转染人骨形成蛋白2共培养条件下NIH3T3细胞生物学性状的观察

目的利用细胞共培养系统研究转基因诱导表达的分泌型人骨形成蛋白2（hBMP-2），对NIH3T3细胞超微结构和碱性磷酸酶（ALP）活性的影响。方法用阳离子聚合物转染试剂将hBMP-2真核表达载体peDNA3．1-B2导入NIH3T3细胞，G418筛选获得阳性细胞克隆。免疫组化和酶联免疫吸附试验检测BMP-2胞内和胞外的表达，并利用细胞共培养系统Transwell，将转基因细胞与NIH3T3细胞共培养。结果转染hBMP-2基因的NIH3T3细胞胞内和胞外都有BMP-2的表达。与转基因细胞共培养的NIH3T3细胞在共培养后超微结构的变化和ALP的高表达，都提示其向成骨样细胞分化的趋势。结论经转基因诱导表达的分泌型BMP-2具有诱导成纤维细胞向成骨样细胞分化的作用。     

超声微泡破裂法促进骨形态发生蛋白-2在小鼠骨骼肌表达的研究

目的探讨超声微泡破裂法对基因重组人骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）质粒pIRES-rhBMP2-EGFP在小鼠骨骼肌的转染、表达的促进作用。方法24只BALB/c小鼠随机分为4组,每组6只。A组和B组选择右侧胫前肌为注射点,其中A组注射质粒,B组注射质粒与微泡造影剂混合物后用超声辐照,质粒注射量为30 μg;C组和D组选择右侧股四头肌为注射点,其中C组注射质粒,D组注射质粒和微泡造影剂混合物后用超声辐照,质粒注射量为100 μg。7 d后处死A组和B组小鼠,取胫前肌在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况;14 d后处死C组和D组小鼠,取股四头肌行免疫组化检测rhBMP-2表达情况。结果7 d后B组阳性肌纤维百分率高于A组（P<0.05）;14 d 后,C组和D组都可检测到rhBMP-2的表达,但D组rhBMP-2表达量比C组多。结论超声介导微泡破裂法能增加外源性rhBMP-2基因在小鼠体内骨骼肌转染率和表达水平,有望为牙周病的基因治疗提供一种新型方法。     

重组真核表达载体pEGFP-N1/hIL-1ra的构建及其在NIH3T3细胞中的稳定表达

目的构建重组人白细胞介素1受体拮抗剂（rhIL-1ra）基因真核表达载体pEGFP-N1/hIL-1ra,稳定转染小鼠成纤维细胞（NIH3T3）并检测其表达,为使用细胞因子拮抗剂基因治疗牙周炎奠定实验基础。方法Trizol法提取人乳腺癌组织总RNA,RT-PCR方法扩增目的基因。胶回收、纯化后产物与克隆载体pMD18-T连接、转化,测序鉴定正确后将重组克隆载体与真核表达质粒pEGFP-N1分别用HindⅢ和BamHⅠ双酶切,体外连接。重组DNA转化感受态细菌E.coliTOP10,筛选阳性克隆并鉴定。将构建正确的pEGFP-N1/hIL-1ra重组质粒DNA由脂质体介导转染NIH3T3细胞,G418加压筛选20d,RT-PCR检测基因的表达,ELISA检测蛋白的表达。结果重组质粒pEGFP-N1/hIL-1ra经PCR及双酶切鉴定均证实人IL-1ra基因已与pEGFP-N1正确重组。稳定转染NIH3T3细胞后,RT-PCR得到目的基因片段,ELISA检测到目的蛋白的表达。结论本实验成功构建了编码人IL-1ra基因的重组质粒pEGFP-N1/hIL-1ra,并获得了稳定表达目的蛋白人IL-1ra的NIH3T3细胞系,为牙周炎基因治疗的后续研究奠定了实验基础。     

