静脉注射神经生长因子基因修饰的骨髓基质干细胞对辐射诱导小鼠肝细胞凋亡的影响

背景:研究发现神经生长因子能减少神经细胞和心肌细胞的凋亡.目的:假设神经生长因子基因修饰的骨髓基质干细胞对辐照诱导小鼠肝细胞凋亡具有保护作用,拟验证其可能性.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-01/08在广东医学院实验动物中心实验室完成.材料:昆明小鼠120只,随机分细胞注射组40只、单纯照射组40只和正常对照组40只.方法:单纯照射组采用 60Coγ射线照射小鼠,吸收剂量率188.2 cGy/min,细胞注射组照射前2 d静脉给予神经生长因子基因修饰的骨髓基质干细胞5×1010 L-1;正常对照组不辐射损伤.观察小鼠30 d存活率和死亡动物存活时间;用原位末端标记法和流式细胞仪观察受照小鼠肝细胞凋亡及p53表达,再用Western blot进一步测定p53的表达水平.主要观察指标:①受照射小鼠30 d存活率.②受照射小鼠肝细胞凋亡情况.③受照射小鼠肝细胞p53表达.结果:细胞注射组30 d存活率高于单纯照射组.单纯照射组小鼠大量肝细胞发生凋亡,呈灶性.细胞注射组小鼠肝细胞凋亡少于单纯照射组, 凋亡细胞呈散在分布.细胞注射组肝细胞p53标记的荧光强度和细胞比例明显低于单纯照射组(P < 0.05).细胞注射组p53带灰度值低于单纯照射组(P < 0.05).结论:神经生长因子基因修饰的骨髓基质干细胞能明显抑制受照小鼠肝细胞凋亡及抑制肝细胞p53的表达.     

氧化应激诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡及Bax和p53的表达变化

目的 探讨氧化应激状态下肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ)凋亡的变化规律及Bax和p53表达的变化.方法 用过氧化氢(H2O2,500 μmol/L)处理不同时间模拟机体活性氧攻击损伤ATⅡ细胞的体内情况,建立氧化损伤性细胞模型;用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,荧光显微镜及流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位,蛋白质免疫印迹法(Western blotting)检测Bax和p53的蛋白表达变化.结果 与对照组比较,随H2O2刺激时间延长,ATⅡ细胞存活率明显下降(F=85.211,P＜0.05),线粒体膜电位也明显下降(F=72.453,P＜0.05),凋亡率却明显增加(F=54.002,P＜0.05);同时发现Bax蛋白和p53蛋白表达均明显增加(F1=28.118,F2=43.456,P均＜0.05).结论 氧化应激能损伤ATⅡ细胞,使细胞线粒体膜电位下降,细胞凋亡率增加、存活率下降,Bax和p53可能参与了ATⅡ细胞的凋亡.     

低氧增强骨髓间充质干细胞对缺氧诱导心肌细胞凋亡的可能性

背景:骨髓间充质干细胞移植入缺血心肌后存活率低,而低氧有可能增强骨髓间充质干细胞的增殖,促进其存活。目的:体外模拟心肌细胞缺血微环境,探索低氧预处理后,骨髓间充质干细胞对持续缺氧诱导的心肌细胞凋亡的保护作用。方法:取第4代SD大鼠骨髓间充质干细胞用于制备条件培养液。取胚胎大鼠心肌细胞株,随机分成4组:对照组:心肌细胞正常培养组;模型组:心肌细胞单纯缺氧;骨髓间充质干细胞组:心肌细胞与骨髓间充质干细胞条件培养液共缺氧;低氧组:心肌细胞与骨髓间充质干细胞低氧条件培养液共缺氧。MTT检测各组细胞活力变化,AnnexinV-FITC双染标记心肌细胞凋亡,免疫组化检测各组Bax和Bcl-2蛋白的表达。结果与结论:免疫组化显示,低氧组的Bcl-2表达较其他各组增强,而Bax的表达比模型组和骨髓间充质干细胞组减弱,Bcl-2/Bax比值最大。与对照组和骨髓间充质干细胞组相比,低氧组的细胞活力高(P<0.05),凋亡率降低(P<0.05)。提示低氧可能是通过增强旁分泌机制,从而对Bax和Bcl-2进行调节,对心肌细胞凋亡有保护效应。     

