黑暗链霉菌原生质体融合

报道了黑暗链霉菌原生质体制备和融合的方法。将一原养型亲株原生质体经紫外线灭活2分钟,与另一苯丙氨酸缺陷型突变株原生质体等量混合,40％PEG处理,32℃保温3分钟,获得了重组后代,经分析,融合子的代谢产物中次组分的含量有所降低。     

单组分妥布霉素产生菌的选育

目的 提高妥布霉素产生菌的发酵单位。方法 以黑暗链霉菌UVS－51为出发菌株，采用UV和NTG为诱变剂，结合耐受妥布霉素，运用固体循环诱变筛选高产菌株。结果 获得两株高产稳定变株NS－81和NT－26，这两株菌的授瓶发酵效价分别比出发菌株提高53％和77％。经薄层层析检验，该两变株的产物仍为单一的氨甲酰妥布霉素。结论 出发菌株经UV和NTG诱变处理后结合耐自身代谢物的驯育，正变率显著提高。通过引入循环诱变筛选的思路，大大缩短的实验周期有交待 提高了诱变育种的工作效率，能在较短时间内选育到理想变株，因此，循环诱变筛选法是一种较好的选育方法。     

采用混菌生检方法作妥布霉素产生菌诱变预筛选

以对妥布霉素和卡那霉素高度耐药而对阿泊拉霉素敏感的金葡萄菌１１－Ｒ７和对３种抗生素都敏感的枯草杆菌６３５０１为检定菌，建立了能同时检测尼拉霉素复合物总效价和组分相对含量的预筛选方法。并据此比较了不同处理条件对黑暗链霉素菌的诱变效果，亚硝基胍ｐＨ８处理优于亚硝基胍ｐＨ６处理和紫外线照射。孢子悬液应及时用于筛选，以免放置过程中性状的不利变化。     

黑暗链霉菌中安普霉素生物合成的阻断研究

以黑暗链霉菌Tt-49基因组为模板,利用PCR方法,扩增安普霉素生物合成关键基因aprH～M的上、下游序列,作为同源交换臂,并以温敏复制型质粒pKC1139为基础,构建用于阻断黑暗链霉菌Tt-49中安普霉素生物合成的重组质粒pHM106.质粒经接合转移进入黑暗链霉菌Tt-49,并筛选得到发生同源双交换工程菌,命名为黑暗链霉菌HM106.通过PCR鉴定,证明工程菌HM106中的aprH～M被tetr替换.对工程菌HM106进行发酵产物分析,结果是其发酵效价下降明显,仅为出发菌株的40％左右.采用薄层层析(TLC)对其组分分析,其安普霉素组分消失,因此,初步判断已成功阻断安普霉素的生物合成.     

氨甲酰-妥布霉素产生菌的高产菌株筛选

以黑暗链霉菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｎｅｂｒａｒｉｕｓ１６３为出发菌株,应用磁场、磁场复合吖啶橙、耐受氨甲酰 妥布霉素、磁场复合耐受氨甲酰 妥布霉素筛选得到５株高产菌株,经摇瓶发酵复筛后表明,其总效价与氨甲酰 妥布霉素均比出发菌株提高了２５％以上     

核糖霉素高产菌株核苷链霉菌筛选

以核苷链霉菌09-15为出发菌株,采用氮离子束注入、甲基磺酸乙酯、紫外线诱变,耐抗生素的筛选等手段育种,以期获得高产菌株.测定了09-15菌对8种抗生素的敏感性,并讨论了菌株对自身代谢产物低耐受性的原因.比较了多种方法的诱变效应,氮离子束注入的诱变效应好,正变率高;紫外线正变率低.经过多种方法复合处理,获得St-150菌株,摇瓶发酵单位比亲株09-15提高20%,发酵液的杂质含量明显降低,并在20吨发酵罐得到验证.     

