胚胎干细胞诱导发育为树突状细胞的研究

目的：探讨胚胎干细胞（ESC）诱导分化为树突状细胞（DC）的实验方法，实现体外大规模扩增高纯度DC用于临床免疫治疗。方法：E14小鼠胚胎干细胞系在GM-CSF与IL-3联合作用下经胚胎体（EB）诱导分化为DC。不成熟DC （im-DC）流式细胞仪检测CD11c、CD80、CD86、MHC II-DR表达。用磷酸脂多糖（LPS）促进DC的成熟，收获细胞后观察细胞形态及摄片并做扫描电镜检查，分析细胞表型并与不成熟DC细胞表型做对比，异体淋巴细胞增殖实验行功能检测。结果：ES细胞来源DC呈典型DC形态学表现。im-DC CD11c、CD80、CD86、MHC-II表达低,m-DC CD11c、CD80、CD86、MHC-II的表达均较前明显升高。功能检测发现，ES细胞来源的DC具有强烈的激发同种异体淋巴细胞增殖的作用，证实ES细胞来源的DC具备正常的免疫学功能。结论：使用GM-CSF联合IL-3能成功诱导E14胚胎干细胞发育为DC。故ES细胞可作为DC来源的一条新途径，对于体外大规模制备DC用于免疫过继治疗提供了一个较好的方法。     

体外分化胚胎干细胞为造血干细胞重建造血功能的研究

目的：探讨体外定向分化胚胎干细胞（ESCs）为造血干细胞（HSCs）对体内造血功能的重建作用。方法：将小鼠E14.1胚胎干细胞采用“三步诱导法”在体外分化发育为HSCs，造血克隆形成(CFU)实验观察其体外造血集落形成情况，免疫磁珠分选纯化HSCs移植给经亚致死剂量γ射线照射的雌性SCID小鼠，观察其植入及小鼠造血功能恢复情况。结果: 经过分阶段诱导，多种造血刺激因子联合应用能有效促进ESCs定向分化发育为HSCs,流式细胞仪检测HSCs特异性表面标志物CD34+/Sca-1+表达最高为（58.64±4.20）%，CFU培养能形成较多的红系、粒系/巨噬细胞系及混合细胞集落, Wright-Giemsa 染色显示为原始的造血细胞。此阶段的HSCs经分选纯化后移植给经γ射线照射后的小鼠，移植组小鼠+10 d造血功能开始恢复，观察40 d后除血小板恢复较慢外，白细胞、红细胞、血红蛋白等指标已接近正常，植入率为71.4%，存活率为43.0%，染色体检测证实已由受体鼠的XX转为供体鼠的XY。结论: 采用分阶段诱导的方法，可在体外定向诱导小鼠ESCs分化发育为HSCs，此来源的HSCs可以有效重建体内造血功能。     

体外诱导胚胎干细胞定向分化为神经细胞的初步研究

目的 初步研究诱导胚胎干细胞ES－D3细胞系向神经细胞定向分化可能性,为青光眼等视网膜视神经疾病的治疗提供可能的途径。方法 以Buffalo大鼠肝细胞培养上清进行胚胎干细胞ES－D3细胞系培养,参照Bain等方法进行改良,以视黄酸对ES－D3细胞进行分化诱导,1d后加入阿糖胞苷,相差显微镜下观察细胞生长情况。结果 加入视黄酸后1d,相差显微镜下可见散在1个、2个或多个突起的神经样细胞。加入视黄酸后2d、阿糖胞苷后第1d,可见大量1条、2条或多条突起的神经样细胞,并相连成网络结构。结论 视黄酸辅以阿糖胞苷在体外可成功诱导胚胎干细胞ES－D3细胞系成为神经样细胞,并形成网络,结合我们裸鼠眼内接种ES－D3细胞分化为神经细胞样细胞研究结果,胚胎干细胞定向分化及移植,可望成为青光眼等视网膜视神经疾病治疗的一个新的途径。     

