绵羊CTLA-4胞外区对细粒棘球蚴EG95抗原的免疫佐剂作用

目的探索绵羊细胞毒性T细胞相关抗原-4(cytotoxic Tlymphocyte-associated antigen4,CTLA-4)胞外区靶向提呈羊细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)EG95抗原的可行性。方法用RT-PCR扩增CTLA-4胞外区编码序列,插入原核表达载体pET-30a获得融合表达载体pET-IgV;根据蛋白质二级结构分析结果 ,用PCR扩增EG95亲水区编码序列,将串联的3拷贝EG95编码序列分别插入表达载体pGEX-6P-1和pET-IgV,诱导重组大肠杆菌表达并纯化重组蛋白;用相同剂量的GST-3EG95、IgV-3EG95包涵体或可溶性蛋白免疫小鼠,比较EG95抗体的应答水平。结果用RT-PCR扩增得绵羊CTLA-4胞外编码区,IPTG诱导的重组大肠杆菌表达预期的约63kDa GST-3EG95和60kDa IgV-3EG95融合蛋白,两者均能被EG95抗血清识别;经两次免疫后,IgV-3EG95免疫组的EG95抗体水平显著高于GST-3EG95免疫组,可溶性蛋白的免疫效果优于包涵体。结论绵羊CTLA-4胞外区可作为分子佐剂促进细粒棘球蚴EG95抗原的抗体应答水平。     

重组SARS病毒M蛋白的免疫效应研究

目的 检测SARS冠状病毒重组M蛋白疫苗诱导小鼠的免疫应答能力。方法 PCR扩增M蛋白基因，构建至原核表达质粒pET-23a，pET-23a-M重组质粒转化BL21（DE3）宿主菌，诱导表达蛋白经SDSPAGE、免疫印迹分析和纯化后免疫BALB／c小鼠，3次免疫后测定免疫功能，进行免疫效果评价。结果 成功构建pET-23a—M重组质粒，转化宿主菌后诱导表达27kuM蛋白。检测M蛋白免疫鼠体内有特异性抗体产生，抗体效价达1，10^4；脾脏CD8^＋比例升高，CD4^＋／CD8^＋比值下降；免疫鼠血清IFN-y／和IL-4水平无显著变化。结论 SARS病毒重组M蛋白疫苗能诱导BAI。B／c小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫应答。     

细粒棘球绦虫Eg95基因疫苗和重组抗原诱导小鼠免疫应答的比较研究

目的观察比较细粒棘球绦虫Eg95重组抗原和基因疫苗诱导小鼠的免疫应答状况。方法实验组和对照组小鼠分别注射Eg95重组抗原(rEg95)、费氏佐剂(FCA)、pcDNA3-Eg95基因疫苗、pcDNA3质粒和生理盐水,收集各组血清用酶联免疫吸附(ELISA法)检测抗体IgG和IgG2a亚类水平;采集脾细胞用四甲基偶氮唑盐试验(MTT法)检测免疫小鼠的脾淋巴细胞增殖反应。结果rEg95免疫组小鼠在第二次免疫后开始检测到抗Eg95抗原的IgG,并随着免疫次数的增多,血清抗体效价升高,在第1次免疫后第10周时,免疫抗体滴度可达到1∶25,600。Eg95基因疫苗免疫的小鼠产生抗体滴度随免疫次数的增加而升高,最高可达1∶3,200,但是低于Eg95重组蛋白免疫小鼠产生的抗体滴度水平。pcDNA3-Eg95免疫组产生IgG2a亚类抗体水平明显高于对照组和rEg95组。在第四次免疫后,进行淋巴细胞转化试验,MTT法检测证实rEg95和pcD-NA3-Eg95免疫的小鼠,其脾细胞均可在体外被特异性刺激增生。结论细粒棘球绦虫Eg95重组抗原和基因疫苗均可诱发小鼠产生特异性免疫应答。     

