早孕期外周血及蜕膜淋巴细胞CD28/CTLA-4的表达

目的：探讨人早孕期外周血及蜕膜淋巴细胞协同刺激分子表达水平在母．胎免疫调节中的作用。方法：以15例正常育龄妇女黄体期外周血为对照，应用流式细胞仪分析15例正常人早孕期外周血及蜕膜淋巴细胞CD28和CTLA-4的表达水平。结果：各组淋巴细胞几乎不表达表面CTLA-4分子；而表达细胞内CTLA-4分子（CTLA-4i）。蜕膜组织淋巴细胞CTLA-4i^＋／CD28^＋的比例显著高于早孕期及黄体期外周血。早孕期与黄体期外周CTLA-4i^＋／CD28^＋的百分率比较无显著性差异。结论：母胎界面局部高表达细胞内CTLA-4在母-胎免疫耐受中起重要作用。     

肾移植患者手术前后外周血CD4＋T淋巴细胞IL-18Rα的表达及意义

目的：探讨外周血CD4^＋T淋巴细胞IL-18Rα表达在肾移植急性排斥反应中的作用及临床意义。方法：采用分别检测肾移植患者手术前、手术后1w及2w外周血CD4^＋T淋巴细胞IL-18Rα表达量，并进行比较分析。结果：肾移植患者手术前外周血CD4^＋T淋巴细胞IL-18Rα表达量明显高于正常对照组（P〈0．01）。急性排斥组手术后1w、2w与手术前比较外周血CD4^＋T淋巴细胞IL-18Rα表达量明显增加（P〈0．01）。稳定组手术后1w与手术前比较外周血CD4^＋T淋巴细胞IL-18Rα表达量明显增加（P〈0．01），手术后2w则下降至手术前水平（P〉0．05）。结论：肾移植患者手术前、手术后存在Th1／Th2失衡，表现为Th1优势应答。肾移植手术前后监测外周血CD4^＋T淋巴细胞IL-18Rα表达量变化对于判断急性排斥反应有一定临床意义。     

人外周血耐受性树突状细胞的诱导培养及其DC-STAMP的表达研究

目的:诱导培养人外周血耐受性树突状细胞(TolDCs)并动态观察TolDCs诱导过程树突状细胞-特异性跨膜蛋白(DC-STAMP) mRNA的表达水平.方法:(1)免疫磁珠分选法获得人外周血CD14+单核细胞,采用细胞因子GM-CSF、白介素4(IL-4)、地塞米松和LPS联合培养诱导TolDCs;(2)观察培养细胞的形态变化,流式细胞术检测CD83、CD86和CD14的表达,并将培养的细胞与T淋巴细胞共培养观察T淋巴细胞增殖反应;(3)采用实时定量PCR对TolDCs诱导培养过程中DC-STAMP mRNA表达水平进行动态观察.结果:(1) CD14+单核细胞GM-CSF、IL-4、脂多糖诱导培养后胞体变大,出现树枝状突起,为典型的成熟DCs形态,加地塞米松诱导培养后胞体亦变大,但未见明显树枝状突起,缺乏典型的成熟DCs形态;(2)CD14+单核细胞经GM-CSF、IL-4培养后使CD83和CD86表达上调,CD14表达下调,加Dex联合诱导培养后DCs表面CD83、CD86表达下调,CD14表达上调,与T淋巴细胞共培养后增殖反应明显减弱,显示TolDCs的免疫表型和功能特性;(3) CD14+单核细胞经GM-CSF、IL-4培养后DC-STAMP mRNA的表达水平随培养时间延长而降低,加入地塞米松联合诱导后表达水平明显增加.结论:人外周血CD14+单核细胞采用GM-CSF、IL-4和地塞米松联合培养可诱导TolDCs生成,DC-STAMP可能与DCs的致耐受功能有关.     

