反义寡脱氧核苷酸抗丁型肝炎病毒的作用

在进行中国人ＨＤＶ核酶活性ｃＤＮＡ克隆及序列分析，并构建含ＨＤＶ核酶质粒（ｐＨＤＶｒｚ２７７）的基础上，进行反义寡脱氧核苷酸抗ＨＤＶ作用的研究。设计合成了一条与核酶结构中起重要作用的７２１￣７３５位核苷酸互补的１５聚反义寡脱氧核苷酸。用其中一条含Ｔ７启动子的一对引物，以ｐＨＤＶｒｚ２７７为模板扩增得到１３１ｂｐＨＤＶ核酶基因片段，再以此为模板用Ｔ７ ＲＮＡ聚合酶进行体外转录，并在转录的同时加入反义     

肿瘤坏死因子α与反义寡脱氧核苷酸联合作用对人胰腺癌细胞生…

目的探讨肿瘤坏死因子α与反义寡脱氧核苷酸的联合应对胰腺癌细胞生长的影响。     

跨膜型和分泌型TNF-α在内毒素性休克过程中的作用

目的：研究跨膜型TNF－α（mTNF－α）的消长与内毒素性休克发生、发展的关系，探讨mTNF－α在内毒素性休克中的作用和机理。方法：首先使用埃希大肠杆菌死菌液制备大鼠内毒素性休克模型，并分不同时间点检测血清中的分泌型TNF－α（sTNF－α）、腹腔巨噬细胞表面上的 mTNF－α。然后，在给大鼠注射死菌液之前30min，分别注射TNF转化酶（TACE）反义寡核苷酸（5mg/kg）或抗TNF－α多克隆抗体（5mg/kg）。6h后分别检测sTNF－α、mTNF－α水平；检查肺、肾等内脏器的病理改变，并且监测各组大鼠的血压变化。结果：在内毒素性休克过程中，mTNF－α表达的动态变化不同于sTNF－α，mTNF－α在注射菌液30min后开始升高，4．5h达最高峰，随后有所下降，但一直维持在较高水平。TACE反义寡核苷酸能有效抑制mTNF－α转化为sTNF－α，使腹腔巨噬细胞表面上的mTNF－α表达明显增高（P＜0．001），使血压维持在正常水平，肺、肾等脏器无病理改变；抗TNF－α多克隆抗体能中和sTNF－α,其结果与前者基本相似。结论：内毒素性休克的病理过程主要与sTNF－α及其诱导的其它促炎细胞因子如IL－1β、IL－6、IL－8等有关，而mTNF－α则可抵抗内毒素的攻击，稳定血压，限制炎症反应及保护组织免受损伤，为临床治疗休克和感染性疾病提供了新的线索和实验依据。     

肿瘤坏死因子α与反义寡脱氧核苷酸联合作用对人胰腺癌细胞生长的影响

目的探讨肿瘤坏死因子α（ＴＮＦα）与反义寡脱氧核苷酸的联合应用对胰腺癌细胞生长的影响。方法用ＴＮＦα和硫代正磷酸修饰的反义寡脱氧核苷酸对本室自建的胰腺癌细胞系（ＰＣ－２）进行处理，并与单独用药和未用药组进行对比。用细胞计数和噻唑蓝（ＭＴＴ）法分析细胞生长速度和增殖率，用ＲＴ－ＰＣＲ－ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔ检测药物对靶基因表达的影响，并对细胞的凋亡状况进行原位检测。结果联合用药组较单独用药组使细胞生长速度减慢的作用明显加强；针对Ｋｉ－ｒａｓ和ｃ－ｍｙｃ帽区的反义硫代正磷酸修饰的寡脱氧核苷酸（简称反义Ｋｉ－ｒａｓ和反义ｃ－ｍｙｃ）可以明显抑制内源性靶基因Ｋｉ－ｒａｓ和ｃ－ｍｙｃ的表达；ＴＮＦα与反义Ｋｉ－ｒａｓ、反义ｃ－ｍｙｃ联合应用凋亡细胞发生率为８．０％和８．４％，高于其分别单独应用的５．２％、４．８％和５．４％。结论ＴＮＦα与反义寡脱氧核苷酸的联合应用对细胞生长的影响大于单独作用。     