细粒棘球绦虫(中国大陆株)诊断抗原P-29基因的表达、纯化及免疫原性初步分析

目的对细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,Eg)诊断抗原P-29(diagnostic antigen P-29)重组质粒进行原核表达、纯化,并初步分析重组蛋白的免疫原性。方法从重组质粒EgP-29/pGEM-T中获取诊断抗原P-29基因,亚克隆于表达载体pET-28a构建基因工程菌株,并表达、纯化重组蛋白,经Western-blot、ELISA分析重组蛋白的免疫原性。结果成功构建原核重组表达载体EgP-29/pET-28a/BL21(DE3)plysS,并纯化出浓度较高的重组蛋白。ELISA检测显示,用表达、纯化的重组蛋白免疫小鼠,诱导产生了特异性抗体IgG,Western-blotting鉴定该抗体能识别重组抗原及天然抗原原头蚴。结论重组蛋白具有良好的免疫原性。     

约氏疟原虫重组裂殖子表面蛋白免疫原性的研究

目的 检测约氏疟原虫裂殖子表面蛋白C端相对分子质量为41 000重组蛋白的抗原性和免疫原性,对其抗虫感染效果进行评价,为疟疾DNA疫苗的研究提供基础资料.方法 采用重组表达质粒pPGEX-2T-PyMSP1在大肠杆菌中表达的融合蛋白,免疫BALB/c小鼠,2周后用约氏疟原虫子孢子感染小鼠.用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定抗MSP1抗体滴度,MSP1融合蛋白特异性免疫反应测定,MSP1对小鼠免疫保护作用.结果 免疫11 d后抗体水平开始上升,到42 d达到最高峰,各时段抗体滴度分别为:第11天1:2 183、第21天1:38 115、第42、63、86和第124天均维持在1:798 560水平;ELISA检测免疫后第21天小鼠抗MSP1的IgG、IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3,其405 nm波长的吸光度(A405)依次为1.82±0.61、0.33±0.05、2.35 ±0.77、1.14±0.40、2.22±0.58、0.18±0.02.免疫后的小鼠体内产生特异性保护免疫,子孢子攻击感染20 d后,原虫密度有较快的下降.结论 所表达的重组约氏疟原虫裂殖子表面蛋白,具有一定的抗原性和免疫原性,能够诱导小鼠产生特异性保护抗体,并且该抗体能够维持在较高的水平.     

细粒棘球绦虫原头节抗原分子Eg-01883的克隆、表达及免疫原性分析

目的筛选细粒棘球蚴原头节抗原分子Eg-01883,并进行克隆、表达及免疫原性分析,为寻找棘球蚴病特异性诊断抗原提供依据。方法分析已发表的细粒棘球绦虫mRNA测序数据,筛选六钩蚴中不表达、原头节中高表达的抗原分子Eg-01883。提取细粒棘球蚴原头节总RNA,用RT-PCR对目的基因Eg-01883进行克隆,重组构建原核表达载体p ET28a-Eg-01883,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并纯化目的重组蛋白r Eg-01883。ICR小鼠随机分为3组(每组12只),免疫组小鼠的背部皮下多点注射r Eg-01883,2周后加强免疫1次(剂量均为10μg,100μl/只);佐剂组注射福氏佐剂和PBS,空白对照组不作任何处理。分别于免疫前,首次免疫后1、2、4周每组小鼠尾静脉采血,免疫后6周进行去眼球采血。用ELISA检测3组小鼠免疫后不同时间点的血清特异性Ig G抗体水平,及细胞因子白介素4(IL-4)和γ干扰素(IFN-γ)水平。蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白r Eg-01883的免疫原性。结果筛选出在细粒棘球蚴原头节中高表达的抗原分子Eg-01883,克隆、表达和纯化后获得重组蛋白r Eg-01883,该蛋白主要以包涵体形式存在。ELISA检测结果显示,用纯化后的重组蛋白r Eg-01883免疫小鼠,可诱导产生特异性Ig G抗体,免疫组小鼠的血清Ig G抗体水平自首次免疫后1周开始上升,6周时达到最高水平(2.344±0.153),显著高于佐剂组(0.206 1±0.006)和空白对照组(0.241±0.01)(P0.01)。首次免疫后6周,血清中的细胞因子IFN-γ和IL-4水平,免疫组分别为43.23 pg/ml和24.88 pg/ml,均显著高于佐剂组(21.77 pg/ml,13.27 pg/ml)和空白对照组(17.40 pg/ml,12.25 pg/ml)(P0.05)。Western blotting分析结果显示,该重组蛋白r Eg-01883抗原可被His-Tag标签抗体、免疫组小鼠血清、原头节继发感染的小鼠血清识别。结论筛选获得细粒棘球绦虫原头节中高表达的抗原分子Eg-01883,克隆、表达、纯化后的重组蛋白r Eg-01883免疫ICR小鼠具有较好的免疫原性。     