脐血CD34+细胞体外定向诱导分化为T淋巴细胞的实验研究

目的：建立利用人造血干／祖细胞体外定向诱导分化为T淋巴细胞的方法，为研究T细胞生物学特性及细胞免疫提供技术平台。方法：MACS方法分离人脐带CD34^ 细胞接种到人胎儿胸腺基质单层细胞上，IMDM液体培养基含20％人AB血清并加入FL、IL-12、IL-7和IL-2细胞因子组合，于培养7、14、21、28、35、42天取非贴壁细胞利用流式细胞仪对细胞表型进行检测，并进行细胞形态学分析。结果：2周后，CD4^ CD8^ 非成熟T淋巴细胞占细胞总数的0．3％-13．3％，4-5周CD4^ CD8^ T淋巴细胞达到高峰占16．6％-26．5％，且CD3^ CD4^ CD8^ 和CD3^ CD4^-CD8^ T淋巴细胞逐渐增多，6周后达26．5％～64．9％和11．6％-38．9％。培养成熟的T淋巴细胞经PHA IL-2刺激后瑞氏染色鉴定可见大原始淋巴细胞存在。结论：利用人脐血CD34^ 在体外人胎儿胸腺基质单层细胞上加FL、IL-12、IL-7和IL-2细胞因子组合条件下，可诱导分化出T淋巴细胞，并且培养的T细胞对有丝分裂素刺激有增殖反应。     

SLE患者外周血淋巴细胞凋亡异常及血清中IL-10的影响

目的：研究SLE患者外周血单个核细胞(PBMCs)中淋巴细胞亚群的凋亡特点。方法：采用三色荧光流式细胞术检测CD3、CD4、CD8、CD19细胞亚群的早期凋亡；ELISA法检测PBMCs培养上清中的sFas、sFasL；实时荧光半定量RT-PCR方法检测细胞内FasmRNA的表达水平。结果：SLE患者PBMCs中CD3^ 细胞凋亡明显增多；CD4^ 和CD8^ 细胞亚群凋亡均有明显增加，但以CD4^ 细胞凋亡增多更为明显；相应地，其PBMCs中CD4^ 、CD8^ 细胞百分率下降，CD4／CD8比值降低。SLE患者血清可诱导CD3^ 、CD4^ 、CD8^ T细胞亚群凋亡增多，sFas、sFasL水平增高及Fas mRNA表达增加；抗-IL-10抗体则可中和SLE血清的上述作用。结论：SLE患者体内T细胞凋亡增多，以CD4^ T细胞凋亡增加更为显著，导致CD4／CD8比值下降；SLE血清中高水平的IL-10可能通过诱导Fas、FasL表达增高而促进T细胞凋亡的发生。     

卵巢癌细胞培养上清诱导CD4+CD25-T细胞分化为CD4+CD25+调节性T细胞

目的研究卵巢癌细胞培养上清液是否能诱导外周血CD4^＋CD25^- T细胞转变为CD4^＋CD25^＋调节性T细胞。方法将外周血CD4^＋CD25^- T细胞分离后，对照组用CD3和CD28单抗活化，实验组在对照基础上加用卵巢癌细胞株SKOV3培养上清，72h后分离各组的CD25^＋和CD25^-T细胞，溴化脱氧尿嘧啶掺入标记法测定增殖能力及对静息的自体同源CD4^＋CD25^- T细胞的增殖抑制能力，流式细胞仪测定细胞糖皮质激素诱发型TNF受体（glucocorticoid-induced TNFR,GITR）与CTLA-4分子的表达，RT-PCR检测细胞卿mRNA的表达。结果与对照组相反，实验组的CD4^＋CD25^＋T细胞具有免疫抑制功能，自身增殖能力下降，GITR和CTLA-4分子的表达和CD4^＋CD25^＋调节性T细胞相似，并被诱导表达转录因子Foxp3 mRNA。结论卵巢癌细胞分泌的可溶性物质能诱导外周血CD4^＋CD25^-T细胞转化为CD4^＋CD25^＋调节性T细胞。     

重肌灵片治疗重症肌无力的免疫调节机理研究

目的：探讨重肌灵片的免疫调节机制。方法：采用正常小鼠、免疫抑制模型小鼠和EAMG大鼠模型观察重肌灵片的免疫调节作用。结果：重肌灵片增强ConA或LPS诱导的正常小鼠及免疫抑制模型小鼠T、B细胞的增殖，促进1L-2分泌；能对抗ConA诱导的EAMG大鼠淋巴细胞增殖的降低；但抑制AChR诱导的淋巴细胞增殖及IFN-γ、IL-4mRNA的表达；此外，能显著促进EAMG大鼠CD4^＋T淋巴细胞的凋亡。结论：重肌灵片增强正常小鼠、免疫抑制小鼠和EAMG大鼠的免疫功能，但抑制AChR诱导的特异性的T细胞增殖及IFN-γ、IL4mRNA的表达，该作用可能是通过诱导AChR特异性的CD4^＋T细胞凋亡实现的。     