hCG-β反义寡脱氧核苷酸抑制正常滋养细胞hCG的分泌

目的：探讨ｈＣＧ－β反义寡脱氧核苷酸（ＡＳ－ＯＤＮ）是否抑制正常早期妊娠滋养细胞ｈＣＧ的分泌、作用效率及对该细胞生长的影响。方法：采用放射免疫分析法检测了与ｈＣＧ－βＡＳ－ＯＤＮ共培养后物正常滋养细胞ｈＣＧ的含量结果：ｈＣＧ－βＡＳ－ＯＤＮ能在ｈＣＧ蛋白水平产生抑制作用。结论：ｈＣＧ－βＡＳ－ＯＤＮ能牧场卉地抑制正常滋养细胞ｈＣＧ蛋白的分泌。     

嵌合性硫代磷酸修饰的反义c-myc寡脱氧核苷酸对动脉平滑肌细胞迁移的影响

目的：血管平滑肌细胞（ＳＭＣ）迁移在血管成形术后再狭窄的发生中起着关键作用。ｃ－ｍｙｃ是对多种刺激ＳＭＣ迁移的生长因子作出迅速早期反应的基因。推测采用与ｃ－ｍｙｃｍＲＮＡ互补的寡脱氧核苷酸（ＯＤＮ）的反义战略可达到抑制ＳＭＣ迁移的目的。方法：将嵌合性硫代磷酸修饰的反义ｃ－ｍｙｃＯＤＮ通过ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ导入ＳＭＣ后,采用改良的Ｂｏｙｄｅｎｃｈａｍｂｅｒ方法检测ＳＭＣ的迁移率。结果：反义ｃ－ｍｙｃＯＤＮ作用的ＳＭＣ对１０％ＦＢＳ的化学趋化活性明显减弱,反义ｃ－ｍｙｃＯＤＮ显著抑制了ＳＭＣ迁移。而正义ｃ－ｍｙｃＯＤＮ和错配ｃ－ｍｙｃＯＤＮ处理的ＳＭＣ,与对照组相比,迁移率无差别。结论：（１）反义ｃ－ｍｙｃＯＤＮ对体外ＳＭＣ迁移的抑制具有序列特异性;（２）ｃ－ｍｙｃ基因表达在ＳＭＣ迁移的信号通路中起关键作用;（３）本研究为采用ｃ－ｍｙｃＯＤＮ的战略抑制ＳＭＣ迁移进而防止血管成形术后再狭窄的发生奠定了基础     

黄芪对贫血小鼠骨髓基质细胞分泌TNF-α的影响

骨髓基质细胞可分泌细胞因子包括肿瘤坏死因子 (ＴＮＦ)调控造血。中医补气要药黄芪能够增强和调节免疫系统 ,为探讨黄芪补气补血的生物学机理 ,本文观察了黄芪对贫血小鼠骨髓基质细胞分泌ＴＮＦ的影响。1　材料方法1 1　实验动物 :8～ 12周龄ＢＡＬＢ ｃ雄性小鼠 ,体重 18～ 2 0ｇ,成都中医药大学实验动物中心提供。1 2　药品与材料 :黄芪注射液 (Ａｓｔｒａｇａｌｕｓｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓｉｎｊｅｃ ｔｉｏｎ ,ＡＭＩ) :(成都地奥九泓制药厂 ) ,1ｍＬ相当于原生药黄芪2ｇ;ｒｈＴＮＦ :(美国基因公司 ) ;放线菌素Ｄ(ＡＭＤ)、四甲基偶…     

TNF-α对小鼠腹腔渗出细胞抗真菌活性的影响

目的：研究TNF—α对小鼠腹腔渗出细胞的激活和杀菌活性的效应。方法：以IL-12、IL-18、IFN—γ、TNF-α及抗体诱导小鼠腹腔渗出细胞和巨噬细胞，应用ELISA法测定细胞因子变化，Griess反应法测定培养上清液中NO的含量，检测巨噬细胞内新型隐球菌菌落数。结果：IL-12和IL-18联合应用协同诱导腹腔渗出细胞产生TNF—α，且能被IFN—γ抗体所抑制。IFN—γ、TNF-α协同诱导巨噬细胞产生NO和增强其杀伤新型隐球菌活性。结论：TNF—α在细胞因子相互调节诱导增强巨噬细胞杀真菌活性中起重要作用。     

