清除聚合酶链反应扩增产物污染的方法探讨

聚合酶链反应(PCR)具有操作简便、灵敏度高和特异性强等优点。但也常因标本受PCR扩增产物污染而产生假阳性结果。因此，控制外源性DNA污染已成为各实验室非常关注的问题。近年来，人们采用了许多方法消毒处理不同的污染环境和污染物，但结果报导不一。为选择一种消除实验室DNA污染的最佳方法，我们选用六种传统的消毒法进行对比研究。现将结果报告如下。     

提高PCR检测结果可信性的措施

PCR技术问世以来在一些疾病病原学的诊断方面得到了广泛的应用。高灵敏度和高特异性是PCR技术的最大特点，该技术已渗透到分子生物学的各个领域。PCR技术看似易于操作，但由于PCR技术在我国应用时间还不长，且影响因素和环节较多，在实际工作中已遇到不少问题，如假阴性、假阳性，结果的可靠性等，这些质疑对操作人员和临床医师都存在着困惑。因此，要使PCR这一具有强大生命力的技术健康发展，提高PCR检测结果可信性已势在必行。现将如何提高PCR检测结果可信性的一些措施报告如下。1、实验室要求1．1实验室布局：为了避免PCR实验…     

三种沙眼衣原体检测方法的对比评价

目的：探讨聚合酶链反应(PCR)、免疫层析法(C-C快速法)和糖原试验检测泌尿生殖道沙眼衣原体感染的诊断价值。方法：用三种方法分别对102例送检标本进行平行检测。结果：以PCR法作参比，免疫层析法敏感性为86．7％，特异性为97．7％；糖原试验敏感性为80．0％，特异性为96．6％。结论：PCR法有较高灵敏度，免疫层析法有一定灵敏度和专一性，基层医院可以采用。     

快速诊断结核杆菌感染的PCR方法的实验室应用

[目的]寻找一种即能提高检出的阳性率，又能减少污染环节而导致假阳性，取材方便，操作简单，便于推广的临床标本进行PCR扩增，来进行结核病的实验室快速诊断。[方法]对经X-线、胸片、痰抗酸染色、痰BLL-MGIT快速培养及临床诊断确诊为结核病例40例的痰、全血、外周血单个核细胞进行TB-Ab、PCR的检测比较。[结果]痰液中的结核杆菌-DNA的PCR检出率高达70％，而同一患者外周血分离单个核细胞的阳性率仅为40％。同一血样中TB-Ab与全血PCR方法扩增全血中所有的模版DNA，两方法之间具有显著性差异。全血PCR与外周血单个核细胞PCR比较，二者的阳性率具有显著性差异（P=0．001〈0．01），以全血细胞PCR检测阳性率最高。结核杆菌感染者红细胞粘附功能明显增加，与正常对照组比较县有显著性差异。[结论]检测结核病患者全血细胞TB的PCR实验方法可能为结核杆菌感染的早期、有效的实验室指标。     

临床聚合酶链反应（PCR）测定的质量控制

我国临床PCR检测即将恢复，但在检测项目方面考虑临床实际需要将逐项放开，首批开放的检测项目有：结核分枝杆菌，沙眼衣原体、乙型肝炎病毒DNA及丙型肝炎病毒RNA、HLA。临床基因扩增实验室开展PCR检测这些项目，对其整个检测过程进行质量控制，可以保证其特异性与敏感性，防止假阴性与假阳性的发生。PCR的质量控制是质量保证的前提，同时质量控制涉及到整个基因扩增检测的所有阶段，即测定分析前的标本采集、运输、处理、实验室的基本条件、试剂质量、测定中的核酸提取，扩增和产物分析以及测定后的结果报告等。现将PCR测定的各环…     

FQ—PCR检测尿道炎病原体的临床应用及评价

目的：为临床提供一次反应可同时检测5由奈瑟氏淋球菌（NG）、解脲支原体（UU）及沙眼衣原体（CT）引起的淋菌性尿道炎和非淋菌性尿道炎的荧光定量PCR实验方法。对不同的试剂盒进行评价、比较，优化其荧光定量PCR反应条件。方法：在一次荧光定量PCR反应中，利用任意一套标准品同时检测三种病原体，进行X^2检验。将同样的标本分别用三种不同试剂盒试验，将结果进行X^2检验。优化反应条件，比较结果有无差异，进行t检验。结果：用同一厂家试剂盒的一套标准品分别同时检测三种病原体，统计学处理无显著差异，无统计学意义。P〉0．05。三个厂家试剂盒无明显差异，P〉0．05。将某些反应条件优化，结果无显著影响，t=1．1806，P〉0．05。结论：优化反应条件后既节省时间，又减少标准品的使用量，为临床提供了快速、简便、经济的检测方法。每种试剂盒都可检测出病原.     

