NOS 基因转染及反义ET核酸技术防治自体静脉移植再狭窄的研究进展

自体血管旁路移植术是血管外科常用的手术方式 ,是治疗血管狭窄、阻塞的主要手段 ,但由于存在术后血管再狭窄现象 ,直接影响手术的远期疗效 ,严重影响患者生活质量和身体健康。近年来 ,随着分子生物学和血管生物学的飞速发展 ,利用一氧化氮合酶 (ｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅｓｙｎｔｈａｓｅ ,ＮＯＳ)基因及反义内皮素(ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎｓ ,ＥＴ)核酸防治血管再狭窄已引起整个血管外科界的高度重视 ,并在一些侧面展示出十分诱人的研究前景和临床应用价值。现就近几年基因治疗血管再狭窄的研究现状和进展作一综合性回顾。1　狭窄机理自体静脉…     

动脉硬化闭塞症与内皮素、一氧化氮的关系

目的 探讨内皮素（ＥＴ）、一氧化氮（ＮＯ）在动脉硬化闭塞症（ＡＳＯ）形成和发展听 作用及ＥＴ、一氧化氮合酶（ＮＯＳ）基因表达同ＡＳＯ的关系。方法 收集４０例ＡＳＯ病人、１２０处病变血管和３０例正常血管,根据病理学检查分为ＡＳＯ早期、中期、晚期和正常血管４组。利用放射免疫测定法和Ｇｒｉｓｓｅ方法检测ＡＳＯ病脸的血浆ＥＴ和ＮＯ水平,利用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术检测４组血管ＥＴｍＲＮＡＴ     

动脉硬化闭塞症与血管内皮细胞活性因子关系的研究

目的　探讨动脉硬化闭塞症（ＡＳＯ） 与内皮素１（ＥＴ１） 、一氧化氮（ＮＯ） 等血管内皮细胞活性因子的相互关系。方法　选择９６ 例ＡＳＯ 患者，采用密度梯度法检测循环内皮细胞计数（ＣＥＣ），采用放射免疫测定法检测血浆ＥＴ１ 、血栓素Ｂ２（ＴＸＢ２）、６酮前列腺素Ｆ１α（６ＫＰＧＦ１α） ，降钙素基因相关肽（ＣＧＲＰ） 、血管紧张素Ⅱ（ＡＴⅡ）、肿瘤坏死因子（ＴＮＦ），采用酶联免疫检测细胞间粘附分子１（ＩＣＡＭ１）、Ｐ选择素（ＰＳ）。采用Ｇｒｉｓｓ 法检测血浆ＮＯ水平。结果　所有患者均存在高ＥＴ１、ＴＸＢ２ 、ＡＴⅡ、粘附分子、ＣＥＣ血症，存在低ＮＯ、ＣＧＲＰ、６ＫＰＧＦ１α血症，且以Ⅲ期病人最明显。结论　ＡＳＯ 的发生发展同血管内皮细胞活性因子密切相关，ＥＴ１、ＮＯ 等血管活性因子的检测有助于ＡＳＯ发病机制的探讨和病情严重程度的判别。     

中西医结合治疗动脉粥样硬化闭塞症疗效观察

目的：观察动脉粥样硬化闭塞症（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓｏｂｌｉｔｅｒａｎｓ,ＡＳＯ）中西医结合疗效,探讨血浆内皮素（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎｓ,ＥＴ）、一氧化氮（ｎｉｔｒｉｏｘｉｄｅ,ＮＯ）同临床治疗的关系。方法：选择９０例ＡＳＯ患者,采用常用的治疗方法,随机分为中医、西医和中西医结合治疗３组,动态观察治疗过程中的临床表现,同时利用放射免疫测定、亚硝酸盐比色法于治疗前、治疗后１、２、３、４、５个疗程后检测血液ＥＴ、ＮＯ的变化。结果：临床治愈率中西医结合组为４６６７％,中医组为２６６７％,西医组为３３３３％;显著疗效率中西医结合组４３３３％,西医组４０００％,中医组２６６７％。血浆ＥＴ、ＮＯ的改变同ＡＳＯ１～３期存在正相关系,且随ＡＳＯ有效治疗后逐渐恢复,并于临床治愈期接近正常水平。结论：中西医结合治疗ＡＳＯ具有较好的临床疗效,动态观察ＡＳＯ治疗前后ＥＴ、ＮＯ的变化,有助于判断病情轻重,有助于了解疾病进程和效果,具有较大的临床意义。     

