结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6-CFP10的融合表达及纯化

目的在原核表达系统融合表达结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶ESAT-6和培养滤液蛋白CFP10的融合蛋白(rE6C)并纯化,测定抗原性和特异性。方法用将一个柔性的氨基酸“接头”插入原核表达载体pET32c(﹢)中,构建pET32c(﹢)-linker。PCR法扩增ESAT-6、CFP10基因。将ESAT-6克隆入改建的载体pET32c(﹢)的linker前,CFP10克隆入linker后,构建E6C融合基因,转化大肠杆菌XL1-blue,抽提质粒,酶切鉴定;在大肠杆菌BL21中表达,纯化rE6C蛋白,通过酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测其抗原性和特异性。结果重组质粒pET32c(﹢)-ESAT-6-CFP10靶基因的测序结果与预计序列完全一致。携带重组质粒的菌株经诱导产生高水平的表达产物,纯化的表达产物具备较高的纯度、抗原性和特异性。结论pET32c(﹢)-ESAT-6-CFP10质粒在BL21菌中能高效表达,rE6C融合蛋白具有良好的抗原性和特异性,有望用于结核分枝杆菌感染的临床诊断。     

结核分枝杆菌38 ku蛋白的制备及其抗原性研究

目的基因克隆、表达、纯化结核分枝杆菌38ku蛋白,研究其抗原性,评价其在血清学诊断中的价值。方法2003年2月至2004年3月在中国药品生物制品检定所菌苗室以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,通过聚合酶链反应(PCR)方法对38ku蛋白基因进行扩增,以PET-30a( )为载体构建重组质粒,在大肠埃希菌中表达38ku蛋白,通过金属离子螯合亲和层析方法纯化重组蛋白,免疫印迹和酶联免疫吸附试验(ELISA)方法分析该重组蛋白的抗原性。结果构建了具有正确基因序列的38ku蛋白重组质粒,在大肠埃希菌BL21(DE3)中以包涵体形式表达,经过一步金属离子螯合亲和层析后得到纯度为92.7%的目的蛋白。免疫印迹试验结果表明该蛋白能与羊抗结核血清发生特异免疫结合反应。应用ELISA方法对结核血清参考品进行检测,敏感度和特异度分别为80.5%(33/41)和96.0%(25/26)。结论大肠埃希菌工程菌以包涵体的形式表达38ku蛋白,该蛋白具有良好的免疫原性,可望成为结核血清学的诊断抗原之一。     

结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64的克隆表达和纯化

目的构建结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64原核表达载体并进行表达和纯化。方法以结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA为模板扩增出MPT64基因,产物经纯化回收后与载体pMD-T连接转化,酶切鉴定,克隆到pET21a原核表达载体,测序鉴定插入序列完全正确者转化大肠杆菌BL21,诱导表达MPT64融合蛋白,利用亲和层析纯化表达产物,SDS-PAGE电泳进行鉴定。结果成功构建MPT64表达载体,SDS-PAGE电泳鉴定成功表达MPT64蛋白。并以此蛋白进行结核抗体的检测,其特异性和敏感性分别为96%和43%。结论成功表达结核分枝杆菌MPT64蛋白,并进行特异性和敏感性的检测,证明重组的MPT64蛋白有希望成为结核病血清学诊断的组合抗原的候选者之一。     