含人AGM区基质细胞培养体系定向诱导胚胎干细胞为造血干细胞的实验研究

目的： 体外模拟胚胎早期AGM区造血微环境，诱导胚胎干细胞（ESCs）分化为造血干细胞（HSCs）。方法：将小鼠E14 ESCs在含BMP-4及VEGF的半固体培养基中诱导为拟胚体（EB），分别于3、6、9、12、15 d时收获EB，流式细胞术检测Flk-1+细胞含量。取Flk-1+ 细胞处于高峰期的EB细胞，在人AGM区基质细胞饲养层上进一步诱导分化，并设无饲养层对照，分别于3、6、9、12 d时收获细胞计数、流式细胞术检测Sca-1+c-kit+ 细胞含量，并分析造血细胞集落形成能力。结果：诱导E14细胞形成EB过程中添加BMP4+VEGF的因子组Flk-1+细胞在第9 d达峰值（27.53%± 2.84％），与未添加因子组（8.77%± 1.12％）比较差异显著(P<0.05)。将培养9 d的EB细胞在hAGMS3、hAGMS4饲养层上进一步诱导分化，第6 d时Sca-1+c-kit+细胞达峰值，分别为7.31%±1.21％、7.62%±1.52％，其绝对数分别扩增(2.57±0.48)倍、(2.35±0.36)倍，与无饲养层组比较显著差异（P<0.05）。该分化阶段的Sca-1+c-kit+细胞具有形成各系造血细胞集落的能力。结论：人胚早期AGM区基质细胞能促进小鼠ESCs定向分化为HSCs，为研究ESCs分化为HSCs的分子机制提供了实验模型。     

体外定向诱导小鼠胚胎干细胞发育为造血干/祖细胞方法的初步研究

目的:探讨体外定向诱导胚胎干细胞(ESC)发育为造血干细胞(HSC)的方法。方法:将小鼠E14胚胎干细胞在含干细胞生长因子(SCF)和血管内皮生长因子(VEGF)的甲基纤维素培养基中首先诱导发育为胚胎体(EB),再将EB置于均含SCF、VEGF、IL-3、IL-6及促红细胞生成素(EPO)的3种不同培养体系中定向分化为HSC,并观察HSC表面标志性抗原、造血集落形成及瑞氏-姬姆萨染色的结果。结果:经两阶段诱导ESC分化为HSC,发现在甲基纤维素半固体培养体系中HSC发育缓慢,分化14d后CD34+/Sca-1+细胞数最高为(31.5±4.7)%;而在骨髓基质细胞饲养层上HSC发育较快,细胞数量较多,分化第10dCD34+/Sca-1+细胞数即达到峰值,为(47.8±6.3)%;骨髓基质细胞饲养层+胎肝基质细胞上清培养体系中HSC发育同样迅速,所产生的CD34+/Sca-1+细胞数量在3个体系中最高,为(53.6±7.2)%。经瑞氏-姬姆萨染色证实上述细胞为早期造血细胞,均有形成各系造血细胞集落的能力。结论:使用骨髓基质细胞饲养层+胎肝基质细胞上清培养体系及SCF、VEGF、IL-3、IL-6及EPO等细胞因子,通过两阶段诱导分化,可从小鼠ESC获得较高比例的HSC。     

体外诱导小鼠胚胎干细胞分化为神经干细胞的实验研究

目的:探讨体外诱导小鼠胚胎干细胞(ESCs)分化为神经干细胞(NSCs)的可能性。方法: ESCs经胚胎体阶段, 以视黄酸及视网膜müller细胞诱导, 在NSCs选择性培养基中筛选培养扩增7d, 观察形态变化, 采用RT-PCR法检测nestin、glutaminase、Brn-3基因表达及免疫细胞化学法检测nestin等NSCs特异性标志物, 并对其扩增及分化能力进行观察。 结果:ESCs经初级诱导, NSCs选择性培养基筛选培养7d后, 形成大量神经球样结构, 可扩增传代。绝大部分神经球样结构呈nestin抗原阳性, 整合BrdU, 表达nestin、glutaminase、Brn-3基因, 且可分化为神经元及神经胶质样细胞。结论:视黄酸及müller细胞诱导的ESCs, 经选择性培养基筛选培养可获得NSCs, 有望为青光眼等神经变性疾病提供新的治疗途径。     

比较体外不同条件诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞的实验研究

目的:比较体外不同分化条件下胚胎干细胞(ESC)分化为心肌细胞的分化比率。方法:用布法罗大鼠肝细胞(BRL)条件培养基抑制ESC分化及保持其增殖,以维甲酸(RA)、二甲基亚砜(DMSO)、转化生长因子β₁(TGF-β₁)及激活素-A(activin-A)为分化诱导剂,组合成6种分化培养基,采用悬滴悬浮、贴壁三步法诱导ESC分化为心肌细胞,比较各组分化比率。结果:6种分化条件均能使ESC分化为心肌细胞,其中以TGF-β₁(2 μg/L)、activin-A(20 μg/L)及20%胎牛血清(FCS)组成的分化培养基可以使高达92.80%±2.22%的ESC分化为心肌细胞,分化比率显著高于其它各组(P＜0.01)。结论:以BRL条件培养基培养,TGF-β₁、activin-A作分化诱导剂可作为一种理想的ESC体外分化体系。     