解脲脲原体半胱氨酸脱硫酶的表达、纯化及免疫活性研究

目的表达、纯化解脲脲原体(Uu)半胱氨酸脱硫酶(IscS),分析其免疫活性。方法构建解脲脲原体重组质粒pET28a-IscS,转化至E.coli BL21 (DE3),使用IPTG诱导目的蛋白表达。收集细菌,裂解过夜后超声破碎、离心,分别取上清和沉淀进行12%SDS-PAGE分析。采用最佳表达条件大量诱导目的蛋白表达,使用Ni-NTA柱纯化目的蛋白。用纯化的重组IscS蛋白免疫BALB/c小鼠,获得免疫血清,Western blot鉴定目的蛋白的免疫原性,采用ELISA和淋巴细胞增殖等方法分析重组IscS蛋白的免疫学活性。结果成功构建重组质粒pET28a-IscS,转化DE3后在37℃、IPTG终浓度0.8 mmol/L诱导6 h为最佳诱导表达条件,目的蛋白表达量较大,12%SDS-PAGE电泳检测其相对分子质量约为45.7×10~3,与预期大小相符合。亲和层析纯化得到单一条带的重组蛋白,Western blot和ELISA检测该蛋白,能刺激BALB/c小鼠产生高滴度的特异性抗体,且IgG2a抗体水平高于IgG1。重组IscS蛋白免疫小鼠能诱导脾淋巴细胞发生增殖反应,并产生高水平的IFN-γ,诱导以Th1为主的细胞免疫应答。结论重组表达的解脲脲原体半胱氨酸脱硫酶蛋白具有免疫原性,可望成为Uu蛋白疫苗靶点。     

3株嗜吞噬细胞无形体AnkA蛋白原核表达及免疫原性差异性研究

目的 研究分析3株嗜吞噬细胞无形体AnkA蛋白的免疫原性。方法 利用原核表达PCR扩增了嗜吞噬细胞无形体Webster株,斯洛文尼亚1 567株,美国96HE58株ankA 基因部分序列,构建pET-30a-AnkA表达载体,转化至大肠杆菌BL21中,以IPTG诱导高效表达融合蛋白,经飞行质谱鉴定氨基酸序列,免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。Western blot分析3株菌AnkA重组蛋白与免疫小鼠血清抗体相互间的免疫反应以及交叉反应性。同时检测3株菌AnkA重组蛋白与我国无形体病人血清抗体反应性。结果 表达的重组蛋白主要以可溶性形式存在,小鼠免疫获得高效价抗AnkA IgG抗体,3株菌重组蛋白免疫抗体间存在免疫交叉。3株菌重组蛋白与我国无形体病人血清抗体存在免疫反应。结论 成功原核表达并纯化了3株嗜吞噬细胞无形体AnkA蛋白,重组蛋白与我国无形体病人阳性血清存在免疫反应。3株嗜吞噬细胞无形体AnkA重组蛋白与免疫小鼠多克隆抗体间存在交叉反应。     

