鲁西南地区间日疟原虫Pvmsp-1基因分型及序列同源性研究

目的了解不同时期鲁西南地区间日疟原虫Pvmsp-1基因分型及序列同源性特征。方法收集不同时期采制的鲁西南地区间日疟患者厚、薄血膜标本,用巢式PCR方法扩增间日疟Pvmsp-1基因icb5~icb6片段,对产物进行PvuⅡ酶切鉴定和序列比对分析及系统进化分析。结果 25份间日疟样品巢式PCR产物大小均为470bp,经PvuⅡ酶切均获得350bp和120bp两条片段,为Sal-1型。进化树分析25个样品株处于同一个大分支,且与Sal-1型标准株株同属一个总分枝,而与Belem型标准株遗传距离较远。结论鲁西南地区不同时期流行株间日疟原虫Pvmsp-1基因均为Sal-1型,株间序列同源性较高。     

云南省输入性及本地感染间日疟原虫裂殖子表面蛋白1基因5区序列的多态性分析

目的分析云南省输入性及本地感染间日疟病例的疟原虫裂殖子表面蛋白1(Plasmodium vivax merozoite surface protein-1,Pv MSP-1)基因5区序列及其等位基因的多态性。方法 2012年8月-2015年9月,收集云南省输入性及本地感染间日疟病例的滤纸血样和流行病学史等相关信息。提取疟原虫DNA,PCR扩增Pv MSP-1基因5区并测序,与M75674、AAN86237、M60807、ABJ53045、AAN86238、BAA18977等参比序列进行比对,用Mega 5.04、Arlequin3.5.1软件分析Pv MSP-1基因5区的序列多态性,计算序列间保守位点、遗传距离和多样性指数,并根据氨基酸序列间的遗传距离绘制聚类树状图。结果 2012年8月-2015年9月,共收集间日疟病例血样847份。其中,云南省本地感染61份,非洲、缅甸感染的分别为66和720份。847份血样中278份扩增出Pv MSP-1基因5区片段,206份测序成功。Pv MSP-1基因5区片段编码氨基酸长193~222 aa。氨基酸序列比对分析显示,Sal-1、Belem和Recombine基因型分别占59.2%(122/206)、23.3%(48/206)和17.5%(36/206),缅甸、非洲感染和云南本地感染血样中Sal-1基因型分别占58.8%(104/177)、11/15和7/14。Sal-1、Belem、Recombine基因型分别有51、9和6个亚型。这66个亚型的Shannon-wiener指数(H’)和期望杂合度(He)分别为0.955和0.567。206条DNA序列的同源位点为665 bp、保守位点为11.3%(75/665)、变异位点为88.7%(590/665),不同感染来源地的分离株与不同的氨基酸参比序列的遗传距离均小于0.4。聚类分析显示,206条Pv MSP-1基因5区氨基酸序列按基因型聚类成2个大类,有3个次级分支,其中,Recombine与Belem基因型的相似度为91%~92%,高于与Sal-1基因型的82%~83%。结论云南省输入性及本地感染的间日疟原虫分离株Pv MSP-1基因5区存在多种亚型,在Sal-1、Belem、Recombine等3种基因型中,Sal-1型占优势。     

我国不同疟区间日疟原虫裂殖子表面蛋白1(PvMSP-1)基因多态性研究

目的　了解我国不同疟疾流行区间日疟原虫裂殖子表面蛋白 - 1基因多态性及其分布。方法　用套式PCR扩增间日疟原虫现场分离株MSP - 1第五多态区 (ICB5 -ICB6 )基因片段 ,部分样本进行序列测定、分析和比对。结果　 82份间日疟原虫现场分离株扩增出 4 70bp片段 5 0份 ,4 0 0bp片段 39份 ,其中 7份为两种片段的混合型。海南分离株混合型为 2 0 %(6 / 30 ) ,平均克隆数为 1 2 0 (36 / 30 ) ,安徽分离株混合型仅为 2 3% ,平均克隆数 1 0 2。对 33份样本进行序列测定 ,Sal- 1型17份 ,Belem型 2份 ,12份重组型 (Ⅲ型 )和朝鲜型 2份为我国新发现基因型。结论　我国间日疟原虫PvMSP - 1存在 4种不同的等位基因型 ,以Sal- 1型和重组型 (Ⅲ型 )占优势 ,南部疟区基因型比北部复杂。     