人和几种常用实验动物胚胎干细胞体外培养的研究进展

胚胎干细胞（embryonic stem cell,ES cell）也称ES细胞,是一种存在于着床前早期胚胎中的具有全能性的细胞,其具有无限增殖、全向分化和嵌合生殖的能力。近年来动物实验受动物来源及动物饲养与实验条件的限制和各国动物保护主义的意识的约束,因此寻找动物实验替代模型已成为各国研究的当务之急。而胚胎干细胞则是实验动物模型的最佳替代模型。使胚胎干细胞能成为实验动物替代模型的首要问题是如何在体外培养出在促进胚胎干细胞增殖的同时,又能维持其未分化二倍体状态的胚胎干细胞。本综述主要陈述人和几种常用实验动物胚胎干细胞的体外培养建系的研究进展。     

胚胎干细胞的研究进展

一、研究现状胚胎干细胞 (ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌ,ＥＳ)是从早期胚胎中发现、能在体外培养的一种高度未分化细胞 ,它具有发育成各种细胞的潜能。主要来源于两种组织 :早期胚胎细胞团分离的ＥＳ细胞和胚胎生殖嵴分离的胚胎生殖细胞 (ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｇｅｒｍｃｅｌｌ,ＥＧ) ,两者的形态、标志、体内分化潜能及种系传递功能都相似[1] 。ＥＳ细胞的研究以小鼠拉开序幕 ,扩展至其它动物 ,最终进入人类ＥＳ细胞研究的主题。 1981年Ｅｖａｎｓ等首次在延缓着床的小鼠胚胎中发现了ＥＳ细胞[2 ] ,Ｍａｒｔｉｎ[3] 、Ａｘ ｅｌｅｒｏ…     

诱导体外培养小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞方法的研究

目的:采用布法罗大鼠肝细胞条件培养基代替重组LIF,建立在不加任何化学诱导剂的情况下诱导体外培养小鼠胚胎干细胞(ES细胞)分化为心肌细胞的方法。方法:在诱导分化实验前,应用BRL条件培养基来维持ES细胞生长和抑制其分化,并采取将悬滴培养法和聚集培养法结合起来,分三步诱导ES细胞分化的方法。结果:分化细胞中可见节律性收缩的细胞,经超微结构分析和免疫细胞学鉴定为心肌细胞。结论:本法无需添加化学诱导剂,为一种简便、经济的诱导体外培养小鼠ES细胞分化为心肌细胞的方法。     

促进胚胎干细胞来源造血干/祖细胞移植后细胞免疫功能恢复

目的:体外诱导胚胎干细胞分化为造血干/祖细胞过程中, 增加成熟T淋巴细胞的含量, 以促进其重建致死量照射小鼠的造血功能后免疫功能的早期重建。方法:胚胎干细胞在含甲基纤维素的培养基中自由分化形成胚胎体, 分化第6d添加造血生长因子, 同时添加胸腺肽, 流式细胞仪检测分化细胞中CD₃₄⁺的造血干/祖细胞和CD⁺₃的成熟T淋巴细胞含量, 最后将分化细胞注射入致死量照射小鼠体内, 观察60d, 以移植物抗宿主病(GVHD)发病率作为T淋巴细胞免疫功能的指标, 用PCR检测Sry反映移植细胞在宿主体内的存活。结果:分化第13d, 未加胸腺肽, CD⁺₃的成熟T淋巴细胞含量仅10.52%, 重建造血后无GVHD发生;添加胸腺肽, CD⁺₃的成熟T淋巴细胞含量升高达22.93%, 重建造血后GVHD发病率100%。结论:胚胎干细胞体外分化为造血干/祖细胞过程中, 添加胸腺肽, 能增加CD⁺₃的成熟T淋巴细胞含量, 体内重建造血后细胞免疫功能恢复较快。     