嵌合性硫代磷酸修饰的反义c-myc寡脱氧核苷酸对动脉平滑肌细胞增殖抑制作用的研究

目的：探讨ｃ－ｍｙｃ基因表达在血管平滑肌细胞增殖信号传导通路中的作用和采用反义ｃ－ｍｙｃ寡脱氧核苷酸抑制血管平滑肌细胞（ＳＭＣ）增殖的作用。方法：采用针对大鼠ｃ－ｍｙｃｍＲＮＡ包括ＡＵＧ在内的翻译起始区的前５个密码子的嵌合性硫代修饰的反义ｃ－ｍｙｃ寡脱氧核苷酸（ＡＳ－ＯＤＮ）,以ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ导入ＳＭＣ后,通过细胞计数和３Ｈ－ＴｄＲ掺入观察其对ＳＭＣ增殖的抑制作用。结果：ｃ－ｍｙｃＡＳ－ＯＤＮ不仅对从静止状态刺激的ＳＭＣ增殖有抑制作用,而且对处于增殖状态的ＳＭＣ的增殖也有显著抑制作用,这种抑制作用可因加入正义ｃ－ｍｙｃＯＤＮ而减弱甚至消除,而且随着剂量的增加,抑制作用越来越明显。一次性应用ｃ－ｍｙｃＡＳ－ＯＤＮ可达到较持久的作用。而正义ＯＤＮ和错配ＯＤＮ对ＳＭＣ增殖无影响。结论：ｃ－ｍｙｃＡＳ－ＯＤＮ以剂量依赖和序列特异方式抑制ＳＭＣ增殖。ｃ－ｍｙｃ基因表达在ＳＭＣ增殖的信号传导通路中起重要作用。为采用ｃ－ｍｙｃＡＳ－ＯＤＮ抑制ＳＭＣ增殖的反义战略防治再狭窄研究奠定了基础。     

PDGF-B反义寡脱氧核苷酸对大鼠肝星状细胞增殖及Ⅰ型胶原合成的影响

目的：探讨PDGF-B反义寡脱氧核苷酸(ASODN)对大鼠肝星状细胞（HSCs）增殖及Ⅰ型胶原合成的影响。方法：合成了特异性的PDGF-B硫代磷酸ASODN及其对照错义寡脱氧核苷酸(MSODN)，并将其加入至培养的HSCs。采用MTT法检测PDGF-B ASODN对HSCs的增殖抑制作用，RT-PCR检测PDGF-B和collagen-Ⅰ mRNA的表达，流式细胞仪与ELISA法分别检测PDGF-B的表达和Ⅰ型胶原的合成。 结果：PDGF-B ASODN在终浓度为10 μmol/L，作用HSCs-T6细胞48 h时，能明显地抑制其增殖，降低PDGF-B和collagen-ⅠmRNA的表达；FCM与ELISA分析表明，HSCs表达PDGF-B和合成Ⅰ型胶原都明显低于对照组，而对照组寡脱氧核苷酸在相同浓度下未见抑制效应。结论：PDGF-B ASODN可以抑制HSCs的增殖、Ⅰ型胶原的合成、内源性PDGF-B的表达，可能成为一种有用的抗肝纤维化基因治疗的药物。     

感染性休克大鼠肺组织内TNFα、IL—1β表达及行气破瘀汤的调节作用

目的探讨银杏叶提取物(EGb)对内毒素休克大鼠的保护作用及其可能机制.方法Wistar大鼠40只,随机分成对照组、内毒素休克模型组和EGb预处理组.对照组大鼠给予等量生理盐水,内毒素休克模型组经尾静脉注射大肠杆菌内毒素(LPS)20mg/kg;EGb预处理组在注射内毒素之前给予EGb10-90mg/kg,分别观察平均动脉血压,血清血小板活化因子(PAF)与丙二醛(MDA)水平及实验大鼠6h存活率.结果LPS静脉注射可引起实验大鼠平均动脉血压双相降落、第二相血压降落幅度是对照的31.2%±7.8%,持续时间133.4±64.5min;血清PAF和MDA水平均明显升高(P＜0.01);6h死亡率为62.5%(5/8).EGb腹腔注射预处理可明显抑制内毒素休克第二相血压降落,降落幅度减小、时程缩短(P＜0.05);EGbl0,30,90mg/kg可剂量依赖性地降低由LPS介导的PAF[(24.1±2.2),(16.5±3.1),(8.4±1.9)μg/Lvs(28.7±4.2)μg/L]的升高和MDA[(2.8±0.9),(2.1±0.7),(1.3±0.4)nmol/Lvs(4.5±1.1)nmol/L]的增加(P＜0.01);死亡率降至12.5%(3/24).讨论由内毒素引起的多器官功能衰竭的病理过程中,内源性炎性介质PAF和自由基的大量产生和释放起着关键性作用,EGb主要活性成分银杏黄酮和银杏内酯的分子中含有多个还原性羧基功能基团,可直接清除、捕获自由基,抑制MDA等有害物质的形成,银杏内酯也是一种天然特异性的PAF受体阻断剂,可拮抗内源性PAF的产生和作用,从而减轻内毒素引起的组织细胞损伤.结论本实验结果表明,银杏叶提取物可显著改善实验大鼠内毒素休克发生发展的病理生理过程、降低死亡率,其机制可能是通过抑制血小板活化因子的释放和对自由基的清除.     

