用硫氰酸胍自外周血快速抽提DNA

用硫氰酸胍自外周血快速抽提ＤＮＡ马维芳，张基增，徐湘民（第一军医大学分子生物学实验室，广州５１０５１５）用酚、氯仿、乙醇沉淀等提取和纯化ＤＮＡ的方法［１］，大多数临床实验室不能常规开展。比较简单的提取方法已有报道［２］，但效果如何尚未充分评价。本文介...     

血清核糖核酸酶胰型同工酶测定及其临床意义

血清核糖核酸酶胰型同工酶对聚胞嘧啶核苷酸(poly C)有特异水解活性,因此,用以poly C为底物的酶法测定该酶活性,显示出良好的重复性(CV 5.5%)和线性关系(r=0.99)。作者将该法应用于临床胰腺癌诊断,表明该酶诊断胰腺癌的敏感性为79%,特异性达到90.26%。而且该酶对胰腺癌的早期诊断及对其疗效和预后的监测均有良好价值。本法在国内首次建立。它经济、简便,便于在临床筛选诊断胰腺癌中推广应用。     

核糖核酸酶及其在胰腺癌诊断中的应用

核糖核酸酶(RNase)的全名为聚核苷-α-寡核苷酸转移酶。RNase 于1920年发现,1940年制成牛胰RNase 结晶纯品,现已知它是一条由124个氨基酸组成的肽链,N-端为赖氨酸,C-端为缬氨酸,第12位的组氨酸及第13位的蛋氨酸与其催化活性有关。1958年Migliarese 首先提出血清RNase 浓度与恶性肿     

耐核糖核酸酶病毒样颗粒的构建和表达

目的 为耐核糖核酸酶(RNase)的RNA标准品和质控品的表达制备提供一个通用载体平台.方法 将 MS2 噬菌体基因组中包括的成熟酶蛋白和包膜蛋白的基因编码序列的1.7kb cDNA目的 片段,用Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ酶切后,与用相同内切酶酶切的表达载体质粒pET28b,在T4 DNA连接酶的存在下连接,构建一新的表达载体pI NCCL,再转化BE21-DE3 E.Coli进行原核表达.结果 成功构建得到了新的表达载体pI NCCL,经原核表达为耐RNase的病毒样颗粒.结论 本研究得到的pI NCCL表达载体及原核表达系统,可作为一个耐RNase的RNA标准品和质控品的构建和制备表达通用载体平台,将促进有关标准品和质控品的研究.     

耐核糖核酸酶病毒样颗粒的构建和表达

目的为耐核糖核酸酶(RNase)的RNA标准品和质控品的表达制备提供一个通用载体平台。方法将MS2噬菌体基因组中包括的成熟酶蛋白和包膜蛋白的基因编码序列的1.7kbcDNA目的片段,用HindⅢ和EcoRI酶切后,与用相同内切酶酶切的表达载体质粒pET28b,在T4DNA连接酶的存在下连接,构建一新的表达载体pINCCL,再转化BL21-DE3E.Coli进行原核表达。结果成功构建得到了新的表达载体pINCCL,经原核表达为耐RNase的病毒样颗粒。结论本研究得到的pINCCL表达载体及原核表达系统,可作为一个耐RNase的RNA标准品和质控品的构建和制备表达通用载体平台,将促进有关标准品和质控品的研究。     

核糖核酸酶抑制因子在肺癌中的表达

目的：通过核糖核酸酶抑制因子(ribonuelease inhibitor，RI)基因在人肺癌及同体癌旁正常肺组织中的表达的检测，进一步探讨RI与恶性肿瘤细胞生长的关系。方法：应用Western blotting方法检测人肺癌组织中RI的蛋白表达量；应用RT—PCR的方法检测人肺癌组织中RI的mRNA的表达量。采用X^2检验(chi-square test)分析获得的数据，用SPSS10．0统计软件进行处理。结果：人肺癌组织中RI的蛋白及mRNA的表达均明显低于同体癌旁正常肺组织。结论：核糖核酸酶抑制因子(RI)在肺癌中的表达下调，肺癌的生长可能与RI表达的下调有关。     