ET 1，cmy c在自体静脉移植血管内膜增殖表达意义

为观察内皮素、cmy c在自体移植静脉术后内膜增生中的相互作用，探讨移植静脉术后再狭窄的机制。笔者应用免疫组化技术观察内皮素、cmy c在自体移植静脉术后内膜增生中的表达。结果表明移植静脉术后早期，内皮素1（ET 1）在平滑肌细胞出现阳性表达，术后1周开始增多，到术后2周达高峰，4周开始减少，而cmy c亦在同时期表达，1周后逐渐呈高表达，在移植静脉术后2周后表达逐渐减少，二者与增殖细胞核抗原（PCNA）表达呈一致性改变。ET 1，cmy c术后1~2周表达与早期表达有显著差异（P<0.05 ),ET 1与cmy c呈正相关（r=0.36）。提示在血管移植术后ET 1与cmy c之间存在调控作用，即ET 1可以激活cmy c,使静止期SMC进入增殖期,产生血管平滑肌细胞（SMC）过度增殖,同时表明ET 1可能是cmy c等早期应答基因持续增殖一个重要原因，这也为今后应用ET 1抑制剂加反义cmy c抑制内膜增殖提供了一定的理论依据。     

内皮素受体反义寡聚核苷酸抑制血管平滑肌细胞增殖

血管移植或动脉腔内成形术后 ,常因内膜增厚致血管再狭窄。内皮素 (ＥＴ)在内膜增生中有重要的促分裂效应。我们设计合成含 18ｂｐ的内皮素Ⅰ型受体(ＥＴＡ)和内皮素Ⅱ型受体 (ＥＴＢ)反义寡聚核苷酸 (ＯＤＮｓ) ,探讨ＯＤＮｓ对平滑肌细胞 (ＳＭＣ)上ＥＴ受体 (ＥＴＲ)蛋白表达和ＳＭＣ增殖的影响。1.材料与方法 :主要试剂有ＤＭＥＭ细胞培养液 ;胰蛋白酶 ;12 5Ｉ ＥＴ 1;抗α ａｃｔｉｎ单抗 ;小牛血清 ;ＥＴＡ ＯＤＮｓ和ＥＴＢ ＯＤＮｓ。实验方法 :(1)细胞培养 :无菌状态取 3只家兔主动脉段 ,按文献 [1]方法培养ＳＭＣ ,取 4～ 6代细胞…     

移植血管平滑肌细胞PCNA表达及药物影响的研究

目的　探讨 Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ 等药物对兔静脉移植模型早期增殖细胞核抗原（ Ｐ Ｃ Ｎ Ａ） 表达的影响。　方法　兔颈静脉移植于颈动脉后应用 Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ 、 Ｌ Ｍ Ｗ Ｈ 、 Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ 和 Ｖｅｒａｐａ ｍｉｌ 治疗, 并于不同时间采用免疫组化方法观察血管平滑肌 Ｐ Ｃ Ｎ Ａ 表达的变化。　结果　术后３ 、７ 、１４ 天均有 Ｐ Ｃ Ｎ Ａ 的表达;３ 天时 Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ 、 Ｌ Ｍ Ｗ Ｈ 两组 Ｐ Ｃ Ｎ Ａ 的表达与对照组差异不显著;相反 Ｖｅｒａｐａ ｍｉｌ 及 Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ两组的 Ｐ Ｃ Ｎ Ａ 指数均低于对照及其他两组;术后７ 、１４ 天动、静脉 Ｖ Ｓ Ｍ Ｃ 中的 Ｐ Ｃ Ｎ Ａ 各组的表达均与术后３ 天相同只是强度略有下降;移植静脉 Ｐ Ｃ Ｎ Ａ 指数均略低于相应动脉。　结论　 Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ 、 Ｌ Ｍ Ｗ Ｈ对血管移植后动、静脉 Ｖ Ｓ Ｍ Ｃ 内的 Ｐ Ｃ Ｎ Ａ 表达无影响, Ｖｅｒａｐａ ｍｉｌ 及 Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ 对移植静脉及相应动脉平滑肌细胞的 Ｐ Ｃ Ｎ Ａ 表达有抑制作用     

