青海省2010--2012年H3亚型流感病毒HA1基因特性研究

目的了解2010～2012年青海省H3亚型流感病毒HA1基因变异情况,评价2010～2012wH0推荐流感疫苗株对当地H3亚型流感的预防效果。方法随机选择20J0～2012年流感病原监测中分离到的H3亚型流感毒株,提取病毒RNA,采用RT—PCR法扩增病毒HAl皋㈨,纯化产物进干亍核仟酸序列测定,采用MEGA4．0软件时其核苷酸序列及所推导的氨基酸序列进行基因特性分析。结果与2010～2012年WHO推荐疫苗株A／Perth／16／2009相比,青海省2010年H3亚型分离株有5～6个位点发生氨基酸替换,其中N81D处于抗原决定簇E区;2011年分离株有7个位点发生氨基酸替换,I。157S处于抗原决定簇BI式;2012年分离株有9个位点发生氨基酸替换,K144N和A198S、N278K分别处于抗原决定簇A区和B区,并在第45和144位增加了2个糖基化位点。结论2010～2012年青海省H3亚型流感病毒HA1基因发生不同程度的变异;2010～2012年wH（）疫苗株A／Perth／16／2009对2010和2011年H3亚型流感的预防有效,对2012年H3亚型流感的预防效果不够理想。     

2006年福州市乙型流感病毒血凝素基因特性研究

目的探究2006年福州市流行的乙型流感病毒血凝素基因变异特点及种系进化分布。方法采用狗肾传代细胞培养分离流感病毒,用血凝和血凝抑制试验进行流感病毒型和亚型鉴定,选取部分乙型流感病毒株提取病毒RNA,采用逆转录-聚合酶链反应扩增乙型流感病毒血凝素基因,扩增产物经纯化后,进行血凝素基因HA1区核苷酸序列测定并推导出其氨基酸序列,然后用DNASTAR MegAlign序列分析软件进行基因种系进化特性分析。结果2006年福州市人群中同时流行着乙型Yamagata系和Victoria系毒株。Victoria系毒株为主要优势流行株。2006年分离的Yamagata系毒株与B/Shang-hai/361/02比较,在血凝素基因HA1区发生6-7个氨基酸替换,在196位增加一个糖基化位点。2006年分离的Victoria系毒株与B/Zhejiang/2/01比较,在HA1区发生8-9个氨基酸替换,在197位增加一个糖基化位点。结论2006年福州市人群中流行的乙型流感病毒与B/Shanghai/361/02和B/Zhejiang/2/01相比基因特性已发生了进一步改变。     

珠海市2007-2008年乙型流感病毒基因特性分析

目的了解珠海市近两年乙型流感病毒的基因变异情况。方法采集珠海市流感样病例样本进行流感病毒的分离和鉴定,并对分离到的乙型流感病毒进行核酸的提取,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增病毒基因后进行病毒血凝素HA1基因核苷酸序列测定,用Mega、DNA Star、GeneDoc软件对测序结果进行分析处理,并与WHO推荐的疫苗株基因序列进行比对。结果 2007-2008年分离的乙型流感毒株分属于Yamagata系和Victoria系两个谱系,谱系内毒株间距离很近。Yamagata系毒株与B/Brisbane/3/2007的核苷酸同源性极高,在99.4%~99.7%之间;Victoria系乙型流感病毒株与B/Malasia/2506/2004的核苷酸同源性亦很高,在98.6%~99.1%之间。与疫苗株和其它流行株相比,本次分离的两个谱系毒株均未发现核苷酸的丢失和插入,但均增加一个潜在的糖基化位点。结论珠海市人群交替流行着Yamagata系和Victoria系两个抗原性不同的进化系的乙型流感病毒,病毒的基因发生了变异。2007-2008两年WHO推荐的乙型流感疫苗株与我地区当年流行株为不同谱系毒株,预防保护效果不好。     