HIV Tat蛋白增加CD4+ T淋巴细胞bcl-2表达并抑制TRAIL诱导的细胞凋亡

目的探讨HIV Tat蛋白对CD4^＋ T淋巴细胞bcl-2表达的影响，并探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）与经HIV Tat蛋白刺激后的CD4^＋ T淋巴细胞凋亡的相互关系。方法用Western blot方法测定经HIV Tat蛋白刺激后，CD4＋ T淋巴细胞表达bcl-2的水平，以λ-氨基放线菌素D（7-AAD）和AnnexinV染色方法测定CD4＋ T淋巴细胞的凋亡。结果HIV Tat蛋白能明显增加CD4＋ T淋巴细胞bcl-2的表达，以100ng/ml为最佳浓度；7-AAD染色结果表明100ng/ml重组TRAIL能诱导53．85％±2．63％的CD4^＋ T淋巴细胞发生凋亡，如CD4^＋ T淋巴细胞经HIV Tat蛋白刺激后，则仅有16．04％±5．26％的细胞发生凋亡，此作用能被多克隆抗-Tat蛋白抗体抑制。Annexin V染色取得了同样的结果。结论经HIV Tat蛋白刺激后CD4^＋ T淋巴细胞bcl-2的表达明显增加，并能抑制由重组TRAIL诱导的细胞凋亡，提示HIV Tat蛋白是导致HIV在CD4^＋ T淋巴细胞内持续感染的重要调节蛋白，在HIV感染中起十分重要作用。     

补肾宁心方对鼠成骨细胞协同刺激分子表达的升调节作用

目的：探讨补肾宁心方药物血清对成骨细胞（OB）及CD4^＋T细胞协同刺激分子表达的调控作用。方法：颅骨酶解法培养OB，体外模拟雌激素撤退；MACS法分离CD4^＋T；将OB或CD4^＋T分别予以20％对照鼠血清、E2及20％中药血清培养并以LPS刺激，流式细胞术分析OB表面CD80、CD86以及CD4^＋T细胞表面CD28、CTLA-4的表达。结果：E2及中药血清组OB表面CD80、CD86的表达显著增加（P〈0．01）；CsA可降低对照鼠血清组及中药血清组OB表面CD80、CD86的表达（P〈0．01）；各组CD4^＋T细胞CD28和CTLA4的表达无显著改变（P〉0．05）。结论：补肾宁心方可上调OB协同刺激分子CD80、CD86表达；该作用可被CsA阻滞；而对T细胞CD28／CTLA-4表达无显著影响，其免疫学意义有待进一步研究：     

CD86对CD8+T细胞分化的影响

目的：探讨CD86(B7-2)对CD8^ T细胞分化的影响。方法：用限制性内切酶Xho Ⅰ酶切质粒pCDM8得到CD86基因，并将其插入pCDNA3，用BamH Ⅰ酶切鉴定。用脂质体法介导pCDNA3-CD86真核表达载体转染人肝癌细胞株HMCT／21，600μg/ml G418筛选，稳定且高表达CD86的抗性克隆用流式细胞仪进行鉴定。从健康志愿者血中分离外周血单个核细胞(PB-MC)，使PBMC与靶细胞之比为20：1，共同培养48h后，用流式细胞仪检测CD3^ T细胞内IL-4和IFN-γ的表达率。结果：成功构建pCDNA3-CD86真核表达载体；CD86在HMC7721-CD86细胞中的表达率为30．8％，而在HMC7721细胞中的表达率为0．98％；健康志愿者CD3^ T细胞内IL-4和IFN-γ的表达率分别为1．92％和24．4％；PBMC与靶细胞共同培养48h后，无论是否用IFN-α刺激，IL-4，IFN-γ的阳性比值在HMC7721-CD86转染组均大于1，而在HMC7721未转染组均小于1。结论：在细胞培养中，CD86可诱导CD8^ T细胞活化，并向Tc2表型转化。     