良性前列腺增生组织NO合酶表达的免疫组化研究

为探讨一氧化氮合酶（ＮＯＳ）在良性前列腺增生（ＢＰＨ）组织中的表达及其意义，采用免疫组化法对２４例ＢＰＨ组织中ＮＯＳ表达进行检测。结果显示：ＮＯＳ在ＢＰＨ组织神经纤维和神经节均有表达，血管内皮细胞和腺体上皮细胞亦可见ＮＯＳ表达。２４例ＢＰＨ中，外周区强阳性１７例，弱阳性７例；移行区强阳性１０例，弱阳性１４例，两者比较有显著性差异（Ｐ＜０．０５）。提示ＢＰＨ组织中存在一氧化氮（ＮＯ）神经传导通路，ＮＯ可影响前列腺平滑肌张力。     

联合转染eNOS基因反义ET核酸对自体移植静脉内膜增生的影响

目的;探讨联合转染eNOS基因和反义ET核酸对自体移植静脉内膜增生的影响。方法：制作20只自体颈静脉腹主动脉移植Wistar大鼠模型,实验组,对照组各10只,实验组移植血管行腺病毒介导的eNOS溶液浸泡和反义ET核酸凝胶涂布,对照组仅行空载腺病毒溶液浸泡和凝胶兴布。术后2周取出移植血管,利用病理学,免疫组织化学,RT－PCR方法检测移植血管内膜厚度,管腔狭窄度,内膜VSMC数及PCNA阳性表达,血管ETmRNA,eNOSmRNA表达情况。结果：实验组移植血管内膜厚度,管腔狭窄及VSMC数均较对照组减小或减少,PCNA阳性表达及ETmRNA表达较对照组减少,而eNOSmRNA表达则明显增加。结论;联合转染NOS基因和反义ET核酸可有效地抑制移植静脉内膜的增生,是一种有效地防治移植静脉再狭窄的基因疗法。     

自体静脉移植再狭窄与MMP-1、MMP-2及TIMP-2的表达

目的：通过测定自体静脉移植术后移植静脉管腔狭窄度、金属基质蛋白酶-1（MMP-1），MMP-2金属蛋白酶特异性抑制剂-2（TIMP-2）的表达，探讨自体静脉移植术后再狭窄与金属蛋白酶家族，（MMps）及其特异性抑制剂（TIMP）s的关系。方法：60只Wister大鼠均行颈静脉腹主动脉移植术，在术后28d后取出移植静脉行病理学检查测量移植静脉管腔狭窄度，根据移植静脉管腔狭窄程度，分成正常、轻、中、重4组，并采用免疫组织化学方法（ABC法）行MMP-1，MMP-2及TIMP-2的检测。结果：静脉移植后，移植静脉出现不同程度的狭窄。在狭窄的移植静脉， MMP-1、MMP-2和TIMP-2高水平表达；静脉狭窄程度越重，MMP-1、MMP-2和TIMP-2表达强度越高，MMP-1、MMP-2的升高幅度高于TIMP-2的升高幅度。结论：自体静脉移植术后移植血管再狭窄的发生和发展与MMPs及TIMPs的表达失衡密切相关。     

内毒素对血管内皮细胞分泌功能的影响

目的　探讨内毒素对脐静脉内皮细胞分泌功能的影响。方法　选择体外培养的人脐静脉血管内皮细胞（ＨＵＶＥＣ）为研究对象,分别用内毒素、Ｌ左旋精氨酸和硝基左旋精氨酸进行处理,并检测上清液中内皮素１（ＥＴ１）和一氧化氮（ＮＯ） 含量。结果　内毒素使ＥＴ１ 和ＮＯ 含量增加;ＮＯ 则使ＥＴ１的含量降低。结论　内毒素能导致人脐静脉内皮细胞损伤,使ＥＴ１ 和ＮＯ的合成和释放增加;ＮＯ则抑制ＥＴ１ 的合成和释放。     

