临床分离肺炎克雷伯菌生物膜形成能力及基因相关性研究

目的研究肺炎克雷伯菌生物膜形成能力及其与luxS、oqxB、rarA等基因的相关性。方法通过96孔板结晶紫染色法测定200株对亚胺培南、头孢他啶、环丙沙星和庆大霉素敏感的肺炎克雷伯菌（敏感组）和300株对上述药物耐药的肺炎克雷伯菌（耐药组）体外生物膜形成能力;采用扫描电镜观察不同生物膜形成能力肺炎克雷伯菌的生物膜形态特点;通过实时荧光定量PCR分析生物膜形成相关基因（luxS、oqxB、rarA、acrB、ramA、ompK36和micF）表达量。结果强生物膜形成能力组的平均生物膜形成量是弱形成能力组的16.8倍,敏感组和耐药组肺炎克雷伯菌生物膜OD590的平均值分别为0.783±0.642和0.672±0.534,差异无统计学意义;扫描电镜显示生物膜形成能力强的菌株团块内包含大量的生物膜,形态完整且细菌密集排列;强生物膜形成能力组中luxS表达水平分别为中等和弱形成能力组的5.98倍和3.37倍;外排泵、外膜蛋白编码基因及其调控基因的表达水平有统计学差异。结论肺炎克雷伯菌生物膜形成能力与luxS基因的表达量有关,luxS作为一个高阶调控基因,其与ramA、ompK36和micF等基因构成错综复杂的关系网,共同影响生物膜的形成。     

肺炎克雷伯菌KbvR调控因子对细菌生物膜与荚膜形成能力的影响

目的构建肺炎克雷伯菌LuxR家族KbvR基因缺失突变株与回补株,分析KbvR在肺炎克雷伯菌生长、生物膜形成及荚膜 生成中的作用。方法通过自杀载体pKO3-Km质粒构建KbvR基因敲除株,然后扩增出包含KbvR基因编码区、启动子结合区及 转录终止区的基因片段,克隆至pGEM-T-easy质粒上构建KbvR基因回补株。绘制不同菌株生长曲线,了解KbvR对细菌生长的 影响。通过结晶紫定量实验检测KbvR基因对细菌生物膜形成的影响,拉丝实验、离心试验及RT-PCR检测KbvR基因对细菌荚 膜形成的影响。结果成功获得KbvR基因缺失突变株及回补株,RT-PCR结果显示KbvR基因在缺失突变株中不表达,在回补株 中重新表达。KbvR基因不影响细菌的生长速度,基因敲除株后细菌生物膜形成及荚膜生成能力下降。体外试管静止培养48 h, 与野生株相比基因缺失突变株生物膜形成能力明显下降,而KbvR基因回补株在液体培养基表面能形成明显生物膜。结晶紫染 色定量实验发现,基因缺失突变株生物膜形成能力显著低于野生株（P<0.01）。超粘性实验和RT-PCR结果均显示,KbvR基因缺 失突变株荚膜形成能力明显下降,说明KbvR基因影响肺炎克雷伯菌生物膜和荚膜的形成。结论KbvR基因作为密度感应系统 LuxR孤儿调控转录因子,正调控肺炎克雷伯菌生物膜的形成。荚膜是细菌生物膜形成的重要因素,KbvR基因可通过影响荚膜 形成而调控生物膜的形成。     

肺炎克雷伯菌突变株ΔrcsB的构建及其菌株超粘性与生物膜表型

目的 构建肺炎克雷伯菌rcsB基因缺失的无痕突变株和回补株,通过对突变株的超粘性和生物膜表型进行分析,探讨转录调控子RcsB对细菌超粘性和生物膜形成能力的影响.方法 首先构建突变株ΔrcsB,PCR扩增rcsB基因上下游同源臂片段,克隆到质粒pKO3-Km上,将重组质粒导入肺炎克雷伯菌NTUH-K2044中,经同源重组后筛选得到无痕突变株.然后构建回补株,扩增rcsB基因片段,克隆到质粒pBAD33上,将重组质粒导入突变株ΔrcsB中,得到回补株.测定野生株、突变株、回补株的超粘性和生物膜形成能力.结果 成功构建rcsB基因缺失的无痕突变株ΔrcsB和回补株C-ΔrcsB.与野生株相比,突变株超粘性和生物膜形成能力均减弱,回补株介于野生株和突变株之间.结论 转录调控子RcsB对肺炎克雷伯菌超粘性和生物膜形成具有正向调控作用.     