结核分枝杆菌MPT64蛋白的表达，纯化及初步应用

目的 获得重组MPT64蛋白,研究其特性,评价其在结核病血清学诊断中的价值。方法 应用基因工程技术表达、纯化MPT64蛋白,通过Western blotting分析其抗原性。分别以结核分枝杆菌PPD或纯化的rMPT64蛋白为抗原,通过ELISA方法及结核病一步法检测血清中抗结核抗体。结果 重组质粒pE T15b-MPT64测序表达除83位密码子由CCA突变为CCG外,其余密码子均与报道的相同,但其氨基酸序列无变化。它在大肠杆菌BL21（DE3）细胞内以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的20－30％,分子量约26kDa,Western blotting分析它与抗结核分要支杆菌多克隆抗体具有良好的免疫反应性。纯化后的rMPT64样品经SDS－PAGE和光密度扫描分析表明其纯度约为80％左右,每100ml培养菌可获得10mg左右的重组蛋白。以33例正常人血清的OD值＋2S为正常界限值,PDD的特异性和敏感性分别为 94％（31／33）、63.7%(21/33)、66.7%;rMPT64纯化蛋白分别为94%(31/33)、30.3(10/33);一步法分别为88％（29／33）。结论 pET15b－MPT64大肠杆菌工程菌能以包涵体形式高效表表重组 MPT64蛋白,该蛋白具有较高的抗性和免疫反应性。rMPT64纯化蛋白有可能成为结核病血清学诊断的组合抗原之一。     

重组结核分枝杆菌CFP10-ESAT-6融合蛋白的制备及应用研究

目的 制备重组培养滤液蛋白10和6000早期分泌性抗原靶的融合蛋白(rCFPlO-ESAT-6)，研究其免疫学特性，评价其在结核病血清学诊断中的价值。方法 用基因拼接(Gene SOEing)法扩增lhp-ESAT-6融合基因、并克隆人pQE30质粒，表达、纯化rCFPl0-ESAT-6蛋白，通过Western blot分析其抗原性。建立豚鼠BCG免疫模型和结核分枝杆菌强毒株(H37Rv)感染模型，建立以融合蛋白为抗原的酶联免疫吸附测定(ELISA)法，检测豚鼠血清中的抗结核分枝杆菌抗体，并与以纯化蛋白衍生物(PPD)为抗原的ELISA法比较。结果 重组质粒pQE30-CFPl0-ESAT-6靶基因的测序结果与预计序列(lhp-linker-ESAT-6)完全一致。融合蛋白在DH5α菌中以可溶性非包涵体形式存在，表达量占菌体总蛋白的40％，分子质量为26000，纯化后的蛋白纯度为98％，浓度为1.2g／L。Western blot分析表明，融合蛋白与活动性肺结核患血清、兔抗CFP10血清和兔抗ESAT-6血清都能发生特异性免疫反应。以10只生理盐水处理豚鼠血清的平均吸光度(A)值 2s为正常界限值，以融合蛋白为抗原，11份H37Rv感染豚鼠血清全部呈阳性反应，11份BCG免疫豚鼠血清仅1份呈阳性反应；以PPD为抗原，11份H37Rv感染豚鼠血清全部呈阳性反应，11份BCG免疫豚鼠血清也全部呈阳性反应。结论 pQE30-CFPl0-ESAT-6 DH5α菌能高效表达rCFPl0-ESAT-6融合蛋白，该蛋白兼具CFPl0和ESAT-6两种蛋白的抗原性，能特异性区分豚鼠因H37Rv感染和BCG免疫后产生的抗结核分枝杆菌抗体。本研究为rCFPl0-ESAT-6融合蛋白在结核病血清学诊断中的应用奠定了基础。     

