LAMP和PCR法检测痢疾志贺菌的特异性和灵敏性比较

目的建立环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测痢疾志贺菌,并对其特异性、灵敏度与传统PCR进行比较。方法以痢疾志贺菌侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)为靶序列,设计6条特异性引物(内引物、外引物和环引物各2条),优化LAMP反应体系及反应条件,检测LAMP反应的灵敏度、特异性及模拟样品,同步与PCR进行比较。结果 LAMP法和PCR均能特异性地扩增出志贺菌靶DNA,而其他非志贺菌均未扩增出特有条带。检测细菌纯培养物和模拟食品的灵敏度LAMP法分别为5.3×101cfu/ml、6.8×101cfu/ml,PCR法分别为5.3×102cfu/ml和6.8×102cfu/ml。结论利用LAMP技术,可快速、灵敏、简便地检测痢疾志贺菌,与PCR方法比较,特异性强、操作简便、检测成本低、耗时短,有望发展成为快速检测痢疾志贺菌的有效手段。     

改良分子信标实时PCR快速检测大肠杆菌O157：H7

目的建立改良分子信标实时PCR快速检测大肠杆菌O157：H7的快速方法。方法根据GenBank公布O157：H7的rfbE保守序列，设计一对引物和改良分子信标探针，用FAM荧光剂标记探针的5’端，建立改良分子信标实时PCR检测O157：H7的反应体系，应用于食物中毒快速诊断和食品微生物检测。结果共检测11种细菌。只有大肠杆菌O157：H7有荧光信号，其余10种全无荧光信号，且与其他细菌无交叉反应，DNA灵敏度为64fg，菌液灵敏度为59cfu／ml或2cfu／PCR反应体系。应用改良分子信标实时PCR反应体系检测10株O157：H7均出现特异的荧光信号，无干扰。对89份食品样品进行检测，5份O157：H7实时PCR阳性，其余样品为阴性，检测仅需2h。5份阳性样本，经传统方法培养，有3份检出大肠杆菌O157：H7。结论改良分子信标实时PCR检测体系快速、灵敏度高，特异性强，可用于大肠杆菌O157：H7食物中毒的快速诊断和食品微生物检测，为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。     

免疫磁珠富集-实时荧光PCR检测生畜肉中大肠埃希菌O157∶H7的实验研究

目的 建立免疫磁珠富集(immunomagnetic separation,IMS)-实时荧光PCR(q PCR)技术快速检测肠出血性大肠埃希菌O157∶H7的方法。方法 根据肠出血性大肠埃希菌O157∶H7抗原特异性基因rfb EO157设计引物和Taq Man探针,建立q PCR检测体系;对样品中的O157∶H7大肠埃希菌用出血性大肠O157抗体标记免疫磁珠进行特异性捕获,再利用q PCR技术对磁珠吸附的菌株进行检测。结果 采用IMS-q PCR方法检测,当25 g样本中菌量为100cfu,样品被1∶2稀释时,检测结果呈阳性,检测全过程需时2~3 h。结论 IMS-q PCR检测O157∶H7大肠埃希菌的方法具有灵敏度高、特异性强、快速等优点,可用于大肠埃希菌O157∶H7食物中毒的快速诊断和食品微生物检测,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。     

肠出血型大肠埃希菌免疫PCR检测方法的建立

目的建立检测肠出血型大肠埃希菌O157：H7的免疫PCR技术,确定该方法的灵敏度和特异性。方法链亲和素桥联生物素化的二抗和双链DNA指示分子,构建桥联系统,进而建立免疫PCR技术,通过PCR扩增指示分子检测O157：H7。结果免疫-PCR技术最少可检测到10 CFU/ml的纯培养菌,灵敏度较ELISA提高103倍,非O157：H7菌株检测结果均为阴性。结论免疫-PCR技术具有较高的灵敏度和特异性,操作简便、快速,可作为肠出血型大肠埃希菌O157：H7的检测方法。     

实时荧光PCR同时检测金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157：H7

目的建立改良分子信标一双重实时荧光PCR同时检测金黄色葡萄球菌和大肠杆菌0157：H7,应用于细菌性食物中毒的快速诊断。方法根据GeneBank公布的金黄色葡萄球菌nuc基因序列和大肠杆菌O157：H7rfbE基因序列,设计引物和改良分子信标探针,建立改良分子信标一双重实时PCR检测体系。结果双重荧光PCR反应体系检测151株金黄色葡萄球菌和27株大肠杆菌O157：H7,均出现特异的荧光信号,两种细菌检测互不干扰。对8762份大便、食品等标本进行检测,315份标本金黄色葡萄球菌实时荧光PCR阳性,其中286份金黄色葡萄球菌培养阳性;31份标本大肠杆菌O157：H7实时荧光PCR阳性,其中26份大肠杆菌O157：H7培养阳性。从样品处理到检测结果仅需要时间2h～1d。结论改良分子信标-多重实时荧光PCR检测体系快速、灵敏度高,特异性强,可用于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157：H7食物中毒的快速诊断和肠道传染病的初筛,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。     