内皮素、一氧化氮与阻塞性黄疸肾功能障碍关系的实验研究

目的 研究内皮素(Endothelin ET)、一氧化氮(Nitric Oxide NO)与阻塞性黄疸(Obstructive Jaundice OJ)肾功能障碍的关系。方法 雄性SD大鼠胆总管结扎后随机分成5天、10天、15天三组，同时建立对应的假手术对照组。观察肾功能的变化，同时测定血和肾组织ET、NO水平及一氧化氮合酶(Nitric Oxide Synthetase NOS)活性，并用图像分析检测ET—1mRNA和NOS—mRNA表达的部位和量的变化。结果 随胆总管梗阻时间的延长，血和肾组织ET升高，NO下降，ET／NO比值与内生肌酐清除率(Creatinine clearance rate Ccr)、肾皮质血流(Renal cortex blood flow RCBF)呈负相关。肾组织ET—1mRNA和iNOS mRNA表达增加，血和肾组织NOS活性降低。结论 血和肾组织ET升高，NO下降，ET／NO比值升高是导致OJ时肾功能损伤的原因之一。     

休克期切痂对血浆内皮素及NO水平的影响

目的观察烧伤休克期切痂和休克期后切痂对血浆内皮素及一氧化氮水平的影响。方法利用小型猪制成３５％Ⅲ度烧伤动物模型，分为两组，休克期切痂组（Ｓ组）于伤后２４小时切痂，对照组（Ｃ组）于伤后９６小时切痂，分别检测血浆内皮素（ＥＴ）、一氧化氮（ＮＯ），并计算ＥＴ／ＮＯ。结果两组ＥＴ及ＮＯ均高于伤前，伤后９６小时开始Ｓ组ＥＴ明显低于Ｃ组；而ＮＯ水平Ｓ组明显高于Ｃ组；ＥＴ／ＮＯ亦显示伤后２４小时开始Ｓ组明显低于Ｃ组。结论休克期切痂可减轻内皮细胞损伤，减轻渗出与水肿，减少组织缺氧，改善微循环     

阻塞性黄疸时L-精氨酸对肾功能的保护作用

目的：研究阻塞性黄疸（OJ）时，L－精氨酸（L－Arg)对肾功能的保护作用。方法：胆总管结扎大鼠30只，随机分成生理盐水对照（NS）组、L－精氨酸（L－Arg)组和L－硝基精氨酸（L－NNA）组，每组10只。胆总管结扎后第2天起分别腹腔注射1ml NS、1ml L-Arg(500mg/kg)、1ml L-NNA(10mg/kg)，连用9d；假手术（SO）组用1ml NS腹腔注射。观察各组肾功能的变化，同时测定血和肾组织内皮素（ET）、一氧化氮（NO）水平、一氧化氮合酶（NOS）活性和丙二醛（MDA）的含量。并用图像分析检测ET1 mRNA和NOS mRNA表达的部位及量的变化。结果：用L－Arg后，血和肾组织NOS活性增加，肾组织ET1 mRNA表达减少，血和肾组织ET下降，NO升高；同时伴有内生肌酐清除率（Ccr)、肾皮质平均血流（RCBF）的升高，肾组织MDA含量降低。结论：L－Arg通过增强血和肾组织NOS活性来增加体内NO水平、抑制ET1 mRNA表达、降低体内ET水平，从而提高Ccr与RCBF，减轻阻塞性黄疸时的肾功能损伤。     