间日疟原虫不同MSP-1等位基因型形态学观察

目的　比较两种不同等位基因型间日疟原虫生物学形态特征。方法　现场采集间日疟病人血样并进行基因分型 ,镜下观察形态并测量大小。结果与结论　 72份现场分离株基因分型为Sal- 1型 4 0份 ,Belem型 2 5份 ,混合感染 7份 ,均查到典型的间日疟原虫 ,6例多重感染病例均发现在海南分离株 ,多重感染与基因型混合感染无关联。测量正常红细胞、寄生红细胞、环状体以及核大小差别有显著意义 ,Belem型比Sal- 1型大 ,两种不同基因型差异的分子机制需进一步探讨     

问日疟原虫不同MSP-1等位基因型形态学观察

目的 比较两种不同等位基因型间日疟原虫生物学形态特征。方法 现场采集间日疟病人血样并进行基因分型，镜下观察形态并测量大小。结果与结论 72份现场分离株基因分型为Sal-1型40份，Belem型25份，混合感染7份。均查到典型的间日疟原虫，6例多重感染病例均发现在海南分离株，多重感染与基因型混合感染无关联。测量正常红细胞、寄生红细胞、环状体以及核大小差别有显著意义，Belem型比Sal-1型大，两种不同基因型差异的分子机制需进一步探讨。     

辽宁丹东间日疟原虫裂殖子表面蛋白1等位基因型分析

用套式PCR方法扩增辽宁丹东地区间日疟原虫裂殖子表面蛋白1(MSP-1)基因ICB5-ICB6片段,经PvuⅡ酶切和琼脂糖凝胶电泳,对产物进行序列分析。结果显示,11份镜检确诊的间日疟患者血液标本经套式PCR扩增均出现大小约为470 bp(Sal-1型)或400 bp(Belem型)的特异性片段。经PvuⅡ内切酶消化后,其中5份血样(470 bp),出现120和350 bp酶切片段,为Sal-1型;其余6份血样(400 bp)中,1份出现400 bp片段,为Belem型,1份出现120和280 bp两种酶切片段,为重组Ⅲ型,4份出现120和240 bp两种酶切片段,为朝鲜型。辽宁省丹东地区的间日疟原虫PvMSP-1基因存在3种不同的等位基因型,以Sal-1型和朝鲜型为主,但无不同等位基因型的混合感染。     

间日疟原虫裂殖子表面蛋白的等位基因型检测

目的　建立一种间日疟原虫裂殖子表面蛋白 1(PvMSP-1)基因型检测技术。　方法　设计针对PvMSP 1ICB5～ICB6多态区的引物进行PCR ,其产物用PvuⅡ内切酶消化、琼脂糖凝胶电泳检测 ,鉴别我国间日疟原虫现场分离株基因型。　结果　 98份间日疟血样经套式PCR扩增均出现大小约为 40 0bp(Belem型 )或 470bp(Sal-1型 )的特异性片段。酶切消化后 ,45份 470bp样本出现 12 0bp和 3 5 0bp酶切片段 ,为Sal-1型 ;40份 40 0bp的样本中 3份仅出现 1条 40 0bp片段 ,为Belem型 ;3 5份出现 12 0bp和 2 80bp两种酶切片段 ,为Ⅲ重组型 ;2份 12 0bp和 2 40bp片段 ,为朝鲜型。结论　套式聚合酶链反应-限制性片段长度多态性 (PCR-RFLP)技术可用于检测我国间日疟原虫的 3种PvMSP-1等位基因型。     