环介导恒温扩增技术快速检测大肠杆菌O157特异基因的建立

目的 建立环介导的恒温扩增快速检测大肠杆菌O157的方法。方法 采用环介导的恒温扩增反应（LAMP）技术扩增大肠杆菌O157特异性基因,并与传统PCR比较。结果与传统的PCR技术相比,LAMP法更加简便快速、且在等温条件下进行,具有更高的灵敏性;特异性100%。结论 该方法具有灵敏度高,特异性强,操作简便快速,不需要复杂仪器设备、为临床检测大肠杆菌O157提供了一个快速简便的新方法。     

肠出血性大肠杆菌O157:H7流行病学调查

目的 了解芜湖县动物宿主携带肠出血性大肠杆菌 O157:H7的情况,为防治工作提供依据.方法 选择芜湖县境内家畜粪便、水样以及各类养殖场饲料等标本821份,以免疫磁珠法和血清学方法检测EHEC O157:H7.结果 821份标本检出1株EHEC O157:H7,检出率为0.12%.结论 芜湖县部分动物携带EHEC O157:H7.     

长沙市岳麓地区大肠埃希菌O157∶H7宿主动物带菌情况调查

目的:调查湖南省长沙市岳麓地区不同乡镇大肠埃希菌O157:H7宿主动物带菌情况.方法:2011年5月采集长沙市岳麓地区境内鸡、鸭、猪、牛等家畜家禽的粪便标本307份,按国标常规培养法检测大肠埃希菌O157:H7.并采用PCR对分离菌株O157的抗原特异性基因rfb EO157进行检测.结果:307份标本中共检出阳性标本6份,总阳性率为1.95％(6/307),其中散放的鸡、鸭、猪带菌阳性率分别为1.67％(3/180)、14.29％(1/7)、2％(2/100).且分离的6株大肠埃希菌O157:H7特异性基因rfb EO157均为阳性.结论:长沙市岳麓地区家畜家禽已存在大肠埃希菌O157:H7感染,应引起足够的重视.提示加强宿主动物大肠埃希菌O157:H7监测,对疫情的分析和疫情预测具有重要意义.     

检出山梨醇阳性肠出血性大肠杆菌O157:H7一例及特征分析

目的:肠出血性大肠杆菌O157:H7(entro-hemorrhaguc E.Coli O157:H7 or EHEC O157:H7)是具有强致病力的条件致病菌,该菌可通过污染的食物、水、以及直接接触感染的人或动物而感染。加强对该菌的检验,对预防与控制由该菌所致的感染流行十分重要。方法:本文参照中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 0973-2000方法进行检验。结果:从进口冻猪肚中检出一例EHEC O157:H7,并用PCR方法检测VERO毒素呈阳性。结论:该菌株的生化特征与相关文献报道的EHEC O157:H7生化特征不同的是山梨醇阳性,棉籽糖阴性,检验过程中应慎重鉴别。     

多联实时荧光PCR定量方法检测四种肠道细菌的研究

目的 建立一种能同时检测空肠弯曲菌(CJ)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157：H7、副溶血性弧菌(VP)和单核增生李斯特菌(LM)的多联实时荧光PCR定量方法。方法根据CJ的C基因序列、EHEC O157：H7的RFBE基因序列、VP的toxR基因序列和LM的iap基因序列的开放阅读框(ORF)，分别利用ABI primer experess 2．0和DNAStar中的Primer Seleet软件设计出了数对特异性的引物和探针，筛选出最佳的各组引物和探针组合，对引物、探针的浓度、Mg^2 浓度、Taq酶的用量、反应条件等进行优化，从而建立了检测临床标本中CJ、O157：H7、VP和LM的多联荧光PCR反应体系和检测方法。结果实验显示该方法具有特异性强，灵敏度高，均达到100copies／ml。结论多联实时荧光PCR方法可定量检测临床标本中CJ、0157：H7、VP和LM，该法快速简便，准确高效，有利于上述病原菌所致痰病的早期诊断和治疗。     