IL-27诱导原发性胆汁性肝硬化患者CD4+T细胞增殖分化作用机制研究

目的 探讨IL-27对原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC)患者外周血CD4+T细胞的增殖分化作用及其相关免疫学机制.方法 收集PBC患者、慢性乙肝患者(choronic hepatitis B,CHB)、健康体检者(health controls,HCs)外周血,磁珠分离CD4+T细胞.IL-27体外作用后,CCK-8测定细胞增殖情况,ELISA法检测细胞因子,定量PCR分析T-bet和GATA3基因表达情况,免疫印迹测定p-STAT-1和p-STAT-3的表达.结果 IL-27作用后,PBC组、CHB组和HCs组CD4+T细胞增殖能力均显著增强,PBC组CD4+T细胞增殖能力强于CHB和HCs组,差异有统计学意义(P＜0.001),同时PBC组细胞培养液中IL-2和IFN-γ在IL-27作用后较CHB和正常对照组均显著增高(P＜0.001),IL-10表达无明显变化.未经IL-27诱导情况下,PBC组T-bet表达高于CHB组(P=0.007),IL-27诱导后PBC组CD4+T淋巴细胞T-bet基因表达显著增加,同时对GATA3具有抑制作用,作用前后差异有统计学意义(P＜0.001),CHB组作用前后无显著变化(P=0.3).免疫印迹测定p-STAT-1、p-STAT-3发现,正常情况下各研究组均不表达p-STAT-1、p-STAT-3,IL-27作用后,表达明显升高,其中PBC组升高尤为明显.结论 IL-27可以诱导PBC患者CD4+T细胞增殖,并通过活化p-STAT-1、p-STAT-3信号通路,诱导CD4+T细胞向Th1分化,同时分泌相关细胞因子,可能在PBC早期免疫炎症反应过程中具有重要作用.     

Phenotypic characterization of regulatory T cells in the human decidua

Pregnancy is a unique situation for the maternal immune system. We have studied and identified a CD4+CD25+ regulatory T (Treg) cell population isolated from the human decidua. This mucosal surface in the uterus is in direct contact with semiallogenic fetal cells. We observed that about 14% of the decidual CD4+ T cells have the CD4+CD25+ phenotype. The decidual CD4+CD25+ T cells expressed high frequency of intracellular CTLA-4 (CTLA-4i). The majority of CD4+CD25+CTLA-4i+ cells were also positive for GITR and OX40, typical markers for human Treg cells. The frequency of CD4+CD25+ T cells in the peripheral blood from pregnant women was found to be increased during the first and second trimester of gestation when compared to nonpregnant controls. Being an important molecule for Treg cells, the role of CTLA-4 in the regulation of indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) expression was also examined. The stimulation with CTLA-4Ig did not increase IDO mRNA expression in CD14+ cells from pregnant women, while IFN-gamma was observed to up-regulate IDO expression. The presence of Treg cells in the human decidua suggests that these cells are important in protecting the fetus from alloreactive immune responses at the maternal-fetal interface.     

Interaction of IL-1 beta, IL-6 and tumour necrosis factor-alpha (TNF-alpha) in human T cells activated by murine antigens.

We used a mixed leucocyte culture between human T cells and irradiated murine splenocytes which allowed us to distinguish between cytokine production from the responder and stimulator cells by the use of species-specific assays for mRNA up-regulation. Using this model of T cell activation by antigen, we studied the effects of human antigen-presenting cell-derived cytokines IL-1 beta, IL-6 and TNF-alpha on the activation of human T cell subsets. We show in this system that exogenously added IL-1 beta, IL-6 and TNF-alpha induces IL-2 receptor (R) up-regulation and IL-2 production, and proliferation by both CD4+ and CD8+ cells. The addition of IL-1 beta induces IL-6 mRNA, and anti-IL-1 antibodies or an IL-1R antagonist protein completely suppresses IL-6 and TNF-alpha supported proliferation. Similarly, addition of IL-6 or TNF-alpha induces up-regulation of IL-1 beta mRNA. However, anti-IL-6 and anti-IL-6R antibodies only partially block proliferation supported by IL-1 beta. These findings suggest that IL-6 and TNF-alpha will induce IL-2R up-regulation/IL-2 secretion via the induction of IL-1 beta production.