树状DNA杂交技术在HCV检测中的应用

目的：建立一种敏感性,特异性,重复性较好的,适同原体群体筛查的检验方法。方法：通过RT－PCR－DDH,RT－nested-PCR和HCV RNA－DDH3种方法检测HCV核酸,推断RT－PCR－DDH技术检测病毒核酸的特异性,敏感性和稳定性。结果：47份ELISA检测HCV抗体阳性血清标本,RT－nested-PCR检出阳性标本33例（70．21％）,RT－PCR－DDH检出阳性标本39例（82．98％）,结论：RT－PCR－DDH技术在逆转录病毒核酸检测的应用中具有较好的特异性,敏感性和稳定性,而且成本较低,操作安全简便,适于中小实验室和基层医院病原微生物的检测。     

临床PCR实验室质量保证

理论上特异且敏感的PCR技术，在临床实验室的应用存在着假阳性和假阴性的问题。目前，PCR技术在国内很多临床实验室被用于多种疾病的检测。但是由于在这一方面的质量控制工作在临床实验室内尚未全面开展，致使实验室结果的解释和临床参考价值受到影响。1在临床PCR实验室实行质量保证的必要性假阳性和假阴性的存在要求必须在临床PCR实验室内实行系统的质量保证规则。Noordhoek等[1]报道了一个有7个实验室参加的单育法空间质量调查。他们将200份含有已知菌量的牛型结核杆菌标本（痰、唾液和水标本）发放到实验室。调查对标本处理方法、…     

三种沙眼衣原体的检测方法评价

目的：探讨聚合酶链反应（PCR）、免疫层析法（C－C快速法）和糖原试验检测泌尿生殖道沙眼衣原体感染的诊断价值。方法：用三种方法分别对102例送检标本进行平行检测。结果：以PCR法作参比，免疫层析法敏感性为86．7％，特异性为97％；糖原试验敏感性为80．0％，特异性为96．6％。结论：PCR法有较高灵敏度，免疫层析法有一定灵敏度和专一性，基层医院可以采用。     

应用PCR方法检测粪便中致病菌的侵袭性质粒基因

目的 建立一种快速、简便的方法，直接从粪便中检测腹泻患者的致病菌。方法 利用聚合酶链反应技术（PCR）快速检测粪便中志贺菌及EIEC（侵袭性大肠埃希氏菌）ial基因片段，与通过培养鉴定的结果进行对比。结果 48份腹泻患者粪便中通过便培养检出的阳性标本10例，用PCR方法检出甜阳性的标本15例。其中甜阳性，粪便培养阴性的标本5例，经x^2检验，两方法无显著性差异。结论 用PCR方法直接检测粪便中甜基因是检测腹泻患者致病菌的一种快速有效的方法。     

前列腺液PCR检测性病病原体感染介绍

性病涉及到包括HIV在内的二十多种病原体，严重威胁着人类健康。实验室诊断是性病诊断重要而具有决定性的一环。为此，我科采用PCR技术检测259前列腺液，现将结果报告如下：材料与方法1．PCR试剂盒由中山医科大学达安高科技开发公司供给，2．PCR扩增仪：美国PE公司生产2400型。3．方法见试剂盒说明书结果检测前列腺液标本259人份，按病原体分型，其阳性检出率见表：前列腺液PCR检测性病病原体感染介绍@刘兴森$赣州地区人民医院!341000@黄勇斌$赣州地区人民医院!341000@陈奕东$广州达安基因诊断中心!510089…     

dUTP/UDG反应体系在荧光定量PCR中抗污染能力评价

目的 探讨dUTP／UDG反应体系在荧光定量PCR中抗PCR产物污染的能力。方法 用TaqMan荧光定量PCR检测方法进行定量检测。将一系列不同浓度的含dUTP的HBV—DNA PCR扩增产物作为污染源，分别加至含dUTP／UDG的PCR反应体系和普通荧光定量PCR反应体系中，在荧光定量PCR仪上进行定量检测，从而得出含dUTP／UDG的PCR反应体系的抗污染能力。结果 1．最佳抗污染实验条件：UDG酶含量0．05U，消化时间37℃5min，灭活时间92℃1min；dUTPl00％代替dITP，四种底物浓度相等。2．含0．05U的UDG抗污染反应体系对每管浓度为10^3拷贝／ml的污染物可完全消化，并随UDG含量的增高及消化时间的延长，抗污染能力增强。结论 dUTP／UDG反应体系的应用能有效防止PCR产物污染，但抗污染能力是有一定限度的，尚需加强实验室标准化管理，才能真正达到抗污染效果。     