H2O2诱导内皮细胞凋亡及其机制探讨

【目的】探讨过氧化氢（H2O2）所致内皮细胞功能损害中的作用及其机制。【方法】人脐静脉内皮细胞（HUVEC）培养后，分为对照组（A组），H2O2处理组（B组），H2O2和蛋白激酶C（PKC）抑制剂GF109203处理组（C组），H2O2和P38抑制剂Apigenin处理组（D组）。H2O2处理细胞30min后加入相应试剂作用24h。MTT法测定细胞存活率，Ki-67染色检测HUVEC增殖活性，免疫荧光染色方法检测细胞凋亡，Western blotting检测p53蛋白表达。【结果】①B组可诱导HUVEC功能损伤，使HUVEC的存活率降低、增殖活性降低、细胞凋亡增加，并使p53蛋白的表达上调；②C组可显著抑制H20z诱导的HuVEC功能损伤和p53蛋白表达的上调；而D组不能抑制H2O2诱导的HUVEC功能损伤和p53蛋白表达的上调。【结论】p53在氧化应激所致内皮细胞功能损害中起重要作用；而这些作用与PKC信号转导通路有关。     

低氧增强骨髓间充质干细胞对缺氧诱导心肌细胞凋亡的可能性

背景：骨髓间充质干细胞移植入缺血心肌后存活率低,而低氧有可能增强骨髓间充质干细胞的增殖,促进其存活。目的：体外模拟心肌细胞缺血微环境,探索低氧预处理后,骨髓间充质干细胞对持续缺氧诱导的心肌细胞凋亡的保护作用。方法：取第4代SD大鼠骨髓间充质干细胞用于制备条件培养液。取胚胎大鼠心肌细胞株,随机分成4组：对照组：心肌细胞正常培养组;模型组：心肌细胞单纯缺氧;骨髓间充质干细胞组：心肌细胞与骨髓间充质干细胞条件培养液共缺氧;低氧组：心肌细胞与骨髓间充质干细胞低氧条件培养液共缺氧。MTT检测各组细胞活力变化,AnnexinV-FITC双染标记心肌细胞凋亡,免疫组化检测各组Bax和Bcl-2蛋白的表达。结果与结论：免疫组化显示,低氧组的Bcl-2表达较其他各组增强,而Bax的表达比模型组和骨髓间充质干细胞组减弱,Bcl-2/Bax比值最大。与对照组和骨髓间充质干细胞组相比,低氧组的细胞活力高（P〈0.05）,凋亡率降低（P〈0.05）。提示低氧可能是通过增强旁分泌机制,从而对Bax和Bcl-2进行调节,对心肌细胞凋亡有保护效应。     

β淀粉样蛋白对神经干细胞酪氨酸蛋白激酶A表达的影响

目的:观察不同浓度的Aβ1-40对C17.2神经干细胞TrkA表达的影响方法:分别应用舍终浓度为0、20、40、60、80、100 nmol/L Aβ1-40的培养液孵育C17.2神经干细胞24 h,MTT法检测各组细胞活性,Western blot观察各组神经干细胞TrkA表达情况.结果:MTT法检测结果显示各组细胞活性差异不明显;Western blot结果显示终浓度为20、40、60 nmol/L Aβ1-40组的神经干细胞TrkA表达有不同程度的增加,100 nmol/L Aβ1-40组细胞TrkA表达较对照组减少,80 nmol/L Aβ1-40组细胞TrkA表达较对照组差异无统计学意义.结论:Aβ1-40对神经干细胞TrkA表达的影响呈浓度依赖性.     