结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64单克隆抗体的制备及其特异性

目的 制备结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)分泌蛋白MPT64的单克隆抗体(Monoclonal antibody,mAb),并分析mAb的特异性。方法 PCR扩增mpt64基因并克隆入pET28a(+)构建原核表达载体;将获得的重组菌株在IPTG作用下诱导表达MPT64蛋白,Western blot验证蛋白表达;亲和层析法纯化目的蛋白。重组MPT64蛋白免疫小鼠,取脾细胞与杂交瘤细胞SP2/0融合,筛选得到阳性杂交瘤细胞系。以该杂交瘤细胞制备小鼠腹水,中压液相色谱仪纯化腹水获得mAb。ELISA法检测获得的mAb的相对亲和力和亚类,Western blot检测mAb的特异性。结果 本研究成功构建原核表达载体pET28a(+)-mpt64并诱导表达了MPT64蛋白。亲和层析法获得纯化的重组MPT64蛋白。该重组蛋白免疫小鼠的脾细胞和SP2/0细胞融合后,经筛选获得能够稳定分泌抗MPT64 mAb的杂交瘤细胞系MPT64-A5B2。中压液相色谱仪纯化小鼠腹水中的MPT64-A5B2 mAb。该mAb的亲和力为2.813×10^-7 g/mL,属于IgG 1亚类。MPT64-A5B2 mAb能特异性识别Mtb中的MPT64蛋白。结论 本研究制备了MPT64重组蛋白,并获得了抗MPT64 mAb,为MPT64用于结核病诊断和治疗制剂的研制奠定了基础。     

三种结核分枝杆菌分泌蛋白的抗体制备及其在抗原检测中的应用

目的制备结核分枝杆菌CFP10-ESAT-6、MPT64和MPT63-MPT70重组蛋白抗体，探讨其在检测结核抗原中的应用价值。方法应用重组蛋白CFP10-ESAT-6、MPT64和MPT63-MPT70免疫血清，制备包被抗体和标记抗体，建立检测3种蛋白的双抗体夹心法，并将其用于17种分枝杆菌培养上清液和341份临床血清标本的检测。结果CFP10-ESAT-6的最低检出浓度为25ng／mL，MPT64和MPT63-MPT70均为50ng／mL。CFP10-ESAT-6检测17种分枝杆菌培养上清液，只有结核分枝杆菌为阳性；而MPT64和MPT63-MPT70检测除结核分枝杆菌阳性外，还各有5种非结核分枝杆菌培养上清液为阳性结果。CFP10-ESAT6、MPT64和MPT63-MPT70检测165例临床诊断的肺结核患者血清标本阳性率分别为33．9％、41．2％和47．9％；检测112例非结核患者血清标本的假阳性率分别为1．8％、7．1％和10．7％；检测64例健康对照的假阳性率分别为0、3．1％和7．8％。结论CFP10-ESAT-6、MPT64和MPT63-MPT70重组蛋白制备的抗体检测血清标本结核抗原的阳性率均不高，但特异性较好。     

CFP10-ESAT6融合蛋白用于结核分枝杆菌感染诊断ELISA方法的初步研究

目的 制备结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白,探讨CFP10-ESAT6融合蛋白在结核分枝杆菌免疫诊断中的应用价值。方法 PCR扩增得到CFP-10、ESAT6基因片断,将其先后克隆入pET-28a表达载体。优化表达条件、用镍亲和层析的方法纯化带His标签的重组CFP10-ESAT6融合蛋白(rCFP10-ESAT6)。制备兔多克隆抗体,建立rCFP10-ESAT6为抗原的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,以健康者血清为对照,检测170例结核患者血清的抗体。结果 重组质粒 pET28a-CFP10-ESAT6靶基因测序结果与预计设计完全一致。融合蛋白在E.coli BL21(DE3)工程菌中均为可溶性表达,表达量占菌体总蛋白的40%。利用金属螯合亲和层析直接纯化重组蛋白,纯度达到95%以上。Western blot分析表明,重组蛋白能与结核患者血清发生特异性免疫结合反应,与健康者血清不发生反应。CFP10-ESAT6的兔多克隆抗体的效价为1∶8 000,CFP10-ESAT6作为包被抗原的检测结核病人血清中特异性抗体的间接ELISA最佳包被浓度为0.002 μg/mL,患者血清的最佳稀释度为1∶500。检测结果与临床诊断的符合率,ELISPOT>ELISA(rCFP10-ESAT6)>ELISA(kit)。结论 CFP10-ESAT6融合蛋白具有较高的抗原特异性和免疫反应性,有可能成为结核病免疫学诊断的特异抗原,对结核的诊断具有重要参考价值。     