胚胎体外培养及胚胎干细胞系的建立

背景：人类胚胎干细胞体外建系成功,对人类胚胎发育机制和发育生物学研究、细胞和组织移植治疗某些疾病等领域都有重大意义。目的：综述近年来关于胚胎体外培养及建立胚胎干细胞系的研究进展,重点探讨胚胎体外培养影响因素、人废弃胚胎培养分离内细胞团建立胚胎干细胞系的方法及建立胚胎干细胞系的条件。方法：以“胚胎(embryo),胚胎干细胞(embryonic stem cell),共培养(co culture),序贯培养(sequential culture)”为检索词,由第一作者检索2000至2014年CNKI数据库和SCI数据库,获取有关胚胎体外培养、移植及胚胎干细胞建系的相关文献,并进行系统评价,最终保留58篇文献进行分析。结果与结论：胚胎体外培养条件是影响胚胎移植结局的重要因素,其中包括培养液的成分和培养体系。在过去的研究过程中,培养液的构成及应用已经发生了很大的变化,培养体系也从单一培养发展到共培养、序贯培养。伦理问题及胚胎来源的限制束缚着人胚胎干细胞系的建立,利用临床废弃的低质量的胚胎可作为建立人胚胎干细胞系的材料来源之一,有效的缓解了建立人胚胎干细胞系过程中胚胎缺乏的问题,并减少其中的伦理学纷争。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

造血干细胞体外扩增影响因素的研究进展

造血干细胞的体外扩增是在模拟体内造血系统的基础上,通过添加造血生长因子和其它有利于扩增的成分,来实现HSCs体外的生长和扩增.近年来,随着对造血干细胞生物学特性研究的不断深入,对HSCs体外扩增影响因素的研究取得了较大进展.就HSCs体外扩增影响因素的进展作一综述.     

胚胎干细胞直接向神经细胞诱导分化的实验研究

目的:探讨不经拟胚体(EB)培养阶段，应用维甲酸(RA)在体外直接将胚胎干细胞(ESC)诱导分化为神经细胞的可行性和效果。 方法:ESC消化后分为A、B、C、D 4组，A、B组进行EB培养后，A组用RA进行诱导分化，B组不添加RA使其自由分化,C、D组不经EB培养阶段，C组直接用RA诱导分化，D组自由分化。倒置相差显微镜及扫描电镜观察细胞形态变化，免疫细胞化学及流式细胞术观察各组第 9 d 分化细胞微管相关蛋白-2(MAP-2)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达情况。 结果:A、C组诱导分化的神经样细胞逐渐增多，并形成密集的神经网络样结构，9 d 时大部分为MAP-2阳性细胞，MAP-2阳性率显著高于B、D组(P<0.01)。B、D组以圆形上皮样分化细胞为主，9 d 时绝大部分为GFAP阳性细胞，GFAP阳性率显著高于A、C组(P<0.01)。A、C组之间或B、D组之间的MAP-2及GFAP阳性率均无显著差异(P>0.05)。 结论:在体外，可不经EB阶段，应用RA直接将ESC诱导分化为神经细胞，改良的ESC诱导分化方法与传统的RA4-/4+方法效果相同，可取代传统方法。     

人胚胎成纤维细胞对人胚胎干细胞生长的作用

目的：比较人和小鼠胚胎成纤维细胞对人胚胎干细胞生长的作用,为胚胎干细胞定向诱导各系统细胞应用于临床,消除异种蛋白污染打下基础。方法：分别采用人胚胎成纤维细胞和小鼠胚胎成纤维细胞为饲养层细胞,支持人受精卵的培养,观察其增殖和分化情况。结果：人和小鼠胚胎成纤维细胞分别加入白血病抑制因子（hLIF）均能很好支持人胚胎干细胞生长增殖,并保持未分化状态。结论：完全可以使用人胚胎成纤维细胞支持人胚胎干细胞增殖,消除异种蛋白污染的可能性,为胚胎干细胞定向诱导分化发育应用于临床打下坚实基础。     

建立人胚胎干细胞系的研究进展

(引言 ) :本文概括介绍了人类胚胎干细胞系的建立、其广阔而独特的应用前景及发展中可能出现的问题和障碍。　　在最近一期的ＳＣＩＥＮＣＥ( 1 998年 1 1月 6日出版 )和ＰＮＡＳ( 1 998年 1 1月 1 0日出版 )杂志上 ,分别报道了两个实验室以不同手段几乎同时成功地建立起人胚胎干细胞系 ,学者们给予了极高的评价 ,反映人们在这一领域长时间的期望和对将来的热切憧憬。本文介绍这一领域的历史、现状和展望。存在于哺乳动物发育早期胚胎 (着床前 )中的多能干细胞 ,具有持续增殖而不分化的能力 ,以及经诱导后可分化形成一个成熟个体中所有类型…