单管-套式/多重聚合酶链反应在间日疟原虫基因型鉴定中的价值

目的对单管-套式多重聚合酶链反应(PCR)鉴定间日疟原虫基因型方法的应用价值进行研究。方法以间日疟原虫环子孢子蛋白(CSP)基因为模型，综合套式多重PCR、等位特异PCR和标签引物扩增等技术，使用Primer Premier5．0软件和NCBI的BLAST网络改进与优化引物设计，并用矩阵试验法优化反应条件和程序，同时，用单管-套式多重PCR和套式PCR对71份间日疟患者血标本的间日疟原虫基因型鉴定结果作比较。结果单管-套式多重PCR可同时扩增出3种不同长度的基因型/族特异片段，且基本消除了二聚体等噪音。用单管-套式多重PCR鉴定检测71份间日疟患者血标本，62份与套式PCR鉴定结果一致，并新发现6份不同基因型和PV-Ⅱ型的混合感染；还将2份套式PCR鉴定为热带族的血标本纠正为PV-Ⅱ型，1份阴性血样鉴定为温带族。结论研究建立的单管-套式/多重PCR鉴定间日疟原虫基因型的方法，简化了试验步骤，节省了试剂耗材，消除了PCR噪音，提高了检出间日疟原虫混合感染和低度感染的敏感性；是一种具有发展潜力的检测单核苷酸多态性和基因型鉴定的方法。     

压电基因传感器芯片技术在快速检测人乳头瘤病毒中的应用

目的：快速检出尖锐湿疣组织中人乳头瘤病毒（HPV）并分型。方法：利用基因芯片（Gene Chip)与压电传感器（Piezoelectric biosensor）相结合的技术，通过HPV6、11、16、18四种特异型寡核苷酸探针建立一种快速检测HPV并分型的方法。结果：取复发型尖锐湿疣及相应的原发病例组织标本各22例，用压电基因传感器芯片技术检测。结果为：原发型组织标本全部为阳性结果，其中HPV6为17（77.3%)，HPV11为3（13.6%)，HPV16为2（9.1%)，HPV18未检出；复发型组织标本中除第18例标本为阴性结果外，其余21份为阳性结果，其中HPV6为15（68.2%)，HPV11为2(9.1%)，HPV16为4（18.2%)，HPV18未检出。用PCR方法检测结果全部阳性，PCR扩增的产物经斑点杂交分型结果与基本一致。结论：压电基因传感器芯片技术具有准确、快速、灵敏的优点。     

PCR-RFLP法检测肿瘤坏死因子受体基因多态性

目的：建立聚合酶链反应－限制性片段长度多态性分析（PCR－RFLP）检测肿瘤坏死因子受体Ⅱ（TNF R2）第6外显子基因多态性的方法。方法：用碘化钾法从外周血白细胞中提取基因组DNA，PCR扩增其TNF R2包括编码196位氨基酸残基在内的第6外显子基因，扩增产物用限制性内切酶NIa Ⅲ酶切后干含溴化乙锭的35g/L琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下直接观察TNF R2的基因型。结果：通过观察电泳条带可确定TNF R2的三种基因型，196R／R纯合子、196M／M纯合子、196M／R杂合子分别出现一、二、三条条带；江苏地区健康汉族人TNF R2第6外显子各基因型的频率为：196M／M61．6％，196R／R5．6％，196M／R32．8％；等位基因的频率为196M77．9％，196R22．1％。结论：RCR－RFLP是一种高效敏感、简单快速、准确可靠的分析TNFR2基因多态性的方法，适于普通实验室开展。     