骨髓间充质干细胞表达神经营养因子及对神经干细胞的保护作用

目的 研究大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）表达脑源性神经营养因子（BDNF）和神经生长因子（NGF）以及BMSC条件培养液对神经干细胞的保护作用。方法 取大鼠骨髓培养BMSC，用CD44、CD45和CD71免疫细胞化学染色进行鉴定。提取BMSCmRNA，RT-PCR检测BDNF和NGF表达，ELISA检测BMSC培养液中BDNF和NGF的含量。原代取材培养新生大鼠皮质神经干细胞，nestin染色鉴定。用不同比例的BMSC条件培养液培养神经干细胞24h后，热休克诱导凋亡，流式细胞仪检测凋亡细胞比率。结果 BMSC贴壁生长，免疫细胞化学染色CD44和CD71阳性表达．CD45阴性表达。BMSC表达BDNF和NGFmRNA，BMSC培养液中含有BDNF和NGF；随培养时间的延长，培养液中BDNF和NGF的浓度增加。BMSC条件培养液可以减少热休克诱导的神经干细胞凋亡比率．并且BMSC条件培养液浓度高者有更好的保护作用。结论 BMSC表达神经营养因子BDNF和NGF，对神绎千细朐凋亡有保护作用．     

核因子-κB在阿霉素致大鼠心肌细胞损伤中的意义

目的:研究核因子-κB在阿霉素致新生大鼠心肌细胞损伤中的意义。方法:培养的新生大鼠心肌细胞分为三组:对照组、阿霉素组和阿霉素 抗氧化剂组。MTT法检测新生大鼠心肌细胞的存活率;RT-PCR法测定新生大鼠心肌细胞中p53 mRNA的表达;Western blot法测定新生大鼠心肌细胞中研究核因子-κB蛋白的表达;凝胶阻滞分析法测定新生大鼠心肌细胞中研究核因子-κB的结合活性。结果:与对照组比较,阿霉素组新生大鼠心肌细胞存活率降低、p53mRNA表达增加、研究核因子-κB p50蛋白表达增加、细胞胞核中研究核因子-κB的结合活性增加;而阿霉素 抗氧化剂组新生大鼠心肌细胞存活率、p53 mRNA、研究核因子-κB p50蛋白表达、研究核因子-κB的结合活性均无明显变化。结论:在阿霉素致大鼠心肌细胞损伤过程中研究核因子-κB的活性增加,研究核因子-κB在阿霉素致大鼠心肌细胞损伤过程中起促进细胞凋亡,可能与调节凋亡相关基因p53的表达有关。     

参附汤血中移行成分对缺氧复氧心肌细胞凋亡和自噬的影响

目的:观察参附汤血中移行成分对缺氧复氧心肌细胞凋亡和自噬的影响,探讨参附汤血中移行成分心肌保护作用机制。方法:建立缺氧复氧心肌细胞损伤模型,采用MTT法检测心肌细胞的存活率,TUNEL显色法检测细胞凋亡率,Western blotting法测定自噬相关基因Beclin-1表达量。结果:与正常对照组相比,缺氧复氧组细胞存活率降低,细胞凋亡率和Beclin-1表达量明显升高,参附汤血中移行成分组可明显提高缺氧复氧组心肌细胞的存活率,降低细胞凋亡率和抑制Beclin-1表达。结论:参附汤血中移行成分可保护缺氧复氧的心肌细胞,据有抑制细胞凋亡和自噬的作用。     

NAD+对受照射L02肝细胞株bcl-2、bax、p53蛋白表达的影响

目的:探讨氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸对体外培养的人正常肝细胞株L02辐射损伤保护作用及可能的机制.方法:实验分3组,照射+NAD组、照射组和假照射组.采用MTT法检测NAD+对受照射L02细胞生长活性的影响;应用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率以及凋亡相关蛋白bax、bcl-2、p53阳性表达率.结果:细胞受照射后加入NAD+能够对抗X射线照射对L02细胞的生长抑制作用,细胞生长活性较单照射组细胞活性显著提高、减少细胞凋亡(P＜0.05);照射后加NAD+组与照射组相比较,细胞p53、bax表达下调(P＜0.05)、bcl-2的表达上调(P＜0.05).结论:NAD+可以对抗L02细胞的X线辐射损伤,其作用机制很可能与P53信号传递途径有关.     