耐核糖核酸酶病毒样颗粒的构建和表达

目的：为耐核糖核酸酶（RNase)的RNA标准品和质控品的表达制备提供1个通用载体平台。方法：将MS2噬菌体基因组中成熟酶蛋白和包膜蛋白基因编码序列的1．7kb cDNA目的片段，用Hind Ⅲ和EcoR I酶切后，用于相同内切酶酶切的表达载体质粒PET28b中，并在T4 DNA连接酶的存在下连接，构建一新的表达载体pI NCCL,再转化BL21－DE3 E.Coli进行原核表达。结果：成功构建出新的表达载体pI NCCL,经原核表达为耐RNase的病毒样颗粒。结论：本研究得到的pI NCCL表达载体及原核表达系统，可作为1个耐RNase的RNA标准品与质控品的构建和制备表达通用载体平台，以促进有关标准品和质控品的研究。     

结核杆菌DNA的快速抽提

结核杆菌ＤＮＡ的快速抽提陈一平，翁心华，徐肇 结核杆菌属于分枝杆菌属，其细胞壁中含有大量类脂，占细菌于重的２３．７７％，其中４０％为蜡质，故结核杆菌细胞壁较一般细菌坚固，能否有效地破裂其细胞壁使ＤＮＡ释放出来，是提高临床标本中结核杆菌检出率的关键。我?..     

微小核糖核酸与肿瘤发生

微小核糖核酸 (microribonucleic acids,miRNAs)是指含有19～25个核苷酸的小核糖核酸分子,近年研究发现其与肿瘤的发生密切相关,该文综述近年miRNAs与肿瘤关系的研究,为临床研究提供理论基础.     

粪便DNA抽提方法的比较研究

目的 比较国际主要微生态实验室4种常用的核酸抽提方法获得的粪便DNA的质量.方法 采用针对目的细菌(总细菌、类杆菌-普氏杆菌属组、双歧杆菌、肠杆菌科细菌及肠球菌)16s rDNA的特异性引物及实时定量PCR方法,分析QIAamp(R)粪便DNA试剂盒法(QIA法)、FastDNA(R) Kit试剂盒法(Fast法)、酚-氯仿-玻璃珠击打法(酚-氯仿-玻珠法)及QIAamp(R) DNA粪便试剂盒+玻璃珠击打法(QIA+玻珠法)4种方法抽提获得的10份人粪便DNA的质与量.结果通用引物特异性扩增粪便总DNA,发现4/10份由酚-氯仿-玻珠法获得的粪便DNA中存在PCR抑制剂,过柱纯化后PCR抑制现象消失.实时定量PCR检测粪便总细菌量,以QIA法与QIA+玻珠法获得的量最高(分别为12.16±0.18,12.05±0.48),而Fast法与酚-氯仿-玻珠法获得的粪便细菌量(分别为11.26±0.40,11.21±0.16)与QIA法相比显著低下(均P＜0.05).采用QIA法(11.63±0.23,8.68±0.51)及QIA+玻珠法(11.67±0.56,8.77±0.56)抽提获得的粪便类杆菌-普氏杆菌及肠杆菌科细菌的DNA量显著高于Fast法(10.67±0.47,7.39±0.51)及酚-氯仿-玻珠法(10.65±0.33,7.40±0.18)(均P＜0.05).对于双歧杆菌,酚-氯仿-玻珠法获得的量显著低下.但对肠球菌而言,以Fast法获得的量最高.结论 实时定量PCR检测结果表明,QIA法及QIA+玻珠法获得的粪便DNA质与量总体上优于Fast法及酚-氯仿-玻珠法,但根据不同的目的细菌群对象可以选择不同的方法.     