骨形成蛋白-2基因转染NIH3T3细胞诱导成骨的实验研究

目的　探讨骨形成蛋白 - 2 (bonemorphogeneticprotein - 2 ,BMP - 2 )基因转染NIH3T3细胞体内诱导新骨的能力。方法　用脂质体转染法将BMP - 2基因转染至NIH3T3细胞 ,将转染细胞悬液注入裸鼠股四头肌内 ,第 6周取材 ,观察肌肉组织内诱导新骨生成情况。结果　基因转染实验组裸鼠肌肉组织中有类骨组织形成 ,部分区域伴有钙盐沉着 ,未见明显炎症反应。结论　骨形成蛋白 - 2基因转染NIH3T3细胞在裸鼠肌内具有异位诱导成骨作用     

非病毒载体介导pBMP-2转染MC3T3-E1细胞的体外成骨分化研究

目的 :探讨非病毒载体Gen Escort TM II介导质粒骨形态发生蛋白2(p BMP-2)转染对MC3T3-E1细胞增殖和体外成骨分化的影响。方法:以非病毒载体Gen Escort TM II介导报告基因质粒增强型绿色荧光蛋白(p EGFP)转染MC3T3-E1细胞,优化转染条件,荧光显微镜和流式细胞仪评价转染效率。p BMP-2转染MC3T3-E1细胞后,MTT法检测细胞增殖情况,染色法检测碱性磷酸酶(ALP)和茜素红S(ARS)的表达,Real-time PCR分析成骨细胞标志基因ALP、骨涎蛋白(BSP)、Runt相关转录因子2(Runx2)、骨钙素(OCN)和骨桥蛋白(OPN)的表达。结果 :Gen Escort TM II介导p EGFP转染MC3T3-E1细胞后,转染效率达35.02±4.42,MTT结果示基因转染对细胞增殖无影响(P>0.05)。p BMP-2转染组的ALP、ARS表达较p EGFP转染组和未转染组显著,同时Real-time PCR检测结果示,转染后6 d,p EGFP转染组和未转染组相比,p BMP-2转染组的成骨基因ALP、BSP、Runx2、OCN、OPN的表达量差异有显著性意义(P<0.05)。结论:非病毒载体Gen Escort TM II介导BMP-2转染MC3T3-E1细胞可诱导其向成骨方向分化。     

人肿瘤坏死因子-α基因转染对舌癌细胞的抑制作用

目的：探讨人肿瘤坏死因子－α（hTNF-α)基因转染对舌癌细胞生长的影响。方法：制备和纯化含hTNF-α基因穿梭质粒，用DOSPER阳离子脂质体介导转染Tca8113舌癌细胞，对照组只给予等量的脂质体，不加入质粒；转染基因，24，48，72，92h后用ELISA法检测细胞培养上清液中hTNF-α的浓度，并用MTT法检测细胞的存活率。结果：基因转染24，48，72，96h后转染组与对照组细胞培养上清液中hTNF-α浓度之间的差异均有显著性（P＜0．05），转染组各个时期浓度均高于对照组；MTT法检测相应各时期转染组与对照组平均OD之间的差异均有显著性（P＜0．05），转染组各个时期平均OD值均低于对照组，转染细胞的存活率降低，生长受抑制。结论：阳离子脂质体介导的hTNF-α基因体外转染可在Tca8113舌癌细胞中高表达并抑制舌癌细胞的生长。     

骨形态发生蛋白-7真核表达载体的构建及其在MC3T3-E1细胞中的表达

目的构建一个能在MC3T3-E1细胞中表达骨形态发生蛋白-7（bmp-7）基因表达载体。方法采用RTPCR技术从人胚肾中扩增人bmp-7基因,将获得的基因定向插入pcDNA3.1（+）真核表达质粒中,测序正确后用脂质体将表达质粒转染入MC3T3-E1细胞,转染后72 h提取细胞全蛋白,采用Western blot检测BMP-7蛋白表达。结果通过基因测序表明获得的bmp-7与GeneBank登录的序列一致,构建的质粒为bmp-7/pcDNA3.1（+）质粒,Westernblot检测结果表明bmp-7基因转染MC3T3-E1后能在细胞中表达。结论成功构建能在MC3T3-E1细胞中表达BMP-7的真核表达载体。     

