含胎肌条件培养液的DMD原代肌组织培养体系的建立

应用含胎肌条件培养液的培养体系对 DMD 和正常肌组织进行原代培养。经倒置相差显微镜、透射电镜和 Desmin 免疫细胞化学技术鉴定,显示该培养体系能使肌组织成肌细胞生长并大量繁殖,分化良好,全部形成肌管。提示含胎肌条件培养液的培养体系能激活正常人及患者的肌卫星细胞,具有良好定向培养肌细胞的能力。     

胎儿肌肉来源细胞的分离及其成肌分化研究

目的 观察胎儿肌肉来源细胞(flMDC)体外成肌分化能力以及在mdx鼠体内再生抗肌营养不良蛋白.方法 使用舍10％新生牛血清的DMEM/F12培养液,采用预贴壁方法从胎儿肌肉组织中分离fMDC.采用免疫染色鉴定肌肉特异标志的表达.肌内注射fMDC到6.5 Gy照射3d后的mdx小鼠股直肌,1个月后采用免疫荧光染色法和RT-PCR方法检测人抗肌营养不良蛋白和基因的表达.结果 采用预贴壁方法可从胎儿肌肉组织中分离到贴壁生长、梭型的flMDC.可在fMDC的一些长纤维细胞包浆中检测到MHC的表达,在一些细胞胞核中检测到成肌素的表达.可在注射fMDC的mdx小鼠肌肉中检测到人抗肌营养不良蛋白和基因的表达.结论 fMDC中存在MHC和成肌素的阳性表达,注射fMDC到照射过的mdx小鼠体内可以再生抗肌营养不良蛋白表达.     

Duchenne型肌营养不良症的CT诊断研究

目的　研究Duchenne型肌营养不良症的CT特点。方法　Duchenne型肌营养不良症患者 30例 ,按照年龄分为 3组 ,1～ 6岁组 8例 ,7～ 12岁组 18例 ,≥ 13岁组 4例。对照组选择 3～ 6 0岁无肌肉疾病者 16 5例。依次对臀肌、大腿、小腿及背肌进行CT检查。结果　患者 3岁时 ,臀肌开始萎缩 ,随着年龄的增长 ,臀肌、大腿、小腿及背肌呈现进行性加重。皮下脂肪增厚 ,各年龄组差异有显著意义。结论Duchenne型肌营养不良症肌肉萎缩的特点主要表现为脂肪替代改变 ;CT可为诊断、病情随访提供客观资料     

成肌性标志物在人骨髓间充质干细胞分化为肌细胞过程中的表达

目的 研究成肌性标志物在人骨髓间充质干细胞(hBM-MSCs)分化为肌细胞过程中的表达情况.方法 体外培养hBM-MSCs,采用免疫荧光法和RT-PCR检测hBM-MSCs中成肌性标志物MyoD、myogenin及desmin的表达.将1×107个hBM-MSCs经尾静脉注入免疫抑制的mdx小鼠体内,于移植后2～24周处死,采用免疫荧光法和RT-PCR检测小鼠骨骼肌内MyoD、myogenin、desmin和人特异性抗肌萎缩蛋白(Dys)的表达. 结果每100个hBM-MSCs中MyoD、myogenin和desmin阳性细胞数分别为23.5±5.3、30.7±6.2和28.4±5.7,第5代hBM-MSCs中可检测到MyoD、myogenin和desmin mRNA表达.hBM-MSCs移植后2周,mdx小鼠骨骼肌内可检测到少量MyoD和myogenin阳性细胞,4周后可检测到少量desmin阳性细胞.hBM-MSCs移植后2～4周,骨骼肌中开始出现MyoD和myogenin mRNA表达,12～16周较强;移植后8周开始出现desmin mRNA表达,16周后表达渐增强.hBM-MSCs移植后4周,mdx小鼠骨骼肌肌膜可见少量人特异性Dys阳性细胞,8周后开始出现Dys mRNA表达,随着移植后时间延长,Dys表达逐渐增强. 结论 hBM-MSCs具有向骨骼肌细胞分化的潜力,能在受体内分化为骨骼肌细胞.在hBM-MSCs分化为肌细胞的过程中,MyoD和myogenin表达上调可能发挥了重要作用.     