一氧化氮在糖尿病肾病中的作用

目的探讨糖尿病（ＤＭ）和高血压大鼠肾脏一氧化氮（ＮＯ）途径与ＤＭ肾病的关系。方法将自发性高血压大鼠（ＳＨＲ）制成链脲佐菌素（ＳＴＺ）ＤＭ模型。设ＷＫＹ、ＳＨＲ和ＳＨＲＤＭ三组。除形态学观察外,还测定各组大鼠肌酐清除率（Ｃｃｒ）、２４小时尿蛋白、血及肾组织ＮＯ含量、肾脏ＮＯ合成酶（ＮＯＳ）活性和ＮＯＳｍＲＮＡ表达水平。结果ＳＨＲＤＭ组大鼠２４小时尿蛋白定量２０周时明显高于其余两组,Ｃｃｒ无明显改变。血ＮＯ水平升高,肾ＮＯ含量降低。肾脏结构型ＮＯＳ（ｃＮＯＳ）活性下降,诱导型ＮＯＳ（ｉＮＯＳ）活性或ｉＮＯＳ／ｃＮＯＳ（ｉ／ｃ）比值增加。肾小球ＮＯＳｍＲＮＡ表达面积扩大,入球动脉及小叶间动脉ＮＯＳ基因表达明显下降。肾小球系膜增生,有形成ＫＷ结节或纤维蛋白帽的趋势,系膜区基质增多,基底膜增厚,肾小动脉壁厚腔窄。结论（１）ＳＴＺＳＨＲＤＭ模型出现的２４小时尿蛋白增加、肾小球系膜及肾小血管病变提示ＤＭ肾病的产生;（２）肾脏ＮＯ系统异常与ＤＭ肾病有关。     

Nitric oxide synthase and renin–angiotensin gene expression and NOS function in the postnatal renal resistance vasculature

Nitric oxide (NO), produced by nitric oxide synthase (NOS), critically counteracts angiotensin-II-enhanced vascular resistance in the immature kidney, perhaps due to the developmental regulation of NOS expression and function in the postnatal preglomerular resistance vessels (PRV). Our experiments measured the messenger ribonucleic acid (mRNA) gene expression of neuronal NOS (nNOS), endothelial NOS (eNOS), and components of the renin-angiotensin system (renin, AT1 and AT2 receptors), by real-time RT-PCR, as well as NOS enzymatic activity by citrulline assay in PRVs (afferent, interlobular, and arcuate arterioles) obtained from swine ages newborn, 7 and 21 days, and adult. NOS enzymatic activity was upregulated in PRVs immediately after birth but decreased to adult levels with maturation. Neuronal NOS, renin, and AT2 receptor expression in PRVs were upregulated in the newborn and decreased with age to lowest levels in the adult. In contrast, eNOS and AT1 receptor expression were downregulated at birth but increased to the highest levels in the adult. Upregulated NOS enzymatic activity in newborn PRVs supports the critical neonatal role for NO renal vascular vasodilation. Upregulated nNOS gene expression, concomitant with downregulated eNOS gene expression in neonatal PRVs, suggests that the nNOS isoform may be responsible for counteracting angiotensin II increased vascular resistance in immature porcine PRVs.     

原发性肝细胞癌中WAF1/CIP1基因的表达及其临床病理意义

目的　探讨原发性肝细胞癌（ＨＣＣ）中ＷＡＦ１／ＣＩＰ１ 基因ｍＲＮＡ 的表达与临床病理学指标的关系和意义。方法　采用半定量ＲＴＰＣＲ方法,检测ＷＡＦ１／ＣＩＰ１ 基因在３０ 例ＨＣＣ及其癌旁肝组织中的表达。结果　肝癌组织ＷＡＦ１／ＣＩＰ１ｍＲＮＡ 表达相对值低于其相应癌旁肝组织［（１ ．１０±０ ．４３）Ｕ 对（１．３１±０．４１）Ｕ,Ｐ＜０ ．０５］ ,有卫星灶形成的肝癌低于无卫星灶形成的肝癌［（０．８６ ±０．２９）Ｕ 对（１ ．３２ ±０．４４）Ｕ,Ｐ＜ ０．０１］ ,但其在ＨＣＣ的其他病理学指标中差异无显著性（ Ｐ＞０ ．０５） 。结论　ＷＡＦ１／ＣＩＰ１ 基因的表达异常可能参与ＨＣＣ的发生、发展,并与肝癌细胞的浸润和转移分子机制有关。