用反义寡核苷酸阻断热休克蛋白70表达诱导卵巢癌细胞凋亡

目的 观察特异性热体克蛋白７０（ｈｅａｔ－ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ,ＨＳＰ）反义寡核苷酸阻断卵巢癌细胞的ＨＳＰ７０表达,及其对卵巢癌细胞生长和增殖的影响。方法 用胎盘蓝拒染法计算卵巢癌细胞的生长抑制率。Ｇｉｅｎｓａ染色法从形态上了解凋亡的发生,用琼脂糖凝胶电脉进一步检测发生凋亡的特征性ＤＮＡ降解,流式细胞仪定量分析凋亡发生率及周期性异性。结果 用ＨＳＰ７０反义寡核苷酸处理的卵巢细胞表现有显的生长     

修饰的反义寡脱氧核苷酸对胰腺癌细胞生长和靶基因表达的抑…

观察修饰过的反义寡脱氧核苷酸对人胰腺癌细胞生长和靶基因表达的抑制作用。     

IL-6表达增高及TNFα下调参与bcl-2反义寡脱氧核苷酸诱导的细胞凋亡的调控

目的 探讨bcl-2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸（antisense phosphorothioate oligodeoxynucleotide,AS-PS-ODN)诱导细胞凋亡的调控机理。方法 合成bcl-2 AS－PS－ODN作用于小细胞肺癌细胞株NCI－H446，流式细胞仪DNA倍体分析和脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法检测细胞凋亡；多重半定量逆转录－聚合酶链反应检测bcl-2 AS－PS－ODN处理前后bcl-2，c-myc,survivin,bax,s100A2,TNFα，TGFβ1及IL－6等基因mRNA表达的变化。结果 bcl-2 AS－PS－ODN能够诱导NCI－H446细胞凋亡，随着bcl-2 mRNA水平的下降，IL－6表达增高72．71％（P＜0．05），TNFα表达下调65．90％（P＜0．05），而c-myc,survivin,bax,s100A2,TGFβ1等基因的表达无明显变化。结论 IL－6表达增高及TNFα下调参与bcl-2反义寡脱氧核苷酸所诱导的细胞凋亡的调控。     

噻庚啶、山莨菪碱对内毒素休克TNFα表达的影响

目的：研究噻庚啶山菪碱对内毒素休克TNFα况表达的影响。方法：Wistar臣鼠脉注射脂多糖（LPS,EcoliO111B45mg/kg)复制内毒素休克模型。Northem印迹杂交分析肝脏TNFαmRNA表达,放射免疫法测定血浆TNFαW的含量。结果：LPS攻击后2h,大鼠肝脏TNFαmRNA表达显著高于盐水对照;（杂交信号经扫描仪半定量分析对．兀19幼。盐水对照11．防止7．m,P＜001）;血浆TNFα流水平明显升高：（211.52±3.16）μg/LvsLPS攻击前（2.19±0．95）μg/L,P＜0．01。静脉注射IPs后立即给予噻庚啶（Cyp,5mg/kg）、山茛菪碱（Ami,10mg/kg）,均能显著抑制LPS诱导的大鼠肝脏TNFαmRNA表达,降低血浆TNFα流含量;提高休克大鼠的平均动脉血压（MAB）及休克小鼠的24h的存活率。结论：Cyp和Ani均显著抑制内毒素休克TNFα基因表达,具有较强的抗休克作用。     