河南省肠出血性大肠杆菌(EHEC O157:H7)感染之流行与基因特征研究

目的 :了解河南省肠出血性大肠杆菌 (enterohemorrhagicescherichiacoli,EHEC)的流行状况与流行菌株的志贺毒素基因型。方法 :采集河南省 14个监测点上腹泻病人、家畜家禽粪便和肉食品等标本分离E HEC菌株。应用分子生物学技术检测EHEC菌株的rfbO157、rfbO111、hlyA、eaeA、stx2 和stx1等毒力基因和志贺毒素基因亚型 ,应用细胞培养技术检测菌株Vero细胞毒性。结果 :从腹泻病人、家畜家禽、肉食品、苍蝇、蜣螂中均分离出EHECO15 7:H7菌株 ,波尔山羊的带菌率最高达到 2 9.8%。 13 8株携带志贺毒素基因的菌株中 ,EHECO15 7:H7计 95株 ,占产毒菌株的 68.8% ;EHEC非O15 7菌株 43株 ,占 3 1.2 %。菌株可分为 5种毒素基因型 ,EHECO15 7:H 7仅含stx2 基因 ,以stx2 vha亚型为主 ,不含有stx1基因。EHEC非O15 7血清型毒素基因型较复杂。携带stx1和 /或stx2 的菌株均具有Vero细胞毒性。结论 :河南省腹泻病人和家畜家禽中存在EHEC感染。EHECO15 7:H7血清型是优势菌型 ,羊是主要宿主动物。目前河南省EHECO15 7:H7菌株毒素基因型为stx2 并以stx2 vha亚型为主。     

4种食源性致病菌污染状况调查

目的了解肇庆市食品中沙门氏菌、单增李斯特菌、EHEC O157:H7和副溶血性弧菌的分布状况、动物储存宿主的种类、菌株生物学特点,初步确定可能污染上述致病菌的高危食品,为食物中毒监测提供科学依据。方法依据国标方法,采用进口显色培养基。对样本分别进行沙门氏菌、单增李斯特菌、EHEC O127:H7和副溶血性弧茵分离、生化及血清学鉴定。结果监测生肉(猪、牛、鸡)、熟肉、水产品三类样品共58件,共检出致病菌6株,总检出率10．3％。其中分离沙门氏菌4株,检出率6．9％;单增李斯特菌2株,检出率3．4％:EHEC O157:H7和副溶血性弧菌均未检出。3类食品中致病菌阳性率最高的为生肉(17．9％),其次为水产品(5．0％),熟肉未检出致病菌。结论肇庆市居民主要消费食品存在食源性致病菌污染,其中生肉是主要污染食品品种,生肉(猪肉)中沙门氏菌带菌率较高(30．0％),主要血清型为德尔卑沙门氏菌,熟肉未检出致病菌。     

大肠杆菌O157:H7体内多聚磷酸盐的DAPI荧光定量检测

目的应用荧光剂DAPI探索一种直接定量大肠杆菌O157:H7无机多聚磷酸盐（polyP）的可靠方法。方法提取并纯化大 肠杆菌O157:H7 野生株DNA,DAPI与DNA、polyP45结合,测定360 nm和415 nm激发光的发射光谱;应用共聚焦显微镜,观察 细菌DAPI-DNA和DAPI-polyP复合物荧光,验证DAPI检测polyP的可行性;细菌液氮速冻溶解、-80 ℃速冻溶解、-20 ℃速冻溶 解、60 ℃加热10 min、Triton x-100作用、室温下放置后倍比稀释涂平板,观察6种方法对细菌存活的影响;与DAPI作用后,测定 荧光值,确定细胞膜通透性的最佳前处理方法;建立标准曲线,测定EHEC野生株、ppk1 两个突变株polyP 含量。结果应用 360 nm 激发波长,DAPI-DNA最大发射波长为460 nm;应用415 nm 激发波长,DAPI-polyP 最大发射波长为550 nm;应用 405 nm激发光,收集DAPI-DNA蓝色荧光（425~475 nm）,应用488 nm激发光,收集DAPI-polyP绿色荧光（500~560 nm）;最佳 细菌前处理方法为-80 ℃速冻后室温下自然溶解;标准曲线为Y=1849X+127.5（R2=0.991）,测定各株菌polyP量,其中野生株显 著高于ppk1缺失突变株。结论DAPI荧光定量检测方法具有直接、可靠、易于操作、定量检测等特点,可为进一步研究polyP在 肠出血型大肠埃希菌O157:H7中的作用提供技术支持。     