Duchenne型肌营养不良症与正常肌组织体外成肌过程的对比研究

应用Ｄｅｓｍｉｎ免疫细胞化学和透射电镜观察体外培养肌管，发现其胞浆Ｄｅｓｍｉｎ染色阳性，肌丝分化形成肌节，表明肌管是体外培养肌细胞的成熟阶段。对９例Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型肌营养不良症（ＤＭＤ）患者和５例正常人肌组织体外培养肌细胞成肌过程进行动态观察，发现ＤＭＤ体外培养肌细胞有一定的生长、成熟能力，９例均能形成肌管，但分裂增殖期明显长于正常人组（Ｐ＜０．０５），分裂增殖晚期细胞明显退变，初生肌管不能进一步成熟。以培养５周为界，ＤＭＤ组所形成的肌管较正常组瘦短且核数少（Ｐ＜０．０５）。ＤＭＤ体外培养肌细胞存在肌管形成的延缓和分化成熟的障碍。     

良性X连锁隐性遗传肌营养不良症的肌肉病理

作者等对一个Becker型肌营养不良症家系中的3名患者与3名递体进行了肌肉活组织检查。3例递体均有肌肉病理改变。肌核变化比收缩部份变化明显,其病变随年龄增长而加重,提示递体的肌肉病变也是缓慢进行的,因病变不重,范围不广,而不足以引起肌力减退。从而或可将递体认为是亚临床病例。患者的病肌变化包括肌纤维粗细不匀、变性、肌管形成、坏死、被噬、纤维化与脂肪浸润等。肌核变化也明显。包括肌核增生,中央肌核,链状排列与成簇等。递体的肌肉,早期出现肌核变化。寻找病损的最早部位,有利于了解病机,在这方面,除肌膜外尚需注意肌核。     

小鼠胚胎成纤维细胞条件培养液的蛋白质组学初步分析

目的：运用双向电泳、质谱技术对小鼠胚胎成纤维细胞饲养层条件培养液进行蛋白质组学分析,寻找其中可能具有抑制分化作用的蛋白因子。方法：用60Co γ-射线照射昆明白小鼠胚胎成纤维细胞,制成饲养层,置于ITS（胰岛素-转铁蛋白-硒钠盐）培养液中培养24h,收集条件培养液。用冷冻干燥、凝胶过滤层析、冷丙酮沉淀的方法从条件培养液中提取蛋白质样品,经双向电泳和银染得到双向电泳图谱,用Image master elite 2.0软件进行图像分析。取蛋白点进行酶解,再用CapLC-ESI-Q-TOF质谱进行分析,使用Mascot软件在NCBInr数据库中进行搜索。结果：双向电泳得到（221±67）个蛋白点的银染图谱,初步分析鉴定13个蛋白点。结论：昆明白小鼠胚胎成纤维细胞条件培养液中含有β-半乳糖苷结合蛋白、半胱氨酸富集的酸性分泌蛋白（SPARC）等成分。     

人子宫旁韧带成纤维细胞原代培养的初步研究

目的:初步探索和建立人子宫旁韧带成纤维细胞原代培养的方法,为盆腔器官脱垂的基础研究提供成熟的体外人盆底成纤维细胞系。方法:临床搜集因盆腔器官脱垂(POP)或非POP的良性妇科疾病而行子宫切除患者的子宫旁韧带(包括主韧带和骶韧带),组织剪碎后采用改良的Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶消化法进行原代培养,待细胞长至贴满培养瓶底面80%以上时,消化传代,对所培养的成纤维细胞进行形态学观察及免疫荧光鉴定其来源。结果:原代培养第3-4天开始,可见有单个成纤维细胞迁出、生长,7-10d时可见少部分细胞逐渐贴壁形成较小的成纤维细胞团,第25天左右多个细胞团生长中心爬出的成纤维细胞互相连接聚集成片,铺满培养瓶底;采用免疫组化染色进行细胞鉴定,细胞波形蛋白表达阳性,角蛋白表达阴性,证实其为成纤维细胞。结论:本研究确立了体外人子宫旁韧带成纤维细胞原代培养,为后续研究POP发病机制提供成熟的体外宫旁韧带成纤维细胞。     

人肌源干细胞体外成骨作用的实验研究

目的探讨人肌源性干细胞(MDSCs)的分离、培养、鉴定及体外成骨作用,为临床应用提供实验依据。方法采用消化法分离MDSCs,应用差速贴壁法纯化干细胞,免疫细胞化学染色对细胞鉴定,MDSCs在骨形态发生蛋白-2(BMP-2)诱导分化后,检测其碱性磷酸酶、骨钙素。结果成功获得高纯度的MDSCs,免疫组织化学方法能够有效鉴定MDSCs,BMP-2诱导MDSCs后能够合成碱性磷酸酶、骨钙素。结论可通过体外原代培养获得高纯度MDSCs,其具有干细胞特征,并能够转化为骨系细胞,发挥成骨作用,为组织工程的临床应用提供种子细胞。     

人皮肤瘢痕成纤维细胞原代培养及其生长曲线的研究

目的 建立可靠的人皮肤瘢痕成纤维细胞培养方法,探索细胞的生长规律,为皮肤瘢痕体外研究提供平台.方法 采用组织块贴壁法原代培养瘢痕成纤维细胞,波形蛋白免疫细胞化学法鉴定成纤维细胞,CCK-8测定细胞生长曲线.结果 人皮肤瘢痕原代成纤维细胞培养成功,细胞形态为长梭形,波形蛋白表达阳性,16～18天可传第1代,以后每7～8天可传1代,传代后5～6天时为活跃期,第7天进入停滞期.结论 培养出的人皮肤瘢痕成纤维细胞在传代后第5～6天最适于于体外实验研究.     