脑出血模型大鼠针刺穴位后其血清对脑源性神经干细胞膜相关蛋白Numb表达的影响

[目的]探讨脑出血模型大鼠针刺穴位后其血清对脑源性神经干细胞膜相关蛋白Numb表达的影响.[方法]将实验大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、模型针刺血清组,制备针刺血清培养神经干细胞,并采用免疫细胞化学染色法检测神经干细胞膜相关蛋白Numb的表达情况.[结果]正常对照组、模型对照组和模型针刺血清组神经干细胞都可见到Numb蛋白的表达.模型对照组Numb蛋白表达明显下调,与正常对照组比较,差异有显著性(P＜0.01);模型针刺血清组Numb蛋白表达明显上调,与模型对照组比较,差异有显著性(P＜0.01);与正常对照组比较无显著性差异(P＞0.05).[结论]针刺血清能上调脑源性神经干细胞膜相关蛋白Numb的表达,加速神经干细胞的分化,促进脑损伤组织的修复.     

心肌营养素1对谷氨酸诱导神经干细胞凋亡的作用

背景:心肌营养素1属于白细胞介素6细胞因子家族,近年发现其可能对中枢神经系统有重要保护作用。目的:探索重组腺病毒心肌营养素1对谷氨酸诱导神经干细胞凋亡的保护作用,为脑损伤提供新的治疗措施。方法:取新生Wistar大鼠海马神经干细胞,第2代培养第5天用于实验,神经干细胞分为3组:谷氨酸组、重组腺病毒心肌营养素1组及对照组,利用四唑蓝比色了解细胞存活情况及原位缺口末端标记技术检测细胞凋亡。结果与结论:谷氨酸组神经干细胞呈现明显形态改变,重组腺病毒心肌营养素1组未见类似改变,在谷氨酸暴露后12,24,48及72hMTT吸光度值均低于心肌营养素1组,而细胞凋亡率均高于心肌营养素1组。与其他两组比较,对照组相同时间点A值增高,细胞凋亡率降低。提示,心肌营养素1对谷氨酸损伤的神经干细胞具有保护作用,可以抑制神经干细胞凋亡,促进其存活和增殖。     

心肌营养素1对谷氨酸诱导神经干细胞凋亡的作用

背景：心肌营养素1属于白细胞介素6细胞因子家族,近年发现其可能对中枢神经系统有重要保护作用。目的：探索重组腺病毒心肌营养素1对谷氨酸诱导神经干细胞凋亡的保护作用,为脑损伤提供新的治疗措施。方法：取新生Wistar大鼠海马神经干细胞,第2代培养第5天用于实验,神经干细胞分为3组：谷氨酸组、重组腺病毒心肌营养素1组及对照组,利用四唑蓝比色了解细胞存活情况及原位缺口末端标记技术检测细胞凋亡。结果与结论：谷氨酸组神经干细胞呈现明显形态改变,重组腺病毒心肌营养素1组未见类似改变,在谷氨酸暴露后12,24,48及72hMTT吸光度值均低于心肌营养素1组,而细胞凋亡率均高于心肌营养素1组。与其他两组比较,对照组相同时间点A值增高,细胞凋亡率降低。提示,心肌营养素1对谷氨酸损伤的神经干细胞具有保护作用,可以抑制神经干细胞凋亡,促进其存活和增殖。     

羊膜脱细胞基质对脐血间质干细胞突触蛋白表达的影响

背景:天然细胞外基质对成体干细胞神经发育的影响,是目前的研究热点,国内外研究多侧重于神经标志物表达的研究,针对突触发育的研究较少。目的:观察羊膜脱细胞基质对脐血间质干细胞突触素表达的影响。方法:实验组将第 3 代人脐血间质干细胞接种在包被膜样基质盖玻片的 24 孔板中,以接种时开始计时,细胞以基础培养基培养 4 d。对照组无膜样基质,余同实验组。苏木精-伊红染色观察细胞形态变化,免疫组化 SP 法检测接种第 2、4 天细胞突触素相关蛋白表达,RT-PCR 法检测接种前和接种后第 2、4 天细胞突触素相关蛋白Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ基因转录水平的表达。结果与结论:对照组呈成纤维细胞形态,实验组细胞突起延伸,相互连接;第 2、4 天实验组突触素相关蛋白表达均明显高于对照组,差异有显著性意义(P < 0.01);接种前及对照组第 2、4 天细胞突触素相关蛋白Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ基因转录水平无表达,实验组第 2,4 天细胞突触素相关蛋白Ⅱ基因转录水平低表达,突触素相关蛋白Ⅲ弱表达,突触素相关蛋白Ⅰ不表达。结果提示羊膜脱细胞基质可以促使人脐血间质干细胞突起的产生、延伸并部分相互连接,表达突触素相关蛋白,为脐血间质干细胞神经分化提供了有利的条件。     