结核分枝杆菌早期分泌抗原ESAT-6的高效表达及其在结核分枝杆菌特异细胞免疫检测中的应用

目的 获得纯化的MTB早期分泌抗原ESAT-6,并对其抗原性及在MTB特异性细胞免疫检测中的应用价值进行评价.方法 采用基因工程技术表达MTB ESAT-6蛋白,通过Western blot法分析ESAT-6与特异性抗体的反应性.以纯化ESAT-6为抗原,用酶联免疫斑点技术(Elispot)检测肺结核患者、健康医务工作者、自然村居民外周血γ-干扰素的应答水平,同时与用于隐性结核感染及结核病诊断的QFT-G检测法进行平行比较,对其在MTB感染细胞免疫检测中的应用价值进行评价.结果 成功表达和纯化了 ESAT-6重组蛋白,所表达的蛋白能被特异性抗ESAT-6抗体识别,同时与肺结核外周血单核细胞反应,刺激后者产生γ-干扰素.Elispot技术检测肺结核患者、健康医务工作者、自然村居民的阳性率分别为36/49(73.5%)、11/62(17.7%)、17/194(8.8%),同时用QFT-G法对肺结核患者和健康医务工作者进行检测阳性率分别为38/49(77.6%)、14/58(24.1%),两种检测方法比较敏感度(73.5%,77.6%;χ2=0.381,P>0.05)和特异度(82.3%,75.9%;χ2=0.406,P>0.05),差异无统计学意义.结论 利用pET原核表达系统可成功地表达和纯化MTB ESAT-6重组蛋白,以ESAT-6为抗原建立的Elispot外周血IFN-γ检测技术与QFT-G的特异性和敏感性相当,可用于结核病的辅助诊断.     

结核分枝杆菌重组蛋白Rv0222的表达及血清学鉴定

目的 构建Mtb重组蛋白Rv0222的重组质粒,评价其用于结核病血清学诊断的价值。方法 通过PCR从Mtb染色体基因组中扩增出Rv0222基因片段,插入pMD18-T载体后,再亚克隆入表达载体pET30a中,诱导表达重组菌,组氨酸标签（His-tag）亲和层析纯化蛋白,通过免疫印迹法分析重组蛋白的免疫反应性,通过间接ELISA方法检测142例血清样本,来自82例结核病患者（痰涂片或痰培养阳性,抗结核治疗症状减轻者）,28例非结核病患者（8例肺癌、15例肺炎和5例肺气肿）和32例健康体检者,检测数据通过专业医学软件MedCalc 11.5.0分析ROC曲线下面积和最佳阳性判定值。 结果 成功构建重组载体,重组蛋白Rv0222经电泳后显示相对分子质量约为27 000,镍柱纯化后蛋白纯度达95%以上,通过蛋白免疫印迹法证实重组蛋白Rv0222与结核病患者血清能特异性结合。酶联免疫检测ROC曲线下面积为0.893,最佳阳性判定值为0.12时,结核病患者组抗体检测敏感度为69.5%（57/82）,非结核病患者和健康体检者抗体检测特异度为90.0%（54/60）,结核病患者与非结核病患者及健康体检者相比,差异有统计学意义（t=25.78,P＜0.0001）。结论 成功构建pET30a-Rv0222表达载体,获得高纯度的重组蛋白Rv0222,ELISA结果显示Rv0222蛋白有望成为结核病血清学诊断的有效抗原之一。     