骨髓间质干细胞移植治疗DKO鼠后肌组织的超微结构改变

目的 观察Duchenne型肌营养不良症模型DKO小鼠经骨髓间质干细胞(MSC)移植治疗后肌组织的超微结构改变情况。方法 用体外培养纯化的第五代SD大鼠MSC经尾静脉移植治疗DKO鼠,在移植后15 w取鼠后肢腓肠肌组织进行透射电镜超微结构的观察。结果 传5代后的MSC均一性好,免疫源性低;移植治疗后DKO鼠的运动功能有所改善,生存时间也有延长。肌组织的超微结构观察发现,肌细胞膜断裂、膜下组织分离水肿、核中移、局部肌原纤维松散、炎症细胞浸润和结缔组织增生等病变情况较对照鼠有改善,并出现肌膜下多个幼稚核融合现象。结论 MSC具有强大的可塑性,通过血循环可趋向病变肌组织并参与鼠肌萎缩组织的修复与再生作用。     

DMD免疫缺陷型小鼠模型的建立及其基因型鉴定

目的 建立假肥大型肌营养不良症(DMD)免疫缺陷型小鼠(scid/mdx双基因缺陷型,scid-/-/ mdx-/-),以及其抗肌萎缩蛋白基因(dystrophin)和scid基因的PCR鉴定方法.方法 利用经典遗传学的杂交-互交方法,将非糖尿病-严重联合免疫缺陷(NOD-scid)雄鼠(scid-/-)和mdx雌鼠(mdx-/-)进行交配,提取杂合子F2代小鼠的基因组DNA,对dystrophin以及scid基因进行片段扩增,电泳后观察结果.结果 46只杂合子F2代小鼠中共鉴定出13只dystrophin和scid双基因缺陷型的纯合小鼠,将人骨髓间充质细胞移植入小鼠,能整合分化成骨骼肌细胞.结论 实验成功的得到了DMD免疫缺陷型小鼠,并提供了一种简单快速准确的PCR鉴定方法,为DMD的实验研究中的异种间移植提供了有效的动物模型.     

DMD免疫缺陷型小鼠模型的建立及其基因型鉴定

目的建立假肥大型肌营养不良症(DMD)免疫缺陷型小鼠(scid/mdx双基因缺陷型,scid-/-/mdx-/-),以及其抗肌萎缩蛋白基因(dystrophin)和scid基因的PCR鉴定方法。方法利用经典遗传学的杂交-互交方法,将非糖尿病-严重联合免疫缺陷(NOD-scid)雄鼠(scid-/-)和mdx雌鼠(mdx-/-)进行交配,提取杂合子F2代小鼠的基因组DNA,对dystrophin以及scid基因进行片段扩增,电泳后观察结果。结果46只杂合子F2代小鼠中共鉴定出13只dystrophin和scid双基因缺陷型的纯合小鼠,将人骨髓间充质细胞移植入小鼠,能整合分化成骨骼肌细胞。结论实验成功的得到了DMD免疫缺陷型小鼠,并提供了一种简单快速准确的PCR鉴定方法,为DMD的实验研究中的异种间移植提供了有效的动物模型。     

酶消化组织块法原代培养人牙周膜成纤维细胞的初步研究

目的：提高人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts，HPLF)原代培养的成功率，快速建立体外细胞研究模型．方法：采取组织块与酶消化相结合的方法处理牙周膜组织块，获取细胞；用形态学、免疫细胞化学染色等方法鉴定细胞来源，通过生长曲线的测定研究体外细胞生长特性．结果：原代培养成功率为77．8％．获得的细胞呈梭形，抗波形丝蛋白染色呈阳性，抗角蛋白染色呈阴性，     

Duchenne型肌营养不良症基因携带者检出的血清生化研究

本文测定分析了85名Duchenne型肌营养不良症基因携带者及125名女性正常对照组血清肌酸激酶(CK)、肌酸激酶MB同功酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙酮酸激酶(PK)、肌红蛋白(Mb),结果表明在携带者检出中,单项指标以Mb或CK为佳,联合应用多项指标提高检出效果,以CK、LDH、Mb的组合最为合理。     