脂肪来源神经干细胞移植局灶性脑缺血模型大鼠的血管新生

背景：脂肪组织来源的神经干细胞移植可改善脑缺血大鼠神经功能,但其机制尚不明确。目的：观察人脂肪组织来源神经干细胞移植对大鼠局灶性脑缺血后血管新生的影响。方法：体外培养脂肪基质细胞,诱导分化为神经干细胞。60只健康雄性SD大鼠分为4组：正常组6只,假手术组6只,缺血对照组24只,移植治疗组24只。后两组线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血2h再灌注模型,又分为缺血2h再灌注7,14,21,28d组,每个时点各6只。假手术组不闭塞大脑中动脉。造模成功后24h,移植治疗组经尾静脉移植人脂肪组织来源神经干细胞悬液,细胞浓度为2×109L-1;缺血对照组经尾静脉注射生理盐水。免疫组织化学法进行微血管密度计数,观察脑缺血区血管增生情况。结果与结论：免疫组织化学结果显示,与缺血对照组比较,移植治疗组缺血2h再灌注7,14,21,28d的微血管密度值均显著高于缺血对照组,差异有显著性意义（P〈0.05～0.01）。提示脂肪组织来源的神经干细胞移植可促进脑缺血区新生血管的形成。     

羊膜脱细胞基质对脐血间质干细胞突触蛋白表达的影响

背景：天然细胞外基质对成体干细胞神经发育的影响,是目前的研究热点,国内外研究多侧重于神经标志物表达的研究,针对突触发育的研究较少。目的：观察羊膜脱细胞基质对脐血间质干细胞突触素表达的影响。方法：实验组将第 3 代人脐血间质干细胞接种在包被膜样基质盖玻片的 24 孔板中,以接种时开始计时,细胞以基础培养基培养 4 d。对照组无膜样基质,余同实验组。苏木精-伊红染色观察细胞形态变化,免疫组化 SP 法检测接种第 2、4 天细胞突触素相关蛋白表达,RT-PCR 法检测接种前和接种后第 2、4 天细胞突触素相关蛋白Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ基因转录水平的表达。结果与结论：对照组呈成纤维细胞形态,实验组细胞突起延伸,相互连接;第 2、4 天实验组突触素相关蛋白表达均明显高于对照组,差异有显著性意义（P 〈 0.01）;接种前及对照组第 2、4 天细胞突触素相关蛋白Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ基因转录水平无表达,实验组第 2,4 天细胞突触素相关蛋白Ⅱ基因转录水平低表达,突触素相关蛋白Ⅲ弱表达,突触素相关蛋白Ⅰ不表达。结果提示羊膜脱细胞基质可以促使人脐血间质干细胞突起的产生、延伸并部分相互连接,表达突触素相关蛋白,为脐血间质干细胞神经分化提供了有利的条件。     

曲美他嗪改善移植微环境对心肌梗死大鼠左心功能的影响

目的 采用超声心动图评价曲美他嗪改善移植微环境对心肌梗死大鼠心脏形态及左心功能的影响.方法 40只Wistar大鼠随机分成4组,对照组开胸不结扎,心肌梗死组心肌内注射无血清培养基;干细胞移植组注射骨髓干细胞;干细胞移植+曲美他嗪组注射骨髓干细胞,同时给予曲美他嗪灌胃.移植后4周测量4组实验动物的心脏形态和左心功能.结果 移植组大鼠左室腔内径明显小于心肌梗死组,左室收缩压明显高于心肌梗死组,而舒张末期压则显著降低,左室收缩功能等各项指标亦有明显改善,干细胞移植+曲美他嗪组大鼠上述指标改善更为显著.结论 骨髓干细胞移植可防止心肌梗死后左室腔扩大,有效改善左功能,同时给予曲美他嗪治疗可进一步提高疗效.     