我国华南间日疟原虫裂殖子表面蛋白1等位基因分型和序列分析

目的　了解我国间日疟原虫MSP1(PvMSP1)的等位基因类型和序列的多态性。方法　用特异的引物通过套式PCR方法体外扩增包含PvMSP1的ICB5与ICB6之间的基因片段 ,并对部分扩增产物进行序列测定和分析。结果　 2 7份间日疟原虫患者血样中 ,有 16份 (5 9 9% )扩增得到Belem型基因产物 ,2 5 (92 6 % )份扩增出Sal- 1型基因产物 ;两种不同等位基因型虫株的混合感染率为 5 1 9%。序列分析结果发现一个以前未见报告的基因内重组类型。结论　我国间日疟原虫虫株存在两种PvMSP1等位基因型 ,Sal- 1型可能是主导型 ;不同等位基因型的混合感染率较高     

山东省间日疟原虫MSP-1和CSP等位基因型及同源性分析

目的分析山东省间日疟原虫MSP-1和CSP基因类型及其同源性,为病例溯源提供科学依据。方法采集2011年山东省报告的12例间日疟患者血样,提取疟原虫基因组DNA;分别根据间日疟原虫MSP-1和CSP基因序列设计引物,进行巢式PCR扩增、酶切、测序、序列比对及同源性分析。结果 12份间日疟患者血样MSP-1基因全部出现470bp扩增条带以及350、120 bp酶切片段,均为Sal-1型;MSP-1进化树分析显示,9份省内感染者样品序列同属一个分枝,1份印度感染者样品序列与印度分离株位于同一分枝。12份间日疟患者样品CSP基因均包含GDRA(D/A)GQPA序列,为PV-Ⅰ型,其中10份省内感染者和1份广东感染者样品CSP基因出现560~840 bp和150~230 bp两种扩增条带,为PV-Ⅰ型温带族,1份在印度感染者样品CSP基因仅出现560~840 bp条带,为PV-Ⅰ型热带族。CSP进化树表明,10份省内感染者及1份广东感染者样品序列同属一个分枝,1份在印度感染者样品序列与印度和印度尼西亚分离株位于同一分枝。结论山东省本地感染间日疟原虫MSP-1基因型均为Sal-1型,CSP基因型均为PV-Ⅰ型温带族,本地虫株具有较强的基因同源性。     

间日疟原虫裂殖子表面蛋白1和环子孢子蛋白基因多态性分析

目的对杭州市间日疟病例感染的间日疟原虫(Plasmodium vivax)裂殖子表面蛋白1 (MSP-1)和环子孢子蛋白(CSP)基因的多态性进行描述性分析。方法收集杭州市2008-2019年报告的间日疟病例的血样和流行病学资料。采用全血DNA抽提试剂盒提取疟原虫基因组DNA,巢式PCR分别扩增Pvmsp-1和Pvcsp基因的特异性片段,并进行双向测序。应用DNAStar、 MEGA 6.0软件对氨基酸序列进行序列比对和遗传进化分析,并采用邻接法构建系统进化树。采用SPSS 17.0统计学软件对基因多态性及感染来源地进行描述性和归纳分析。结果共收集间日疟病例血样56份,巢式PCR扩增的Pvmsp-1和Pvcsp基因片段分别测序成功44份和54份血样。序列分析显示,44条Pvmsp-1序列可分为4种基因型,分别为SalⅠ型18份、 Belem型8份、 R-Ⅲ型17份和R-Ⅳ型1份;54条Pvcsp序列分为两种基因型,分别为VK210型52份和VK247型2份。对Pvmsp-1基因的分型特征和感染来源地分析发现,SalⅠ型分布广泛,在我国华东地区,东南亚地区,印度,埃塞俄比亚等多个国家或地区存在。我国华东地区的主要分布类型为R-Ⅲ型,此外,R-Ⅲ型在南亚、东南亚地区也有分布。Belem型主要分布在东南亚、南亚和埃塞俄比亚等国家或地区。对Pvcsp基因的多态性特征和感染来源地分析发现,共有4种多态性特征具有一定的地域特征。结论杭州市2008-2019年报告的间日疟病例的Pvmsp-1和Pvcsp基因存在较丰富的多态性特征,部分特征具有一定地域性。     