反义survivin联合顺铂抑制裸鼠荷骨肉瘤生长

目的：探讨反义基因治疗与化疗联合应用提高骨肉瘤疗效的可行性及其机制。 方法:通过构建荷骨肉瘤裸鼠模型，采用瘤内注射和腹腔给药方式，以 survivin反义寡核苷酸（ASODN）配合顺铂（DDP）对瘤鼠进行联合干预治疗，并与各单药组进行比较，观测各组裸鼠肿瘤生长情况、评估瘤体病理形态，免疫组织化学法检测瘤组织survivin蛋白表达，DNA末端原位标记法(TUNEL法)检测肿瘤细胞凋亡水平。 结果:与各单药组相比，联合治疗组在显著下调survivin蛋白表达同时，肿瘤细胞凋亡坏死更为明显，肿瘤生长受抑效果更强。 结论:ASODN对DDP具有明显增效作用，可弥补DDP耐药缺陷，二者联合可望发挥协同抗瘤效应。     

反义肿瘤坏死因子α对小鼠眼内单疱病毒感染影响的实验研究

目的观察局部使用肿瘤坏死因子α反义寡核苷酸（TNF-α-ASON）对小鼠眼内单纯疱疹病毒（herpes simplex virus,HSV）-1感染的影响。方法将HSV-1注入小鼠前房建立动物模型。分别于建模前1d,建模后1d和4d结膜下注射TNF-α-ASON和PBS。8d和10d后观察两组小鼠眼部的炎症改变,测定病毒复制和眼内TNF-α含量。结果与对照组相比,8d时实验组葡萄膜炎发病率和眼内TNF-α含量显著降低（P〈0.01）,眼内HSV-1滴度无明显改变;10d时葡萄膜炎发病率和眼内HSV-1滴度都显著升高。结论局部使用TNF-α-ASON可以显著降低HSV-1感染小鼠眼内TNF-α含量,降低视网膜炎发病率。TNF-α在眼内具有抑制HSV-1复制的作用。     

N-copine基因反义核酸对原代培养的小鼠皮质神经元的影响

目的：通过研究N-copine基因反义核酸(ant isense)对体外培养的小鼠大脑皮质神经元的影响，在细胞学层面上探索N-copine基因的功 能。 方法： 原代培养小鼠大脑皮质神经元，用反义核酸抑制N-copine基 因的表达，分析抑制N-copine基因表达对神经元生长及死亡的影响。 结果：寡核苷酸处理72 h，antisense组神经元轴突长度短了而且胞体变小，而对照组神经元轴 突和胞体都正常生长；antisense组台盼蓝着色细胞明显多于对照组，培养液中LDH活力明显 高于 对照组。 结论： 抑制N-copine基因表达，能影响体外培养的皮质神经元 的生长，并导致神经元严重损伤和死亡。这提示N-copine可能是神经元的一种保护性蛋白， 可能具有防止神经元退变和促进再生的重要作用。     

Survivin反义寡核苷酸抑制肝癌裸鼠皮下移植瘤生长的作用

目的：研究survivin反义寡核苷酸（ASODN）对人肝癌耐药细胞株移植裸鼠皮下后，移植瘤生长的抑制作用。方法:将人肝癌耐药细胞系SMMC-7721/ADM裸鼠移植瘤模型，随机分为：空白对照组、单纯脂质体转染组、正义链转染组、200 μg/L ASODN组、400 μg/L ASODN组和600 μg/L ASODN组，观察裸鼠移植瘤体积，计算抑瘤率。免疫组化检测Survivin蛋白的表达。结果:A组、B组和C组移植瘤随时间增长而增大，但3组间无显著差异（P>0.05）。D组、E组和F组注射ASODN后，裸小鼠移植瘤的体积随着注射ASODN时间的延长和ASODN浓度的增加，移植瘤生长越来越小，并呈时间-剂量-效应依赖性。实险第20 d D组、E组和F组的肿瘤抑制明显大于A组、B组和C组（P<0.05）。HE染色见对照组移植瘤细胞密集成群，核大深染，而ASODN组见肿瘤细胞少，癌细胞皱缩变圆，胞核固缩深染。免疫组化见对照组肝癌细胞浆Survivin蛋白表达较强，而ASODN组Survivin蛋白表达较弱。结论:Survivin反义寡核苷酸能够抑制裸鼠皮下移植瘤的生长。