2012年邯郸市乙型Yamagata系流感病毒HA1基因变异分析

目的研究邯郸市2012年流感监测中分离的Yamagata系乙型流感毒株HA1的抗原性和基因特性,阐明HA1基因的变异与流感流行的关系。方法用MDCK细胞分离培养流感病毒,提取病毒核酸,采用RT-PCR方法特异性扩增病毒HA1基因,进行核苷酸序列测定,用DNAStar中Megalign软件进行分析。结果2012年分离的Yamagata系乙型流感病毒与2008~2009年代表株B/Florida/4/2006相比亲缘关系较远,核苷酸同源性为96.2%~96.8%,氨基酸同源性为96.5%~97.4%,HA1区9个位点氨基酸发生替换,其中6个参与抗原表位构成;与WHO推荐的2012~2013年疫苗株B/Wisconsin/01/2010相比亲缘关系近,核苷酸同源性为98.8%~99.4%,氨基酸同源性为97.4%~98.5%,有5个位点发生氨基酸替换,其中3个参与抗原表位的构成;与国家流感中心提供的标准抗血清的血凝抑制滴度≥1︰640。结论邯郸市2012年分离的Yamagata系乙型流感病毒血凝素蛋白HA1与B/Florida/4/2006相比已形成新的变种,与B/Wisconsin/01/2010相比也发生了新的变异,但尚不能确定是否形成Yamagata系有代表性的新变种。     

甲型流感病毒H1N1亚型HA基因的克隆及序列分析

目的克隆甲型流感病毒H1N1亚型血凝素HA基因,并对其进行序列分析。方法利用TRIzol Rea-gent法提取甲型流感病毒H1N1亚型的总RNA,RT-PCR后以其cDNA为模板PCR扩增HA基因,经酶切、连接后,构建pET 28a(+)-HA重组质粒。利用生物信息学工具对HA的核酸序列和蛋白功能结构进行分析。结果成功构建了pET 28a(+)-HA重组质粒,经序列比对,与GenBank上公布的HA基因序列同源性达到99%。结论对HA基因进行克隆及生物信息学的分析,为深入研究HA在病毒侵入细胞及抗原变异中的作用机制及后续HA抑制剂的体外筛选奠定基础。     

A/深圳/1/99(H3N2)病毒抗原性及基因特性研究

目的　了解A/深圳 /1/99(H3N2 )病毒抗原性和基因特性 ,为促进深圳地区流感监测水平和流感病毒基因库建立提供科学资料。方法　鸡胚传代病毒 ,收获尿囊液作为抗原性分析抗原并提取病毒的RNA ,进行逆转录 -聚合酶链式反应(PT -PCR) ,扩增产物用纯化试剂盒纯化后测序 ,用MegAlign软件进行基因种系发生树分析。结果　A/深圳 /1/99(H3N2 )病毒抗原与其他毒株均存在着差异 ;他的HA1蛋白分子上共有 8个潜在的糖基化位点 ,除比A/武汉 /35 9/95 (H3N2 )病毒多了一个外 ,与其他毒株均相同 ;基因发生树分析表明 ,它与A/福建 /15 1/2 0 0 0毒株最相近 ,其次最接近的为A/莫斯科 /10 /99毒株。结论　A/深圳 /1/99(H3N2 )毒株为A/福建 /15 1/2 0 0 0类似株 (国内代表性毒株 )分离出时比后者早     

甲型流感病毒H1N1 HA 蛋白在果蝇S2 细胞中的表达及免疫原性研究

目的 在果蝇S2细胞表达甲型流感H1N1 HA并分析其免疫原性。方法 根据GenBank发表的甲型流感病毒（H1N1）HA基因序列,经过密码子优化,全基因合成编码HA的基因,并于其N端引入特定的空间折叠序列,定向连接至表达载体pMT/ Bip/ V5-His A,构建重组表达载体pMT-HA。酶切鉴定正确后,用脂质体转染法与辅助质粒pCoHygro 共转染果蝇S2细胞,潮霉素加压筛选稳定细胞系,在无血清培养基中以硫酸铜溶液诱导表达,SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定,经镍柱纯化后免疫小鼠,ELISA检测其诱导的特异性抗体水平。结果 获得了稳定表达HA的S2细胞株,目的蛋白以分泌形式表达于上清,并形成三聚体,可以被H1N1 HA 抗体识别;免疫小鼠后可诱导机体产生抗HA特异性抗体。结论 获得了纯化的三聚体形式表达的HA蛋白,并具有较好的免疫原性,具有很好的疫苗应用前景。     