Analysis of Plasmodium vivax merozoite surface protein-1 gene sequences from resurgent Korean isolates

The merozoite surface protein-1 (MSP-1) of Plasmodium vivax exhibits great antigenic diversity among different isolates of this parasite. This antigen is a useful genetic marker for studying the polymorphism of natural P. vivax parasite populations. One or more of these populations has been responsible for resurgent malaria now occurring in Korea. This paper reports the analysis of a highly polymorphic region between interspecies conserved blocks 5 and 6 of the MSP-1 gene, using the polymerase chain reaction to amplify the DNA fragment encompassing these regions from 25 Korean isolates, followed by sequencing. Almost all amino acid sequences of Korean isolates were nearly identical to that of Thai isolates TD525A (96.6-99.7%) and TD424 (96.3-99.5%), and very similar to that of the France-Belem strain when compared with other isolates (Sal-1, Sri Lanka, and Colombia). Interallelic recombination was found in the poly-Q repeat and a Sal-1 type amino acid structure was observed in all isolates. This study shows that the MSP gene nucleotide sequence of resurgent P. vivax in Korea is most similar to that of Thai isolates; however, the Korean strains are phylogenetically unique.     

间日疟原虫MSP1 C端编码基因的克隆及序列分析

目的 克隆间日疟原虫MSP1C端编码基因,并进行序列测定和分析。方法 根据间日疟原虫MSP1C端编码基因设计1对引物,采用PCR技术从深圳间日疟患者血样(编号为PvSZ1)的核酸提取物中扩增出MSP1C端编码基因,回收纯化后,与T载体连接构建重组子pMD/MSP1,并转化大肠杆菌JM109。阳性克隆以限制性酶切分析与PCR法鉴定后,双脱氧链末端终止法双向测定序列并分析。结果 从间日疟血样提取的DNA中扩增出1119bp的基因片段,所构建的pMD/MSP1阳性克隆重组子经双酶切和PCR鉴定与预期结果一致。所测定的间日疟原虫PvSZ1C端基因序列与国外Sal-1株比较,碱基数相同,未发现碱基缺失,相同的核苷酸占96.7％,序列中第542位碱基变化为同义突变(GTC→GTT,均编码缬氨酸),第375～542区间的碱基变化数占整个序列变化碱基总数的92.9％(34/37)。所推测的氨基酸序列与Sal-1株比较,同源性为92.5％。结论 成功克隆了间日疟原虫PvSZ1株MSP1C端编码基因,该基因在不同间日疟原虫地理株间相对保守,所克隆基因序列的第375～542核苷酸区域为高频变化区。     

Genetic diversity of merozoite surface protein-1 gene of Plasmodium vivax isolates in mining villages of Venezuela (Bolivar State)

The merozoite surface protein-1 gene of Plasmodium vivax is highly polymorphic and so, currently used in epidemiological studies of P. vivax malaria. We sequenced the variable block 5 of the gene from 39 Venezuelan isolates, 18 of which were co-infected with Plasmodium falciparum. We observed a limited variability with 34 isolates belonging to the type Salvador I, none Belem type and only five recombinants. Among the recombinants, only two types of sequences were observed with, respectively, 18 and 21 poly-Q residues. Nucleotide substitutions explained the major differences of the 11 patterns observed. We could evidence neither specific MSP-1 genotype associated with co-infected samples, nor peculiar MSP-1 genotype distribution inside the investigated areas. In comparison with other low endemic regions in the world, our sampling has a lower genetic diversity, which could be mainly explained by the lack of Belem type. In fact, the variable repeats of poly-Q residues involved in the polymorphism of Belem type and recombinant isolates are responsible for a great part of variability observed in MSP-1 block 5.     