网状分枝扩增技术快速检测大肠埃希菌O157∶H7及其他产志贺样毒素大肠埃希菌

目的：建立一种简便、快速、灵敏和特异的检测食品和临床标本中大肠埃希菌O157∶H7及其他产志贺样毒大肠埃希菌(STEC)的方法。方法：设计并合成了检测志贺毒素2(stx2)基因特异的环形探针和捕获探针，确定网状分枝扩增方法（RAM）的灵敏度；含有stx2基因的不同血清型的菌株包括O46∶H38、O22∶H8 、O111∶NM，用于RAM特异度的测定。用RAM检测所有分离的菌株，并进一步对瞬时RAM进行研究。结果：RAM最低能检测10个拷贝的stx2合成靶基因和临床分离的菌株，表明RAM与PCR具有一样的灵敏度。特异度的测定结果表明不同血清型的大肠埃希菌均为stx2阳性，而非致病性大肠埃希菌ATCC23716则为阴性。在32株菌株中，28株细菌含有stx2基因，其余则为阴性， 与PCR检测结果100%一致。瞬时RAM结果也表明最低能检测10个细菌，检测信号的出现依赖于样品的浓度。 结论：RAM的简便和等温扩增特点可替代PCR检测各种标本中大肠埃希菌O157∶H7和STEC。     

肠出血型大肠埃希菌O157:H7 espF 基因缺失株和回补株的构建

目的利用Red同源重组系统敲除肠出血型大肠埃希菌的espF基因及其核苷酸片段;建立以pBAD 33质粒为载体的espF
基因回补实验平台。方法设计1 对同源臂引物扩增卡那霉素抗性打靶片段,将抗性打靶片段电转入含有PKD46 质粒的
EDL933w,在PKD 46介导的重组系统帮助下,打靶片段和菌体espF基因发生同源重组,PCR和测序验证;PCR扩增espF及其核
苷酸片段的整个ORF区序列,将其克隆入pBAD33质粒,分别将重组质粒转入相应的缺失株,以构建出相应的回补突变株。采
用RT-PCR的方法验证在相应的回补突变株中espF及其核苷酸片段是否转录。结果构建了espF基因及其核苷酸片段缺失的
EHEC O157:H7 EDL933w突变菌株和相应的回补株,且espF基因及其核苷酸片段在回补株中均发生转录。结论本研究运用
Red重组系统构建了肠出血型大肠埃希菌O157:H7 espF基因缺失株,并建立以pBAD33质粒为载体的EHEC O157:H7基因回
补方法,为进一步研究肠出血型大肠埃希菌中espF基因的调控机制奠定了基础。
     

霍乱弧菌LAMP快速检测方法的建立及应用

目的 建立环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测霍乱弧菌.方法 针对霍乱弧菌外膜蛋白的ompW基因设计特异引物,优化反应条件,建立霍乱弧菌的LAMP检测方法.通过对47株细菌及模拟污染现场,检测该方法的灵敏度、特异度和实用性.结果 活菌计数方法表明建立的LAMP方法检测霍乱弧菌的灵敏度为1.6×10~2 cfu/ml.在人工污染霍乱弧菌的粪便及海水标本中检测的敏感度为1.6×10~3 cfu/ml,在牛奶标本中敏感度为1.6×10~4 cfu/ml.检测21株霍乱弧菌均为阳性,26株非霍乱菌则全部阴性,特异度为100%.结论 建立的LAMP方法检测霍乱弧菌灵敏度、特异度高,可用于霍乱现场监测和流行病学调查.

Abstract：

Objective To establish a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method for rapid diagnosis of Vibrio cholerae. Method Based on the ompW nucleic sequence of Vibrio cholerae, a pair of primers was designed for LAMP. The reaction conditions were optimized, and the specificity, sensitivity, and practicability of LAMP were tested using 47 baterial strains and simulated contaminated sites. Results The results of viable bacterium count showed that LAMP was capable of detecting Vibrio cholerae at a level as low as 1.6×10~2 cfu/ml. The minimal detectable concentration was 1.6×10~3 cfu/ml for simulated contaminated samples such as feces and seawater, and 1.6×10~4 cfu/ml for contaminated milk. All the 21 strains of Vibrio cholerae yielded positive results in LAMP, and the 26 strains of other bacteria all showed negative results, with a detection specificity of 100%. Conclusion The established LAMP method has high specificity and sensitivity for detecting Vibrio cholerae and is applicable in field monitoring and epidemiological study of Vibrio cholerae.