恶性疟原虫重组蛋白HGXPRT免疫原性及免疫保护作用的研究

目的 探讨在毕赤酵母中表达的恶性疟原虫重组蛋白次黄嘌呤-鸟嘌呤-黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HGXPRT）诱导小鼠产生的免疫原性和免疫保护作用。 方法 35只BALB/c小鼠随机分为HGXPRT+ISA720实验组、HGXPRT+福氏佐剂试验组、ISA720对照组、福氏佐剂对照组和空白对照组等5组。HGXPRT（50 μg/200 μl）经小鼠后腿皮下免疫3次，间隔3周。每次免疫后2周尾静脉采血，ELISA检测血清特异性抗体水平。以间接免疫荧光试验（IFAT）分析免疫血清对恶性疟原虫天然抗原的识别情况。于末次免疫后10 d，各组小鼠经腹腔攻击感染约氏疟原虫致死株10⁵个，继而每隔1 d采尾血制薄血片，观察原虫感染的动态变化。 结果 重组蛋白HGXPRT经与佐剂乳化后免疫的小鼠均诱导出针对HGXPRT的体液免疫应答，3次免疫后血清中特异性抗体滴度达到1∶10⁵以上，而两佐剂组和空白对照组小鼠均未产生特异性抗体。经HGXPRT诱导血清能识别恶性疟原虫天然HGXPRT抗原。经约氏疟原虫致死株攻击感染后4 d，两佐剂对照组和空白对照组疟原虫感染高峰相比实验组提前1 d。HGXPRT+ISA720实验组平均原虫率（29.3%）明显低于ISA720对照组（70.0%）和空白对照组（70.0%）（P<0.05）；HGXPRT+福氏佐剂实验组平均原虫率（51.0%）亦明显低于福氏佐剂对照组（60.7%）与空白对照组（70.0%）（P<0.05）。 结论 恶性疟原虫重组蛋白HGXPRT对小鼠有较强的免疫原性，产生的抗体能识别恶性疟原虫HGXPRT天然蛋白，并对疟原虫攻击感染后的小鼠有一定免疫保护作用。     

刚地弓形虫ROP2-P30复合重组蛋白疫苗对BALB／c小鼠免疫保护性的研究

目的用刚地弓形虫ROP2-P30复合重组蛋白疫苗免疫BALB/c小鼠观察对机体的影响,为研制安全有效的弓形虫疫苗奠定基础。方法PCR方法从刚地弓形虫基因组中扩增出ROP2和P30片段,将这两个片段分别亚克隆至pET-30a原核表达载体中,表达出ROP2-P30复合重组蛋白。用蛋白疫苗免疫BALB/c小鼠,ELISA检测免疫小鼠后体液中抗体和细胞因子的变化,观察攻击试验小鼠的的死亡率。结果ROP2-P30复合重组蛋白疫苗免疫BALB/c小鼠诱导机体产生大量的IgM、IgG抗体和IFN-γ、IL-2及IL-4细胞因子。攻击试验表明,复合重组蛋白免疫组和对照组相比,小鼠的存活时间明显延长。结论ROP2-P30复合重组蛋白免疫BALB/c小鼠诱导其产生高水平的体液和细胞免疫应答,该复合重组蛋白是抗刚地弓形虫感染的候选疫苗之一。     

Delivery of Echinococcus granulosus antigen EG95 to mice and sheep using recombinant vaccinia virus

The tapeworm Echinococcus granulosus is the causative agent of hydatid disease and affects sheep, cattle, dogs and humans worldwide. It has a two‐stage life cycle existing as worms in the gut of infected dogs (definitive host) and as cysts in herbivores and humans (intermediate host). The disease is debilitating and can be life threatening where the cysts interfere with organ function. Interruption of the hydatid life cycle in the intermediate host by vaccination may be a way to control the disease, and a protective oncosphere antigen EG95 has been shown to protect animals against challenge with E. granulosus eggs. We explored the use of recombinant vaccinia virus as a delivery vehicle for EG95. Mice and sheep were immunized with the recombinant vector, and the result monitored at the circulating antibody level. In addition, sera from immunized mice were assayed for the ability to kill E. granulosus oncospheres in vitro. Mice immunized once intranasally developed effective oncosphere‐killing antibody by day 42 post‐infection. Antibody responses and oncosphere killing were correlated and were significantly enhanced by boosting mice with either EG95 protein or recombinant vector. Sheep antibody responses to the recombinant vector or to EG95 protein mirrored those in mice.     