siRNA对鼠成纤维细胞株中HSP47表达的抑制作用

目的:构建小鼠热休克蛋白47(47 kDa heat shock protein,HSP47)基因的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)表达载体,及HSP47第一外显子克隆表达载体,观察其在小鼠成纤维细胞(NIH3T3细胞株)中对HSP47基因表达的抑制作用。方法:针对小鼠HSP47的mRNA序列,在368、718位点分别设计两对21nt的,编码HSP47siRNA基因片断的寡核苷酸,退火成双链后将其连接到pSilencer1.0质粒的U6启动子下游,构建pSilencer-HSP47siRNA重组质粒;同时构建HSP47第一外显子重组质粒。经酶切、测序鉴定后,用脂质体介导的基因转染方法,转入NIH3T3细胞,用半定量RT-PCR法检测HSP47表达水平的变化。结果:经酶切、测序鉴定,成功构建了siRNA真核表达载体及靶基因克隆表达载体。经脂质体转染NIH3T3细胞后,RT-PCR显示NIH3T3细胞中HSP47基因的mRNA表达水平明显降低,所构建的HSP47-siRNA基因的真核表达载体,成功地抑制了目的基因的表达。结论:构建的小鼠HSP47基因的RNA干扰真核表达载体pSilencer-HSP47siRNA,在NIH3T3细胞中有效地发挥了对HSP47基因表达的干涉作用,从而提示HSP47特异的siRNA具有抑制皮肤瘢痕形成的潜力。     

转染人骨形成蛋白-7基因对骨髓基质细胞体外生物学活性的影响

目的：观察hBMP-7基因转染对Beagle犬骨髓基质细胞（BMSC）生物学特性的影响。方法：利用脂质体介导法将hBMP-7基因转染Beagle犬BMSC，观察细胞形态及生长情况，检测碱性磷酸酶、骨钙素及钙化结节等成骨细胞表型。结果：目的基因转染后细胞形态略有变化，增殖能力无明显改变，凋亡率无明显变化，碱性磷酸酶活性明显增高，骨钙素表达增强，钙化结节增大。结论：hBMP-7基因转染可以加速BMSC向成骨细胞表型转化。hBMP-7基因转染的BMSC有望成为牙周组织工程理想的种子细胞。     

腺病毒介导的骨形态发生蛋白-2基因转染脂肪间充质干细胞的实验研究

目的 探讨腺病毒介导的人骨形态发生蛋白-2（Ad-hBMP-2）基因转染大鼠脂肪间充质干细胞（ADSCs）的可行性及其成骨特性。方法 取4周龄SD大鼠腹股沟的脂肪组织,经体外分离培养的方法获得ADSCs,分别转染以腺病毒为载体的绿色荧光蛋白（Ad-GFP）基因和Ad-hBMP-2基因。用荧光显微镜每隔12 h观察转染Ad-GFP的细胞,并确定转染率,观察其形态变化,绘制生长曲线;利用免疫细胞化学法对转染Ad-hBMP-2的细胞作碱性磷酸酶（ALP）染色,用免疫细胞化学法作骨钙素（OC）检测确定成骨活性,Western blot法检测hBMP-2的表达。结果 12 h后荧光显微镜观察转染Ad-GFP的细胞,有52％的阳性表达细胞,48 h后转染率达95%;转染Ad-hBMP-2后倍增时间延长,ALP、OC检测为阳性表达,hBMP-2蛋白转染后48 h为阳性表达,并持续至第5代。结论 ADSCs可以作为腺病毒转染的载体,转染Ad-hBMP-2基因后有明显的成骨作用,可以作为骨组织工程的种子细胞。     