海人酸对神经干细胞增殖及分化的影响

背景：神经干细胞对脑组织的修复作用非常有限,约80％新增殖的内源性神经干细胞在6周内死亡,仅0．2％的细胞继续增殖、分化,参与修复。目的：分析不同剂量海人酸在对神经干细胞增殖及分化的影响。方法：体外分离并培养新生Wistar大鼠神经干细胞,将神经干细胞分为空白对照组和加入不同浓度梯度的海人酸组,通过免疫组化法和免疫荧光法进行鉴定,MTT比色法测定海人酸对神经干细胞分化的影响,计算分化后神经元和星形胶质细胞比例。结果与结论：海人酸组贴壁的神经球分化速度较空白对照组快,在同一时间点进行观察,神经细胞的迁移距离较未处理组远。分化5d后,海人酸组所分化的细胞中,星状细胞较空白对照组多,而神经元样细胞相对较少,培养的细胞具有自我更新和向神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞分化的潜能。兴奋性氨基酸海人酸可使部分神经干细胞死亡,但可促进幸存的神经干细胞增殖及分化,并诱导其向星形胶质细胞分化。     

三七三醇皂苷与脑缺血耐受对脑自体神经干细胞增殖的作用

背景：脑缺血耐受可促进大鼠脑梗死后海马区自体神经干细胞的增殖,但传统中药三七通舒对脑自体神经干细胞增殖的影响还未见报道。目的：明确中药三七三醇皂苷、缺血预处理与大鼠脑梗死后7d海马区自体神经干细胞增殖的关系,以及其对大鼠脑梗死后神经行为学评分的影响。方法：50只SD雄性大鼠随机等分为假手术组、缺血组、预缺血对照组、预缺血组和三七三醇皂苷组,后4组采用改良的Zea-Longa法制备急性脑梗死模型,假手术组仅做颈部手术切口,预缺血组采用二次线栓法建立局灶-局灶性脑缺血耐受的动物模型,缺血对照组利用假手术代替预缺血。三七三醇皂苷组大鼠在造模前7 d起,每天给予三七三醇皂苷100 mg/kg腹腔注射。结果与结论：大鼠脑梗死7 d后,缺血组大鼠神经行为学评分和海马区中神经干细胞数量明显增加（P〈0.01）,而与缺血组相比,预缺血组和三七三醇皂苷组大鼠神经行为学评分下降（P〈0.01）,而海马区中神经干细胞数量增加（P 〈0.01）,且两组差异无显著性意义（P 〉0.05）,而预缺血对照组大鼠神经行为学评分和海马区中神经干细胞数量与缺血组接近（P〉0.05）。提示传统中药三七三醇皂苷可以发挥类缺血耐受作用,改善大鼠脑梗死后的神经功能缺损症状。     

骨髓间充质干细胞诱导分化为神经干细胞过程中端粒酶的表达

背景:端粒酶在细胞分化及活化过程起重要作用。目的:检测骨髓间充质干细胞诱导分化为神经干细胞过程中端粒酶的表达。方法:采用PCR-ELISA端粒酶检测方法检测SD大鼠骨髓间充质干细胞传代培养前6代细胞中端粒酶的表达;将传代培养的第3代SD大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化为神经干细胞,传代培养至第6代,检测各代细胞中端粒酶的表达。以人胚肾细胞系293细胞蛋白提取物作为阳性对照,以灭活细胞蛋白提取物为阴性对照。结果与结论:端粒酶在传代培养的前6代骨髓间充质干细胞中呈阳性表达,为阳性对照组的9.4%～30.9%,第3代表达最高;在诱导分化为神经干细胞传代培养的前5代呈阳性表达,为阳性对照组的5.4%～33.1%,第3代和第4代表达最高。说明端粒酶是细胞分化、增殖的一个重要因素。