妥布霉素发酵中的二次生长

黑暗链霉菌产生次级代谢产物妥布霉素的过程与供氧条件密切相关。通过对常规发酵的溶氧和残糖变化规律研究发现发酵后期有菌体的二次生长现象,影响了妥布霉素的分泌。采用在发酵后期降低转速的方法抑制发酵过程中黑暗链霉菌的二次生长,延长了妥布霉素的分泌期,使最终效从比常规发酵提高了27%。     

黑暗链霉菌安普霉素生物合成基因aprG的克隆和功能研究

从安普霉素产生菌S．tenebrarius H6总DNA中已克隆得到8．2kb的安普霉素抗性基因连锁片段。对距离抗性基因下游4．5kb的SacI-Sau3AI片段进行测序分析，发现了一个新的891bp开放阅读框架。推测其编码为296个氨基酸的蛋白质。经BLASTX程序分析，没有发现与之同源的基因，是一个新基因，该基因命名为aprG。构建基因阻断穿梭载体pSPU58，经接合转移导入S．tenebrarius H6，筛选单交换阻断变株，并用Southern blot验证阻断变株的aprG已经被破坏。经发酵分析，阻断变株不再合成安普霉素，表明aprG与安普霉素生物合成直接相关。     

核糖霉素产生菌核苷链霉菌耐核糖霉素高产菌株的选育

耐高浓度自身代谢产物的突变株,可能是消除反馈调节突变型或称反馈抗性突变型。抗生素产生菌通过直接筛选法获得耐高浓度自身代谢产物的突变型的报道很多,如链霉素产生菌、紫霉素产生菌、链黑菌素产生菌、Aurodox产生菌、Hygromycin产生菌等,本文报道核糖霉素产生菌核苷链霉菌(Streptomyces ribosidificus)3719-75-D318耐核糖霉素高产菌株的筛选和初步结果。     

利用基因工程技术选育氨甲酰妥布霉素高含量菌种

目的以产生安普霉素、氨甲酰妥布霉素和氨甲酰卡那霉素3个组分的黑暗链霉菌为出发菌株,利用基因工程技术选育氨甲酰妥布霉素含量高的菌种。方法克隆安普霉素生物合成基因,通过基因阻断技术破坏安普霉素生物合成基因,阻断安普霉素生物合成。结果获得了氨甲酰妥布霉素含量高的菌种。结论利用基因工程技术可以有效地改良抗生素组分。     

黑暗链霉菌原生质体制备、再生及其DNA转化条件的研究

利用CP培养基培养黑暗链霉菌 (Streptomycestenebrarius) 990 4,采用二级培养即首先在37℃培养 48h ,然后按 10 %的转种量转种于新鲜的培养基中 ,同时补加 2 %甘氨酸 ,2 8℃培养 2 0h ,收获的菌丝体对溶菌酶敏感。在适宜的酶解条件下可形成 4 6 2× 10 9/mL原生质体 ,再生率为18%。利用经修饰的质粒DNA转化冻存的原生质体获得成功 ,转化率为 10 3～ 10 4 / μgDNA。     

抗MRSA链霉菌NJ0510的抑菌活性及发酵影响因素的研究

从土壤中分离到一株有效抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的链霉菌NJ0510。考察了抗菌谱及各种发酵影响因素对链霉菌NJ0510抑菌活性物质产生的影响,通过正交实验对培养基中碳、氮源的组成及发酵天数进行了优化。实验表明该菌的最适培养条件为:培养40h的种子培养液以10%的接种量接入到含1%葡萄糖、2%糊精和4%蛋白胨,40mg/LFeCl3、20mg/LCuSO4.5H2O和1mg/LCoCl2.6H2O的发酵培养基中,在200r/min振荡条件下,培养5d。     

浊度法测定硫酸妥布霉素注射液的含量

目的采用浊度法测定硫酸妥布霉素注射液的含量。方法选用金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26 003]为试验菌,利用妥布霉素在含菌液体培养基中,于530 nm的吸光度与浓度的对数呈良好线性关系的原理进行测定。结果妥布霉素0.3~1.1μg.ml-1线性关系良好(r=0.9977),平均回收率为102.3%,RSD=1.6%(n=9)。结论所建方法较常用的管碟法操作简便快速、灵敏、准确、稳定,是测定硫酸妥布霉素注射液含量的较好方法。     