两种从陈旧血中抽提基因组DNA方法的比较

目的比较盐析法和磁珠法从陈旧血中抽提基因组DNA的效果和特点,以便常规用于骨髓库HLA基因分型。方法使用TECAN全自动工作站为平台,分别用Gentra盐析法DNA抽提试剂盒和Promega磁珠法DNA抽提试剂,从48份陈旧全血样本中抽提基因组DNA,提取的基因组DNA均溶于100μlTE中;然后用紫外分光光度计测定其产量和纯度,并用琼脂糖凝胶电泳法测定DNA样本的完整性。结果从400μl陈旧全血中提取基因组DNA,用盐析法获得的DNA含量为28.6±8.7ng/μl,A260/A280值平均为1.63±0.209;用磁珠法获得的DNA含量为94.2±10.3ng/μl,A260-A320/A280-A320值平均为1.821±0.102;琼脂糖电泳法检测表明两种方法提取的DNA的分子量均大于15kb。结论使用磁珠法从陈旧血中所获得的DNA的产量和纯度明显高于盐析法,适合于骨髓资料库陈旧血样本的常规HLA基因分型实验以及下游的分子生物学实验。     

两种从陈旧血中抽提基因组DNA方法的比较

目的 比较盐析法和磁珠法从陈旧血中抽提基因组DNA的效果和特点,以便常规用于骨髓库HLA基因分型.方法 使用TECAN全自动工作站为平台,分别用Gentra盐析法DNA抽提试剂盒和Promega磁珠法DNA抽提试剂,从48份陈旧全血样本中抽提基因组DNA,提取的基因组DNA均溶于100 μlTE中;然后用紫外分光光度计测定其产量和纯度,并用琼脂糖凝胶电泳法测定DNA样本的完整性.结果 从400 μl陈旧全血中提取基因组DNA,用盐析法获得的DNA含量为28.6±8.7 ng/μl,A260/A280值平均为1.63±0.209;用磁珠法获得的DNA含量为94.2±10.3 ng/μl,A260-A320/A280-A320值平均为1.821±0.102;琼脂糖电泳法检测表明两种方法提取的DNA的分子量均大于15 kb.结论 使用磁珠法从陈旧血中所获得的DNA的产量和纯度明显高于盐析法,适合于骨髓资料库陈旧血样本的常规HLA基因分型实验以及下游的分子生物学实验.     

含风疹病毒部分核酸序列的耐核糖核酸酶病毒样颗粒的构建和表达

目的构建原核表达系统，表达内含风疹病毒部分核酸序列的由噬菌体包膜蛋白构成的病毒样颗粒，并包被重组RNA，使其具耐核糖核酸酶(RNase)的特性。方法用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增风疹减毒活疫苗中风疹病毒糖蛋白E1的部分保守区域，进行TA克隆后，用限制性内切酶HindⅢ酶切，获得所需要的目的片段，并与用HindⅢ酶切的表达载体pNCCL1相连接，构建一新的表达载体pNCCL1-Ru。再转化E．Coli BL21-DE3，用IPTG诱导表达噬菌体MS2包膜蛋白后，再自我组装成病毒样颗粒，并将风疹病毒部分序列包裹到病毒样颗粒内。结果成功构建了新的表达载体pNCCL1-Ru，其原核表达产物病毒样颗粒中所包裹的风疹病毒RNA序列与风疹BRDⅡ株同源性高达98％，所包裹的RNA具有耐RNase消化的特性以及良好的稳定性。结论我们构建的表达载体pNCCL1-Ru及原核表达系统，可作为构建和制备耐RNase的风疹病毒核酸标准品和质控品的平台，可为实验室进行风疹病毒核酸的检测提供稳定的无传染性的标准品和质控品。     

限制性酶切扫描技术测定DNA甲基化组的方法建立

目的优化试验条件，建立用于DNA甲基化组测定的限制性酶切扫描技术（RLGS）。方法选取冰冻胃癌组织及其周围非癌组织各2份，提取基因组大分子DNA（〉50000bp），用甲基化敏感的限制性内切酶Not Ⅰ等对DNA进行多重酶切、同位素”P标记、二维电泳、扫描分析，并且根据已有的位点DNA序列数据库，确定所得扫描图谱上位点所对应的序列信息。结果成功得到RLGS扫描图；有效点平均在1200个左右，标本质量较好的图谱平均可获得有效点1800个左右，与国外实验室的平均水平相当，经过比对可找出放射自显影信号强度减弱或增强的点，结果可重复，并能在Not Ⅰ-EcoR V克隆文库中找到这些点所对应的序列信息。结论成功建立了RLGS技术平台，并能够稳定工作。