Antigenic differences between the EG95‐related proteins from Echinococcus granulosus G1 and G6 genotypes: implications for vaccination

Cystic echinococcosis caused by Echinococcus granulosus remains an important and neglected issue in public health. The study of the likely efficacy of the currently available EG95 vaccine against other genotypes of the parasite is important to improve the vaccine as a potential tool to be used in control programmes. The recombinant vaccine EG95‐1G1 was developed based on the G1 genotype of E. granulosus. Characterization of the eg95 gene family in the G6 genotype by genomic DNA cloning previously produced the first unequivocal information about the composition of the gene family in a different genotype. The information was used in this study to predict and express two EG95‐related proteins from the G6 genotype as recombinants, for assessment of their capacity to bind antibodies raised in sheep vaccinated with the EG95‐1G1 vaccine. The proteins (EG95‐1G6 and EG95‐5G6) from the G6 genotype of E. granulosus were unable to bind all the antibodies raised by sheep vaccinated with EG95‐1G1. Differences in the amino acid sequence of EG95‐related proteins from G6 and likely the differences in the encoded FnIII domain may be responsible for changes in the conformation of these epitopes.     

伯氏疟原虫顶端膜抗原1胞外区及其亚区的表达与免疫保护作用分析

目的 表达伯氏疟原虫顶端膜抗原1（PbAMA-1）胞外区E及其各亚区，分析其免疫原性和免疫保护作用。 方法 抽提伯氏疟原虫基因组，对PbAMA-1基因测序，依据该序列采用毕赤酵母密码子使用频率重新设计PbA-MA-1基因序列。将其胞外区E分为3个彼此重叠的基因片段DⅠ、DⅡ和 DⅢ并进行优化，人工合成后在大肠埃希菌中诱导表达。表达产物经纯化和重折叠，分别与福氏佐剂乳化后免疫小鼠和家兔, 均免疫3次， 间隔2周。每次免疫剂量, 小鼠为20μg, 家兔为100 μg。ELISA检测抗体效价，并以疟原虫攻击实验确定各抗原的免疫保护效果。 结果 测得的PbAMA-1基因序列与Sanger测序中心公布的序列完全一致。密码子优化并人工合成的DⅠ、DⅡ、DⅢ 和E目的基因片段在大肠埃希菌表达载体pET32a均获得诱导表达，经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，各目的基因表达产物大小与预计的相对分子质量Mr 44 300、Mr 33 300、Mr 29 900和Mr 67 200相一致。表达产物经镍离子螯合柱（Ni-NTA柱）纯化和谷胱甘肽(GSH)氧化还原法体外重折叠，蛋白纯度达90%以上, 各纯化的重组蛋白在小鼠体内均激发产生高滴度抗体。其中，完整的胞外区E第3次免疫后抗体滴度为（34.4±0.15）×10^-4，与其他组相比，免疫原性较其他各亚区更强(t=5.66，P<0.01；t=2.27，P<0.05和t=5.05，P<0.01)。取家兔免疫血清与感染伯氏疟原虫ANKA株的小鼠血膜抗原片进行间接荧光抗体试验(IFAT)，均为阳性，其中抗E的抗血清免疫荧光强度最高，与ELISA检测的抗体水平一致。取家兔抗血清对小鼠伯氏疟原虫粗提抗原进行蛋白质印迹（Western blot）分析，产生特异性反应条带，表明能够识别天然的PbAMA-1蛋白。免疫小鼠在以伯氏疟原虫攻击实验中得到部分保护，DⅠ、DⅡ、DⅢ 和E各免疫组小鼠与佐剂对照组相比，存活时间明显延长(t=2.78，P<0.05；t=2.67，P<0.05；t=3.46，P<0.01和t=3.50，P<0.01)。 结论 人工合成的PbAMA-1具有良好的免疫原性和免疫保护作用，完整的胞外区E较其各亚区表现出更好的免疫原性。     

细粒棘球绦虫EG95基因的克隆和序列分析

目的：获得细粒棘球蚴EG395基因序列资料，进行序列分析，为研究包虫病疫苗候选抗原基因奠定基础。方法：从包囊内获取细粒棘球蚴原头蚴(protoscoleces)，提取RNA和DNA，用特异引物分别以基因组DNA和cDNA为模板扩增EG95基因；并将其克隆到T载体后进行序列测定和分析。结果：以基因组为模板获得一个基因。长度为1253bp，以cDNA为模板获得两个基因，长度分别为1121bp和833bp；同源性比较结果表明：来自新疆羊源EG95基因序列和澳大利亚羊源EG395-2基因同源性为98％，有13个碱基变异；从cDNA获得的EG95基因(EG95-like)和DNA来源的EG95相同，只是EG95序列的一部分；从cDNA获得的另一个EG95基因(mEG95)和澳大利亚源EG395-2同源性为99％，有2个碱基不同。分析表明EG95是一个基因家族，可能是虫体发育到六沟蚴阶段特定表达的基因。结论：EG95是一个基因家族，进一步研究该基因家族的结构和功能对包虫病的免疫预防具有重要意义。     