结核分枝杆菌38kD-16kD融合蛋白克隆表达及血清学诊断价值

目的构建重组结核分枝杆菌38kD-16kD融合蛋白,评价其在结核病血清学诊断方面的价值。方法通过聚合酶链反应扩增获得16kD和38kD基因片段,分别连接到表达载体pET21a中,同时将2片段两次连接到表达载体pET21a中,形成38kD-16kD(3816),16kD, 38kD重组载体;经表达、纯化和复性后,通过Western blot分析,以酶联免疫吸附试验检测184例血清抗体,肺结核患者96例、非结核肺部疾病患者50例,正常对照38例。结果成功构建重组质粒pET21a-3816,表达蛋白经SDS-PAGE后显示相对分子质量约为65kD,重组蛋白经镍柱纯化后,纯度均达90%以上;经Western blotting证实重组蛋白能与结核病患者血清反应;重组蛋白3816血清检测,其敏感性为80.2%(77/96),特异性为90.9%(80/88)。结论成功表达和纯化了3816融合蛋白,其对血清学检测证明重组融合蛋白有希望成为结核病血清学诊断的有效候选者之一。     

结核分枝杆菌MPT64蛋白的表达、纯化及初步应用

目的　获得重组MPT64蛋白,研究其免疫学特性,评价其在结核病血清学诊断中的价值。方法 应用基因工程技术表达、纯化MPT64蛋白,通过Westernblotting分析其抗原性。分别以结核分枝杆菌PPD或纯化的rMPT64蛋白为抗原,通过ELISA方法及结核病一步法检测血清中抗结核抗体。结果 重组质粒pET15b MPT64测序表达除83位密码子由CCA突变为CCG外,其余密码子均与报道的相同,但其氨基酸序列无变化。它在大肠杆菌BL21 (DE3)细胞内以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的20～30%,分子量约26kDa,Westernblotting分析它与抗结核分枝杆菌多克隆抗体具有良好的免疫反应性。纯化后的rMPT64样品经SDS PAGE和光密度扫描分析表明其纯度约为80%左右,每100ml培养菌可获得10mg左右的重组蛋白。以33例正常人血清的OD值 +2S为正常界限值,PDD的特异性和敏感性分别为94% (31/33)、63.7% (21/33)、66.7%;rMPT64纯化蛋白分别为94% (31/33)、30.3(10/33);一步法分别为88% (29/33)、66.7% (22/23)。结论 pET15b MPT64大肠杆菌工程菌能以包涵体形式高效表达重组MPT64蛋白,该蛋白具有较高的抗原特异性和免疫反应性。rMPT64纯化蛋白有可能成为结核病血清学诊断的组合抗原之一。     

重组结核杆菌融合蛋白(EC)临床应用专家共识

中国是结核病高负担国家之一,结核病发病例数与潜伏性结核感染(latent tuberculosis infection,LTBI)人数庞大,给我国结核病防控工作带来了巨大的挑战。有效识别结核病和LTBI对控制结核病疫情有重要意义。菌阴肺结核和LTBI的诊断依赖于结核感染的免疫学诊断方法;现行结核感染免疫学检测方法主要是结核菌素皮肤试验(tuberculin skin test,TST)、γ干扰素释放试验(interferon gamma release assays,IGRA)和抗原抗体检测。在现行的三类方法基础上,研发出了敏感度高、特异度强、试验操作简单、可用于LTBI和结核病诊断的新产品和新技术——重组结核杆菌融合蛋白(EC)[该制品名称是国家药典委员会确定的药品中文通用名称,“EC”为重组融合蛋白“结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)”](简称“EC”)。目前,已完成EC的Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期临床试验。其中Ⅲ期临床试验中对1559名健康人群的筛查中发现,EC与IGRA的检测结果具有较高的特异度,且两者之间具有较高的一致性(88.77%);对791例临床诊断为结核病患者的临床研究发现,EC、结核感染T淋巴细胞斑点试验(T-SPOT.TB)、结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)检测均具有良好的敏感度,且三者之间具有较高的一致性;对479名未感染结核分枝杆菌人员的研究发现,EC与T-SPOT.TB的两次检测阴性一致率较高(88.20%和93.17%);在卡介苗接种对检测结果影响的研究中发现,EC和T-SPOT.TB基本不受卡介苗的影响;对394例临床诊断非结核性疾病患者的临床研究发现,EC与T-SPOT.TB阴性符合率较高,且一致性较好(87.21%)。基于EC在用于诊断结核感染安全且有效的基础上,EC通过了国家药品监督管理局药品审批而准予上市。经广泛征求有关结核病防控、临床和研究等领域的专家意见,在系统总结相关技术和方法的应用特点的基础上,结合EC的临床试验结果,形成了EC临床应用的专家共识。本共识介绍了EC的临床应用建议,包括使用对象、使用方法、结果判读,以及临床意义和使用范围。     