淡紫灰链霉菌X33水溶性抗真菌产物高产菌株的诱变选育

以淡紫灰链霉菌X33(Streptomyces lavendulae X33)野生菌为出发菌株,柑橘致病菌指状青霉(Penicillium digitatum)为指示菌,诱变选育对柑橘采后致病青霉具有显著抑制作用的水溶性抗真菌产物的高产菌株。经自然分离选育后,采用紫外线、亚硝基胍、五溴尿嘧啶与二氨基嘌呤混合三轮系列诱变处理,筛选获得一株性能稳定的高产诱变菌株BP39,其相对抑菌效价较出发菌株X33提高了279%。表明传统的物理、化学诱变选育方法,可大幅提高野生菌株活性产物产量,是一种简便、快速的育种手段。     

响应面法优化具有抑菌作用的链霉菌D-8菌株的发酵工艺研究

目的 采用响应面法(RSM)优化链霉菌D-8菌株产抑菌物质的发酵条件.方法 采用单因素试验确定由章鱼肠道获得的链霉菌D-8菌株产抑菌物质的最佳碳源与用量、NaC1浓度及培养时间.以金黄色葡萄球菌为指示菌,双层平板透明圈法测定发酵液的抑菌活性,采用响应面Box-benhnken试验设计,对链霉菌D-8菌株产抑菌物质的工艺条件进行优化.结果 建立了该菌株抑菌性随可溶性淀粉含量、NaCl浓度及培养时间变化的多项二次回归方程,得出该菌株产抑菌物质的最佳工艺条件是可溶性淀粉2.44％,氯化钠浓度3.50％,培养时间为100h,在此条件下,透明圈直径达到2.51cm,比优化前提高了2.21倍,与预测值(2.42cm)较为接近.结论实验结果表明预测模型可靠,用该模型对链霉菌D-8菌株的抑菌活性进行预测是可行的.     

Streptomyces griseus ATCC 13273对4种黄酮生物转化的初步研究

研究Streptomyces griseusATCC 13273对黄酮类化合物柚皮苷,橙皮苷,黄芩苷及木犀草素的生物转化。用标准马铃薯培养基培养的S.griseus中加入底物后继续培养4 d,发酵液经乙酸乙酯萃取后采用硅胶柱层析分离纯化,产物的结构根据光谱数据予以鉴定。有6个转化产物得到分离鉴定,分别是柚皮素-7-O-葡萄糖苷,柚皮素,橙皮素,黄芩素、黄芩素-6-甲氧醚和柯伊利素。结果表明此转化过程中涉及到两类反应即糖苷水解和甲基化反应,S.griseus产生的L-鼠李糖苷酶对底物有特异选择性,β-D-葡萄糖苷酶的选择性不强,甲基转移酶仅对黄酮类化合物的特异位点进行甲基化。该研究首次报道S.griseus对黄酮L-鼠李糖苷键和β-D-葡萄糖苷键的水解及对黄酮类化合物特异位点的甲基化。     

一种改进卡特利链霉菌358原生质体再生的方法

以卡特利链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｔｔｌｅｙａ）３５８为原始菌株,研究了影响原生质体形成和再生的各种因素,证实了再生培养基中含ＨＥＰＥＳ缓冲剂以及Ｐ缓冲液中加入１％的牛血清白蛋白（ＢＳＡ）后能有效地促进再生,在ＳＲ再生培养基上原生质体再生率由０．１％提高到２９．５％。     

毒三素链霉菌生产利普司他汀的发酵与提取工艺

研究了以豆油为主要碳源和能源的培养基中毒三素链霉菌的发酵代谢特性。在考察了乳化剂、温度等因素对利普司他汀生产的影响后，发现前期降低温度有利于保持菌种后期生产能力。最终变温发酵利普司他汀的产量达1．32g／L，比28℃恒温发酵提高了62％。并使用丙酮萃取与超声破碎细胞、乙酸乙酯萃取利普司他汀的提取工艺，简化了匀浆过程，提取效率为甲醇提取的3倍。