腺病毒介导的人骨形成蛋白7基因转染对人牙髓细胞增殖与分化作用的研究

目的探讨腺病毒介导的人骨形成蛋白7(Ad-hBMP-7)转染对体外培养的人牙髓细胞增殖及向成牙本质细胞分化的作用。方法人胚肾293细胞扩增复制缺陷型重组腺病毒,选用细胞半数感染剂量法测定病毒滴度。体外培养人牙髓细胞,荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白的表达,流式细胞仪检测病毒的转染率。将 Ad-hBMP-7感染人牙髓细胞,Western blot 检测蛋白表达情况,噻唑蓝比色法(MTT)、酶动力学法、von Kossa 染色及半定量逆转录聚合酶链分别检测转基因细胞的增殖、碱性磷酸酶(ALP)活性、钙化结节的形成和牙本质涎磷蛋白(DSPP)mRNA 的表达。结果病毒滴度为1.785×10~(12)pfu/L;人牙髓细胞受 Ad-hBMP-7感染48 h 后即可检测到外源蛋白表达;当感染复数为75时,重组腺病毒对牙髓细胞的转染率达(91.1±1.0)%;与空载体组及未转染细胞组相比,细胞的增殖特性无明显改变;ALP 活性高于对照组(P<0.05);能够形成矿化结节;DSPP mRNA 的表达呈剂量和时间依赖性。结论 Ad-hBMP-7可促进体外培养的人牙髓细胞向成牙本质细胞分化,但对细胞的增殖无明显改变。     

The use of tissue-engineered bone with human bone morphogenetic protein-4-modified bone-marrow stromal cells in repairing mandibular defects in rabbits

In this study, the capacity of hBMP-4 gene therapy combined with tissue-engineering techniques to improve the repair of mandibular osseous defects in rabbits was explored. A mammalian plasmid vector expressing enhanced green fluorescent protein-human bone morphogenetic protein-4 (pEGFP-hBMP-4) was initially constructed through subcloning techniques. Bone-marrow stromal cells (bMSCs) from New Zealand White rabbits were cultured and either transfected with pEGFP-hBMP-4 or pEGFP, or left untransfected in vitro. Once the transfer efficiency was determined through the expression of EGFP, cells from the three groups were combined with natural non-organic bone (NNB) at a concentration of 50 x 10(6)cells/ml and placed in 15 mm x 6 mm bilateral, full-thickness, mandibular defects surgically made in 12 rabbits. Together with NNB control, there were six samples per group. Four weeks after surgery, the implants were harvested and evaluated histomorphologically. Under optimal experimental conditions, gene transfer efficiency reached a maximum of 38.2+/-9.4%. While the percentage of new bone area in the NNB control group was 8.8+/-3.1%, in the untransfected bMSC group 22.5+/-8.2%, and in the pEGFP group 18.1+/-9.0%, a significantly higher amount of 32.5+/-6.1% was observed in the pEGFP-hBMP-4 group. These results suggest that transfection of bMSCs with hBMP-4 enhances their inherent osteogenic capacity for maxillofacial bone tissue-engineering applications.     

hBMP-2修饰β-TCP/I型胶原复合材料对MC3T3-E1细胞增殖的影响

目的:探究含人的骨形成蛋白-2为目的基因的质粒DNA修饰纳米β-磷酸三钙(Tricalcium phosphate)/I型胶原溶液复合材料对小鼠前成骨细胞增殖的影响。方法:含hBMP-2为目的基因的质粒DNA修饰纳米β-TCP/I型胶原溶液复合材料,建立MC3T3-E1细胞株与纳米复合材料体外培养体系。将其分为支架组和平皿组,扫描电镜、光镜观察细胞学形态,Alamar Blue法检测细胞增殖,MuseTMCell Analyzer法检测细胞周期,实时荧光定量PCR检测Cdk2、Cdk4等细胞增殖基因。结果:复合材料细胞黏附数、增殖数及表面分布高于平皿组(P<0.05),实验结果显示支架组均优于平皿组。结论:复合材料与单纯含hBMP-2为目的基因的质粒DNA相比, 更能促进前成骨细胞黏附、增殖及功能代谢, 表明其对前成骨细胞具有良好细胞相容性,可成为一种新型的具有应用前途的骨修复或组织工程材料。     