2014-2015年商洛市流感病毒H3N2亚型血凝素(HA1)基因进化研究

目的分析2014-2015年度商洛市流感监测病毒血凝素(HA)基因变异情况并研究与推荐疫苗的匹配性。方法收集2014-2015年商洛市流感监测平台用狗肾传代细胞(MDCK)培养分离的H3N2亚型毒株,利用RT-PCR方法扩增分离HA片段,进行核苷酸序列测定,应用clustax2.1软件进行序列比对后,用Mega6.0软件构建系统发育进化树,系统进化树采用Neighboring-joining方法进行分析。结果 2014-2015年度分离的流感H3N2毒株同源性在97.2%~99.9%,与推荐疫苗株A/Texas/50/2012同源性为97.3%~98.5%;将分离毒株的HA1基因氨基酸与疫苗株比较,发现2014年毒株主要抗原决定簇氨基酸变异点有B区Y159F、S198P;2015年主要抗原决定簇氨基酸变异点有A区G142R,B区S159F、S198P。结论2014-2015年度商洛市流感H3N2亚型毒株关键抗原决定簇已经出现改变,A/Texas/50/2012作为疫苗组分已经不是最佳,亟需对我国流感H3N2亚型疫苗组分进行更新,应密切关注流感H3N2基因进化趋势。     

2017—2019年新疆B型流感病毒NA基因研究

目的分析2017年10月—2019年9月新疆B型流感病毒NA基因,为流感NAI抑制剂的使用提供依据。方法选取2017年10月—2019年9月分离的9株B/Yamagata系毒株和13株B/Victoria系毒株,采用逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)扩增病毒NA基因后测定核苷酸序列,用MEGA 5.0,CExpress和BioEdit生物软件分析测序结果、基因特性并建树。结果13株Victoria系B型毒株与疫苗株B/Brisbane/60/2008核苷酸同源性为97.9%~100.0%,核苷酸进化树显示,13株Victoria系B型毒株与疫苗株为同一分支,且远离国外B型流感耐药株B/North Carolina/03/2011 I21V和B/North Carolina/11/2010 I21V;9株Yamagata系B型毒株与疫苗B/Phuket/3073/2013株核苷酸同源性为96.4%~99.9%;9株Yamagata系B型毒株与疫苗株为同一分支,且远离国内耐药株B/Beijing-Xicheng/11496/2011 D197N和国外B型流感耐药株B/Ontario/006876/2011 H273Y;所有毒株的NA蛋白酶催化位点和辅助位点,均未发现耐药位点的替换。结论2017—2019年新疆B型流感病毒NA基因未发生耐药位点突变,与对应疫苗株的核苷酸同源性较高,仍对NAI抑制剂敏感;应继续加强流感监测。     

2016年福建省B型流感病毒基因特征分析

目的 分析2016年福建省B型流感病毒(Influenza Virus)血凝素(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Neuramidinase,NA)的基因变异。方法 从中国疾病预防控制信息系统采集日期2016.1.1至2016.12.31的福建省流感监测数据。毒株来源2016年福建省流感网络监测流感样病例,提取病毒(犬肾传代细胞或鸡胚培养分离)核酸进行RT-PCR扩增HA和NA基因片段并测序,MEGA5.0分析基因特征。结果 测序51株B型流感病毒HA、NA片段,与疫苗株核苷酸同源性在97.8%~100%。 研究发现2株重配株(BY-NA/BV-NA)、耐药株1株、Victoria系HA片段新增一个糖基化位点(197),酶活性中心和周围的相关位点氨基酸仍保持高度保守。结论 2016年福建省B型流感毒株少数发生变异与疫苗株不匹配。     

2007年深圳市Yamagata系B型流感病毒基因特性的分析

目的分析2007年深圳市Yamagata系B型流感病毒血凝素(HA)基因的特性。方法将2007年深圳市分离到的Yamagata系B型流感毒株进行血凝素HA片段核苷酸序列测定并推导出其氨基酸序列,用SIMMONIC软件和Mega软件对其进行分析。结果2007年在深圳市流行的Yamagata系B型流感病毒根据197-199位氨基酸的差异可以划分为A、B、C3个分支。分支C在197位上有糖基化位点的增加,而分支A、B则未在该区域呈现出糖基化位点的特征性结构。此外与今年的国内代表株B/Fujianxinluo/54/06相比,除了40号位点上的氨基酸变异为共同存在外,其余大多数的氨基酸点变异是散发存在的。部分的变异位点处在HA1区的抗原表位,可能会导致病毒的抗原性改变。结论2007年在深圳市流行的Yamagata系B型流感病毒与B/Fujianxinluo/54/06相比基因特性已发生变化,并呈现出多样性的变化趋势。     