结核分枝杆菌PPE19的克隆及其GST融合蛋白的表达和鉴定

目的构建结核分枝杆菌PPE19的GST融合蛋白表达载体,并鉴定其在大肠杆菌中的表达。方法以结核杆菌H37Rv基因组为模板,根据PPE19基因序列设计引物,运用PCR的方法获得PPE19基因,并将其克隆到pGEX-kg载体中,转化大肠杆菌DH5α,挑取阳性菌落进行质粒的酶切和序列分析;将构建正确的克隆进行诱导表达,对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析;用western-blot鉴定融合蛋白的表达。结果正确构建了pGEX-PPE19原核表达载体,载体上基因序列正确;载体能在大肠杆菌中表达分子量约为70 kDa的重组蛋白;该蛋白能与GST抗体结合。结论成功构建了GST-PPE19融合蛋白的表达载体,为进一步进行PPE19蛋白的功能研究奠定了基础。     

重组结核杆菌融合蛋白(EC)产品质量标准的建立

目的 建立重组结核杆菌融合蛋白(EC)[该制品名称是国家药典委员会确定的药品中文通用名称,“EC”为重组融合蛋白“结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)”;简称“EC”]原液及成品的质量标准。方法 选取6批次EC原液及11批次EC成品、体质量300~400g无特定病原体(SPF)级白色豚鼠21只、卡介苗(BCG)活菌菌液(1mg/ml)、结核分枝杆菌减毒株H37Ra活菌菌液(2mg/ml)作为实验材料,建立EC原液质量标准,包括残余抗生素活性检测、致敏效应实验、效价测定及动物法鉴别实验;建立EC成品质量标准,包括鉴别实验及效价测定;应用建立的质量检测标准对连续6批次EC原液和11批次EC成品进行检测,验证其适用性和可行性。结果 (1)EC原液残余抗生素活性检测。①专属性实验:磷酸盐缓冲液的吸光度值(A值)为1.736,卡那霉素标准品(0.0ng/ml)的A值为2.178;②线性与范围实验:卡那霉素标准品在0.5~40.5ng/ml范围内,连续3次实验回归方程拟合优度的判定系数R²均大于0.99;③准确性实验:连续3批次EC原液的卡那霉素残留量回收率分别为112.163%、117.285%、103.527%;④重复性实验:连续3批EC原液重复性实验A值相对标准偏差(RSD)分别为5.59%、9.18%、8.07%;⑤中间精密度实验:同一实验员不同时间及不同实验员检测连续3批次EC原液卡那霉素残留量检测均小于定量限0.5ng/ml,为限量测定;⑥耐用性实验:改变读板时间(0、5、10min)对EC原液卡那霉素残留量检测无影响,卡那霉素残留量均小于定量限0.5ng/ml。(2)EC原液效价测定:稀释度为1μg/ml(5U/ml)、2.5μg/ml(12.5U/ml)、5μg/ml(25U/ml)及10μg/ml(50U/ml)时,每个稀释度对应的2批次EC原液动物皮肤试验的硬结或红晕平均直径及硬结或红晕平均直径总和比值分别为(15.17±0.88)mm、(13.67±1.25)mm、1.11(91.00/82.00);(17.00±1.76)mm、(16.08±1.32)mm、1.06(102.00/96.50);(19.58±1.69)mm、(17.67±1.37)mm、1.11(117.50/106.00);(20.75±1.57)mm、(20.25±1.17)mm、1.02(124.50/121.50)。(3)EC原液动物法鉴别实验:连续3批次EC原液动物皮肤试验的硬结或红晕平均直径均为0,TB-PPD动物皮肤试验的硬结平均直径为(15.13±5.06)mm。(4)EC成品鉴别试验:连续3个批次EC成品动物皮肤试验的硬结或红晕平均直径均为0,TB-PPD动物皮肤试验的硬结平均直径为(16.50±2.65)mm。(5)质量标准验证:①EC原液:残余抗生素活性检测结果均低于定量限0.5ng/ml;致敏效应实验结果均为皮肤试验后豚鼠注射部位局部反应无明显区别,也无全身反应;每个稀释度[2.5μg/ml(12.5U/ml)、5μg/ml(25U/ml)及10μg/ml (50U/ml)]在皮内注射后24h所产生的局部硬结或红晕反应平均直径均≥8mm,与相应稀释度参考品的局部硬结或红晕平均直径总和的比值为0.9±0.1;动物法鉴别实验结果为EC原液对BCG活菌致敏组豚鼠的皮肤试验结果均呈阴性反应(硬结或红晕平均直径<5mm),而TB-PPD呈阳性反应(硬结平均直径≥5mm)。②EC成品检测:各批次成品对BCG活菌致敏组豚鼠的皮肤试验均呈阴性反应(硬结或红晕平均直径<5mm),而TB-PPD呈阳性反应(硬结平均直径≥5mm)。结论 所建立的质量标准可用于EC原液及成品的检定。     