转染突变的BMPs Ⅱ型受体使MH3T3细胞的增殖活性降低

目的：探讨转染BMPsⅡ型突变受体对MH3T3细胞生物学行为的影响。方法：用携带BMPsⅡ型突变受体的cDNA的真核表达载体转染NLH3T3细胞,对NIH3T3细胞进行生长曲线、MTT比色、流式细胞仪分析、BrdU检测。结果：转染细胞的增殖活性和DNA合成下降。结论：转染的突变受体使被转染细胞的增殖活性降低。     

Effects of human BMP2 gene transfection on NIH3T3 cells in vitro]

OBJECTIVE: To elucidate the mechanism of bone morphogenetic protein (BMP) on cell differentiation and to provide basis for BMP gene therapy. METHODS: A phagemid expression vector for human BMP2 (pBK-B2) was constructed and transfected into the NIH3T3 cells by using Lipofect AMINE. Positive cell clones were selected with G-418. The stable transfection, expression and secretion of hBMP2 were determined by in situ hybridization, immunohistochemistry and sandwich-in ELISA methods. The proliferativity of the transfected cells were assayed by methabenzthiazuron (MTT) method. Alkaline phosphatase (ALP) and osteocalcin (OC) production were also measured in the transfected cells. RESULTS: The results showed that cell proliferation was inhibited after the transfection with hBMP2 gene. But the transfected cells showed increased ALP activity and OC production. CONCLUSION: These results indicate that BMP2 is expressed stably and efficiently in the NIH3T3 cells and is involved in inducing differentiation of NIH3T3 cells into osteoblast-like cells.     

绿色荧光蛋白基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的　体外研究绿色荧光蛋白 (GFP)基因转染骨髓间充质干细胞 (MSCs)的方法,并检测基因转染后细胞的生物学特性及分化潜能。方法　体外分离培养大鼠MSCs,用重组GFP的腺病毒载体Ad GFP及脂质体介导质粒pEGFP C1两种方法转染GFP,流式细胞术观察比较基因转染和表达结果;将腺病毒介导的基因转染细胞经成骨定向诱导后,检测碱性磷酸酶表达和钙结节形成情况。结果　重组Ad GFP对细胞的感染率达(41 3±1 4)%,感染 6周后仍有表达;脂质体组转染效率最高为 12 5%。病毒感染组阳性细胞与未感染组细胞经成骨诱导分化后碱性磷酸酶表达均逐渐增高;诱导 3周后茜素红钙盐染色均为阳性。结论　重组GFP的腺病毒载体Ad GFP可高效感染MSCs,基因转染后细胞的增殖分化能力与未转染细胞差异无统计学意义(P>0 05),可以作为一种高效的大鼠MSCs的标记方法。     

The Effects of Bone Morphogenetic Protein 2 Gene Transfection on Fibroblasts

目的探讨骨形成蛋白2(bonemorphogeneticprotein2,BMP2)基因转染对成纤维细胞成骨表型的调控作用.方法利用脂质体将包含BMP2cDNA全长编码序列的表达载体转染至NIH3T3细胞,原位杂交和免疫组化分别检测BMP2在NIH3T3细胞内的稳定转染和表达,同时观察转染细胞的增殖能力及成骨标志物包括碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)活力和骨钙素(osteocalcin,OC)含量的变化.结果BMP2只在转染细胞内表达.与未转染细胞相比,BMP2基因转染细胞的增殖能力降低,而ALP活力和OC含量增加.结论结果表明BMP2基因转染能够衣导成纤维细胞的体外成骨潜能.