降。电镜下超微结构出现生长抑制特征。结论ｐ１６基因可明显抑制癌细胞生长,在卵巢癌发生、发展的过程中起重要作用。