人肉芽组织成纤维细胞体外培养体系的建立及其CD分子、蛋白表达研究

目的建立稳定的人肉芽组织成纤维细胞体外分离、培养体系,并探讨其生物学特性,为进一步研究成纤维细胞在人创面愈合中的作用提供参考。方法采用机械法和酶消化法分离培养人创面肉芽组织成纤维细胞,倒置相差显微镜下观察细胞形态及增值情况;分别绘制第3、5、10代细胞生长曲线。应用流式细胞仪(FCM)检测第3代细胞表面标志CD105、CD73、CD90、CD44、CD34、CD45、CD19、CD11b及HLA-DR的表达。取第3代细胞行免疫细胞化学检测vimentin和CK19的表达情况。结果原代培养出的成纤维细胞呈短梭形、多角形或不规则形;体外培养连续多次传代后获得形态较均一的成纤维细胞,以梭形为主,细胞呈放射状排列;细胞增殖良好,第3、5、0代细胞增殖能力无明显差异,有明显的指数生长期,体外能长期培养存活,并保持不分化状态。流式细胞仪检测细胞高表达CD105、CD73、CD90、CD44等间充质干细胞表面标志,不表达CD34、CD45、CD19、CD11b、HLA-DR等造血干细胞表面标志。免疫细胞化学检测vimentin阳性表达,CK19阴性表达。结论建立了稳定的人创面肉芽组织成纤维细胞体外分离、培养体系,获得的成纤维细胞表现出间充质干细胞的CD分子表型,有可能在皮肤创面修复中发挥重要作用。     

胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞生长状况及ABCA3表达变化的初步研究

目的:观察原代培养胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(type Ⅱ alveolar epithelial cell,AECⅡ) 的生长状况及AECⅡ特异性蛋白ATP结合盒转运蛋白A3(ATP binding cassette transporter A3,ABCA3)的表达变化,为有关新生儿肺发育及肺部疾病的研究奠定一定基础?方法:采用胰酶联合胶原酶消化肺组织,差速离心及差速贴壁法纯化细胞;电子显微镜鉴定AECⅡ细胞;倒置相差显微镜观察不同时间点细胞生长状态;MTT法绘制细胞生长曲线;免疫荧光技术观察 ABCA3动态表达变化?结果:电镜下观察到AECⅡ特征性板层小体,大小及数量不等,胞膜外缘分布有刺状微绒毛;MTT法测得铺板后第24?36?48?72?96?120 h的吸光度值分别为0.177 ± 0.009,0.193 ± 0.011,0.212 ± 0.019,0.253 ± 0.019,0.243 ± 0.012,0.192 ± 0.011?光学显微镜下细胞形态逐渐拉长,变扁平,细胞内颗粒逐渐减少?免疫荧光示ABCA3表达逐渐下降?结论:原代培养的胎鼠AECⅡ在培养早期生长状况最佳,ABCA3表达最丰富,故在早期(即培养72 h以内)进行肺发育疾病相关机制的研究较为理想?     

酶联合消化法分离犬心房肌成纤维细胞及其生物学特性的研究

目的探讨适用于犬心房肌成纤维细胞(CAF)体外分离培养及鉴定的技术方法。方法无菌手术取犬左心耳,应用木瓜蛋白酶、Ⅰ型胶原酶联合消化法分离心房肌成纤维细胞并进行体外培养。在倒置显微镜下观察原代心房肌成纤维细胞生长特点;苏木精-伊红(HE)染色观察细胞形态,并对细胞进行纤维连接蛋白、波形蛋白、盘状结构域受体2蛋白免疫荧光染色;通过绘制生长曲线法、2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2-四唑单钠盐(WST-8)法观察细胞的增殖情况;流式细胞仪分析比较各代细胞DNA周期特点;观察不同培养体系对第3代(P3)CAF生长的影响。结果酶联合消化法分离培养的细胞1 d后,可见细胞贴壁呈长椭圆形生长,3 d后生长迅速呈长梭形,7 d后细胞排列成单层,连接紧密;HE染色显示细胞长梭形呈螺旋状排列;免疫荧光检测纤连蛋白、波形蛋白、盘状结构域受体2表达阳性;P1、P2、P3细胞生长曲线近似S形,WST-8法显示P1、P2、P3细胞生长于第3天至第5天光密度值变化较明显,增殖迅速;P1、P2、P3G0/G1的百分率分别为(56.83±1.72)%、(68.10±1.33)%、(68.23±1.33)%,各代之间G0/G1的百分率比较差异无统计学意义(P>0.05);P1、P2、P3(S+G2)/M的百分率分别为(43.17±1.72)%、(31.90±1.33)%、(31.77±1.33)%,各代之间(S+G2)/M的百分率比较差异无统计学意义(P>0.05);杜尔伯克改良伊格尔/F12培养基培养的P3细胞增殖力明显高于RPMI-1640培养基培养的细胞,差异有统计学意义(P<0.05)。结论酶联合消化法可以高效快速分离和稳定培养CAF,为研究犬心房纤维化提供了充足的种子细胞。