山东省2017—2018年B型流感病毒药物敏感性检测及神经氨酸酶基因特征分析

目的 检测山东省2017-2018流感监测年度B型流感病毒对神经氨酸酶抑制剂的药物敏感性,分析其神经氨酸酶(NA)基因特征。方法 选取山东省2017—2018年分离的18株B型流感病毒(Yamagata系16株,Victoria系2株),通过生物学耐药实验检测病毒对奥司他韦和扎那米韦的药物敏感性。提取病毒核酸后一步法RT-PCR扩增NA基因片段,双向测定核苷酸序列,对基因序列和氨基酸序列特征比对分析。结果 在检测的18株B型流感病毒中,有1株Yamagata系病毒对奥司他韦和扎那米韦2种药物的敏感性均降低,此株病毒的NA基因发生H274Y位点突变。其余15株Yamagata系病毒和2株Victoria系病毒均为奥司他韦及扎那米韦的敏感株。结论 随机选取的18株B型流感病毒中大多数病毒对神经氨酸酶抑制剂敏感,临床上可继续使用此类药物对流感患者进行治疗。应加强耐药性监测,警惕耐药株的出现。     

Molecular genetic characteristics of influenza A virus clinically isolated during 2011‐2016 influenza seasons in Korea

Background

The influenza virus is reportedly associated with 3‐5 million cases of severe illness and 250 000‐500 000 deaths annually worldwide.

Objectives

We investigated the variation of influenza A virus in Korea and examined the association with death.

Methods

A total of 13 620 cases were enrolled in the Hospital‐based Influenza Morbidity & Mortality surveillance system in Korea during 2011‐2016. Among these cases, a total of 4725 were diagnosed with influenza using RT‐PCR (influenza A; n = 3696, influenza B; n = 928, co‐infection; n = 101). We used 254 viral sequences from the 3696 influenza A cases for phylogenetic analysis using the BioEdit and MEGA 6.06 programs.

Results

We found that the sequences of A/H3N2 in the 2011‐2012 season belong to subgroup 3C.1, whereas the sequences in the 2012‐2013 season pertain to subgroup 3C.2. The sequences in the 2013‐2014 and 2014‐2015 seasons involve subgroups 3C.3a and 3C.2a. The A/H1N1pdm09 subtype belongs to subgroup 6 and contains two clusters. In addition, sequence analysis confirmed the several substitutions of internal genes and gene substitutions associated with drug resistance (I222V in NA and S31N in M2) in the fatal cases. While statistical analysis found no significant associations between genetic differences in the viruses and mortality, mortality was associated with certain host factors, such as chronic lung disease.

Conclusions

In conclusion, influenza A virus clade changes occurred in Korea during the 2011‐2016 seasons. These data, along with antigenic analysis, can aid in selecting effective vaccine strains. We confirmed that fatality in influenza A cases was related to underlying patient diseases, such as chronic lung disease, and further studies are needed to confirm associations between mortality and viral genetic substitutions.     

两株B型流感病毒的基因组序列分析

目的 了解两株B型流感病毒的基因组序列特征。方法 对两株B型流感病毒进行全基因组序列测定和基因进化特性的分析。结果 成功扩增出两株B型流感病毒的全基因组序列,并且两毒株的基因组均属于Yamagata系类似株Ⅱ系。两株病毒的基因组序列与疫苗株B/Florida/4/2006(Yamagata系)以及Victoria系代表株B/Brisbane/60/2008、B/Malaysia/2506/2004相比,HA基因同源性为89.7%～97.3%,NB基因同源性则为95.4%～98.4%。两株病毒的HA蛋白与WHO推荐的疫苗株B/Florida/4/2006(Yamagata系)相比,存在11处氨基酸突变,其中HA的N131K氨基酸位点突变,可能对抗原性产生影响。NB的S198N氨基酸位点突变可能影响神经氨酸酶抑制剂的灵敏度。结论 两株B型流感病毒的遗传进化状态稳定,但是与同分支中的毒株基因序列部分位点存在差异。     

流感病毒蛋白糖基化及其功能研究进展

甲型流感病毒容易发生变异,可以引发局部或全球范围的流行。每次流感病毒新型别的出现都对人类健康和社会经济产生极大的危害,其一直是研究的热点。本文对甲型流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)两种蛋白糖基化及其功能、研究方法等方面进行综述。