Elicitation of strong immune responses by a DNA vaccine expressing a secreted form of hepatitis C virus envelope protein E2 in murine and porcine animal models

INTRODUCTION Hepatitis C continues to be a severe health threat to a large population with about 123 million people being affected globally[1]. The etiologic agent, hepatitis C virus (HCV)[2] is able to establish persistent infections in up to 85% of infe…     

HIV-1CN54合成gp120基因(syngp120)的DNA疫苗鼻内免疫小鼠诱导全身的和粘膜的免疫应答

目的 初步探讨HIV-1CN54合成gp120基因的DNA疫苗（pcDNA3.1-syngp120）鼻内接种小鼠是否诱发免疫应答。方法　DNA疫苗免疫后,制备脾和肠系膜淋巴结（MLN）淋巴细胞,在体外测其增殖应答和CD8+CTL应答。间接ELISA法测血清和粘膜洗液抗原-特异的IgG和IgA抗体滴度。中和实验测免疫血清和阴道洗液是否中和 HIV-1SF33。结果 在 DNA疫苗未次免疫后,小鼠第 1周检测到脾和 MLN CD8+CTL应答较弱,而第 5周未检测到。另外,在末次免疫后的第1、5周检测到MLN而未检测到脾淋巴细胞发生增殖应答。并且检测到特异的血清IgG抗体和粘膜的（包括粪便和阴道洗液）IgA抗体,但未检测到血清的IgA抗体和粘膜的（包括粪便和阴道洗液）IgG抗体。中和实验发现末次免疫后第5周的血清能中和实验室毒株HIV-1SF33（B亚型）,而阴道洗液则没有。结论 该DNA疫苗鼻内免疫小鼠可诱导粘膜免疫应答,包括 MLN淋巴细胞增殖应答和 CD8+CTL应答,同时诱导较弱的粘膜IgA抗体应答。此外,能诱导脾CD8+CTL应答和血清IgG抗体应答。免疫血清中和HIV-1S F33,而阴道洗液不能。     

鼠疫菌荚膜抗原和重组rV270抗原免疫小鼠后保护效果观察

目的 对小鼠血清抗体滴度检测和对小鼠的保护力观察,评价鼠疫菌荚膜抗原(F1抗原)和重组rV270抗原对鼠疫的免疫保护效果.方法 40只6～8周雌性Balb/c小鼠,按体质量随机分成4个实验组(F1-10 μg+铝佐剂、F1-20μg+铝佐剂、rV-10 μg+铝佐剂、rV-20 μg+铝佐剂)和1个对照组,每组8只.将天然F1抗原和重组rV270抗原分别吸附到25％铝佐剂中免疫实验组小鼠,对照组小鼠以免疫等量的铝佐剂.每只动物每次后腿肌肉免疫100 μ1,初次免疫后,第21天加强免疫1次.所有动物分别于第1次免疫后第8周采血,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定抗体滴度.同时用2000倍半数致死量(LD50)的鼠疫菌141强毒株皮下攻毒,观察14d,以观察免疫后保护效果.结果 对照组未产生抗体,F1-10 μg+铝佐剂组、F1-20 μg+铝佐剂组的抗体几何平均滴度(GMT)分别为1∶30443.9、1∶21527.8,组间比较差异无统计学意义(t=1.1282,P＞0.05);rV-10 μg+铝佐剂组和rV-20μg+铝佐剂组的GMT分别为1∶13957.3、1∶18100.9,组间比较差异无统计学意义(t=0.9408,P＞0.05).用141强毒株皮下攻毒后,实验组小鼠全部存活,对照组8只小鼠全部死亡.结论 实验用天然F1抗原及重组rV270抗原具有较高的免疫活性,可作为鼠疫亚单位疫苗的主要组分用于鼠疫亚单位疫苗的研究.