实时荧光PCR、Pyrosequencing和测序法检测YMDD变异

[目的]比较测序法、Pyrosequencing和实时PCR检测拉米夫定耐药突变。[方法]对69例接受拉米夫定治疗的慢性乙肝患者血清标本分别进行测序、Pyrosequencing检测和实时PCR检测，分析和对比检测结果。[结果]69例血清标本中60例3种方法检测的结果完全符合，3例测序结果为YMDD的标本，Pyrosequencing检测到1例YVDD，而实时PCR检测结果为YVDD。26例测序为YIDD的标本中，Pyrosequencing和实时PCR分别检测出2例和5例混合突变。18例测序和Pyrosequencing检测为YVDD的标本中，1例实时PCR结果为YMDD。[结论]与测序法和Pyrosequencing相比，实时PCR能够在病毒群体中检测出比例更低的突变病毒。     

简易痰处理和DNA提取法PCR扩增123bp检测结核菌

多聚或涟式反应（PCR）技术自1985年由美国Cetus公司人类遗传部创建，1989年Brisson－Neel首次成功地应用于结核病临床标本检测，国内于1990年后陆续开展了该项研究。为了使现有的PCR技术更便于结核病临床应用，我们进行了简易痰处理，简易DNA抽提，二温循环，国产DNA扩增仪扩增123bP检测临床标本结核菌的探讨。1材料和方法1．1材料1．1．1扩增仪：上海复生生物工程研究所研制的FS－318型DNA扩增仪。1．1．2PCR试剂盒：上海复旦大学遗传研究所提供，引物，5'—CCTTGCGAGCGTAGGCGTCGG-3’；引物α5’－CTCGTCCAGCGCC…     

荧光PCR技术与直接涂片法对淋球菌检测的临床应用分析

目的探讨二种检测淋球菌方法对疑似淋病男、女病例的临床应用效果。方法采用直接涂片法和荧光PCR法对116例疑似淋病病例进行检测,按不同症状和男、女组别观察实验室效果。结果直接涂片法阳性率症状较重者高于症状轻微者．具有非常显著性差异（P〈0．01）;荧光PCR法对症状轻微患者、女性标本的检出率高于直接法,二种方法具有非常显著性差异（P〈0．01）;对于症状较重患者、男性标本,二种方法则相差无几（P〉0．05）;直接涂片法对于症状较重患者、男性标本具有较高的阳性检出率．男性标本明显高于女性标本,具有非常显著性差异（P〈0．01）。结论直接涂片法具有简便、快捷、直观的特点．但对女性的检出率较低。荧光PCR法敏感性高、特异性强,能有效提高检出率,对女性疑似病例具有较好的补充效果．     

聚合酶链反应在梅毒诊断中的应用

梅毒的各种血清学试验因敏感度和特异性尚不能达到早期和准确的要求，给临床诊断带来一定困难。我们应用PCR技术快速检测梅毒螺旋体，得到满意的结果。材料和方法一、标本来源40例可疑梅毒患者血清和分泌物标本均来自本院皮肤科与妇产科门诊。二、试剂Taq酶、dNTP、购自Promega公司．梅毒螺旋体抗体血凝试验（TPHA）试剂盒由日本富士株式会社生产，快速血浆反应素测定（RPR）试剂由兰州生物制品研究所生产。三、方法1．引物设计根据Burstain等[Clin．Microbi－ol．1991；29（1）62]，选择梅毒螺旋体39kD基底膜蛋白基因序列，扩增片…     

肺炎链球菌多重巢式荧光PCR分型方法的建立和应用

目的建立一种敏感且节省标本的多重巢式荧光PCR方法，用于临床标本中肺炎链球菌的分型。方法以检测肺炎链球菌种属（lytA基因）和20组常见血清型的引物和探针为基础，分别采用92株不同血清型的肺炎链球菌菌株和系列稀释的参考DNA模板，建立多重巢式荧光PCR方法。 评价该方法的特异性和敏感性，同时与荧光PCR方法进行比较。 将该方法用于14份肺炎链球菌培养阳性和30份肺炎链球菌培养阴性的临床标本的检测，评价实际应用效果。结果多重巢式荧光PCR与荧光PCR方法能准确鉴定/区分大部分菌株（90/92）的血清型。 前者的检测灵敏度为1～100 fg/μl，9种血清型的灵敏度高于荧光PCR方法（10～100 fg/μl）。 44份临床标本中，多重巢式荧光PCR与荧光PCR方法分别检测出34和31份阳性（P＝0.778），2种方法的DNA模板使用量分别为15 μl和66 μl。结论多重巢式荧光PCR比荧光PCR方法节省标本且更加灵敏。