间日疟原虫MSP-1 和 CSP 基因遗传多样性的分析

目的比较间日疟原虫两种主要分子标志(MSP-1 和 CSP)的遗传多样性. 方法分别用MSP-1和CSP基因分型方法鉴定间日疟原虫现场分离株,并进行基因多态性比较和分析. 结果共检测32份海南省现场确诊的间日疟病人血样,MSP-1等位基因型混合感染率为18.75%,平均克隆数1.16;CSP基因型混合感染率为35.29%,平均克隆数为1.47.如果同时考虑两种基因型,混合感染率则为50.00%.空间对应分析发现,热带族与Sal-1型关系密切,PvⅡ型与重组Ⅲ型分布靠近,其他基因型则较分散. 结论同时用MSP-1和CSP两种分子标志检测间日疟原虫,其基因型混合感染率高于用单一标志检测,两种标志检测结果存在一定对应关系.     

Allelic dimorphism in the merozoite surface protein-3alpha in Korean isolates of Plasmodium vivax

To study the genetic diversity of re-emerging Plasmodium vivax in the Republic of Korea, nucleotide sequence variations at the merozoite surface protein-3alpha (PvMSP-3alpha) locus were analyzed using 24 re-emerging isolates and 4 isolates from imported cases. Compared with the well known Belem strain (Brazil), a large number of amino acid substitutions, deletions, and insertions were found at the locus of the isolates examined. The Korean isolates were divided into two allelic types; type I (15 isolates), similar to the Belem strain, and type II (9), similar to the Chess strain (New Guinea). Isolates from imported cases were classified into three types; type III (1 from Malaysia), similar to type B from western Thailand, type IV (1 each from Indonesia and India), and type V (1 from Pakistan), both being new types. Our results have shown that the MSP-3alpha locus of re-emerging Korean P. vivax is dimorphic with two allelic types coexisting in the endemic area.     

Genetic diversity of Plasmodium vivax Pvcsp and Pvmsp1 in Guyana, South America

Approximately 55% of malaria infections in the Guyana Amazon region are attributed to Plasmodium falciparum while the other 45% are attributed to non-falciparum, mostly Plasmodium vivax. However, little is known about the P. vivax strain types circulating in the region. Using PCR for Plasmodium detection and two genetic markers specific to P. vivax to detect the polymorphic circumsporozoite protein (CSP) and the conserved 19-kDa region of the merozoite surface protein-1 (MSP-1), we investigated the overall Plasmodium strain distribution and population diversity within P. vivax in isolates collected from the blood of infected individuals in the interior Amazon region of Guyana, South America. Out of a total of 250 samples positive for Plasmodium, P. vivax was detected in 30% (76/250) and P. falciparum was detected in 76% (189/250). Mixed infections containing both P. falciparum and P. vivax constituted 6% (15/250) of the total positive samples. Further analysis of P. vivax strains showed that 92% (56/61) of the P. vivax samples hybridized with a probe specific to type VK210, 39% (24/61) hybridized with a probe specific for type VK247, and 25% (15/61) hybridized with a probe specific for the P. vivax-like CS genotype. DNA sequencing of the 19-kDa C-terminal domain in block 13 of MSP-1 amplified from 61 samples from patients infected with P. vivax demonstrated that this region is highly conserved, and all samples were identical at the nucleotide level to the Belem and Salvador-1 types. No synonymous or nonsynonymous mutations were observed in this region of the gene, indicating that current vaccine-development efforts based on the MSP-1(19) fragment would be applicable in Guyana.