结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的　构建结核分枝杆菌早期分泌蛋白Ag85B和MPT6 4融合基因 (AM )及其原核表达质粒并进行表达。方法　采用 geneSOEing法将ag85b和mpt6 4用疏水甘氨酸接头 (Gly4Ser) 3 融合 ,经限制性内切酶切后克隆入原核表达载体pET32a中 ,进行酶切、PCR鉴定和DNA序列测定。将重组质粒转染Ecoli BL2 1,经过IPTG诱导后其表达产物进行SDS -PAGE和免疫印迹分析。结果　AM融合基因定向克隆入 pET32a中 ,双向测序验证碱基突变率为 0 11% (2 / 170 7) ,均为无意义突变。SDS -PAGE和免疫印迹分析结果均显示在约 73kDa的位置可见明显的蛋白条带。结论　成功地构建了ag85b -mpt6 4融合基因及其原核表达质粒 ,重组质粒能够在大肠杆菌在中表达。     

重组结核杆菌融合蛋白(EC)的稳定性与有效性研究

目的考察重组结核杆菌融合蛋白(EC)[该制品名称是国家药典委员会确定的药品中文通用名称,"EC"为重组融合蛋白"结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)"](以下简称"EC")原液的储存稳定性、成品储存及使用的稳定性与有效性。方法 (1)原液储存稳定性研究:将3批次EC原液储存于-70℃,观察0～36个月,保存0、3、6、9、12、18、24、36个月时取样进行致敏效应试验、鉴别试验、效价检测,以及等电点、分子量、蛋白质含量、纯度(电泳法)等检测,其中致敏效应试验用豚鼠分为试验组(注射EC原液)与对照组(注射稳定剂),观察注射后动物反应,两组动物反应应无差异;鉴别试验为卡介苗致敏后豚鼠分别皮内注射EC原液和结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD),观察测量豚鼠皮肤试验检测结果,EC原液皮肤试验应呈阴性反应(硬结或红晕平均直径<5mm),而TB-PPD皮肤试验应呈阳性反应(硬结平均直径≥5mm);效价检测为结核分枝杆菌活菌致敏后6只豚鼠分别皮内注射3个稀释度的EC原液及参考品,观察测量豚鼠皮肤试验检测结果,不同稀释度的EC原液与参考品皮肤试验局部...