肺炎克雷伯菌CRP调控子对细菌毒力影响与机制研究

目的:了解肺炎克雷伯菌调控因子CRP对细菌毒力的影响及其对毒力相关因子磷酸转移酶系统的作用及其机制。方法:构建肺炎克雷伯菌CRP调控因子的基因缺失突变株与回补株,小鼠毒力试验检测CRP对细菌LD50的影响及小鼠生存率的影响,qRT-PCR与lac Z报告基因检测CRP对果糖磷酸转移酶系统EIIC蛋白frwC基因的影响并通过凝胶阻滞试验(EMSA试验)检测CRP调控frwC基因的机制。结果:CRP基因敲除菌株的小鼠毒力明显下降,野生株、CRP基因缺失株及回补株的LD50分别为<100,3.2×10~5和4.5×10~4CFUs。qRT-PCR与lac Z报告基因发现CRP基因敲除后,果糖磷酸转移酶系统EIIC蛋白frwC基因表达量明显下降,EMSA试验发现CRP蛋白能够结合在frwC启动子区。结论:肺炎克雷伯菌CRP调控子与细菌毒力密切相关,并且能够直接正调控frwC基因的表达。除影响细菌荚膜、菌毛、生物膜的形成而影响细菌毒力外,CRP调控子可能通过影响磷酸转移酶系统而影响细菌毒力。     

大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌外膜蛋白与耐药机制的研究进展

细菌的膜孔蛋白及其形成的孔道是细菌与外界交流的主要途径,也是抗生素透过细菌细胞膜的重要通道。细菌膜孔蛋白合成降低或膜孔蛋白缺失可阻碍抗生素进入细菌,从而引起细菌对抗生素耐药。在细菌的耐药机制研究方面,膜孔蛋白的作用日益受到关注,文章从大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌入手,对其膜孔蛋白的特点、构成、合成调控机制及其与细菌耐药的关系进行综述。     

大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌外膜蛋白与耐药机制的研究进展

细菌的膜孔蛋白及其形成的孔道是细菌与外界交流的主要途径,也是抗生素透过细菌细胞膜的重要通道。细菌膜孔蛋白合成降低或膜孔蛋白缺失可阻碍抗生素进入细菌,从而引起细菌对抗生素耐药。在细菌的耐药机制研究方面,膜孔蛋白的作用日益受到关注,文章从大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌入手,对其膜孔蛋白的特点、构成、合成调控机制及其与细菌耐药的关系进行综述。     

茶多酚对肺炎克雷伯菌抑菌作用的研究

目的探讨茶多酚对肺炎克雷伯菌的杀菌作用,及其与常用抗菌药物联合使用的抑菌疗效,并初步探讨其作用机制。方法采用VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定系统对临床分离的20株肺炎克雷伯菌进行细菌鉴定;K-B法检测常见药物亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、头孢吡肟、头孢噻肟和头孢他定的敏感性;琼脂稀释法检测茶多酚的最低抑菌浓度(MIC);同时检测0.5 MIC(512μg/mL)茶多酚与常用抗菌药物联合使用后试验药物抑菌环直径的变化,并判断茶多酚联合常用抗菌药物对多重耐药肺炎克雷伯菌抑制作用的可行性。使用结晶紫染色法、刚果红染色方法检测茶多酚对细菌生物膜形成和胞外黏液样物质(slime)产生的影响。结果 20株肺炎克雷伯菌对常用抗菌药物均耐药,K-B值为6～15 mm;茶多酚对20株多重耐药肺炎克雷伯菌的MIC均值为1024μg/mL;与常用试验药物联用:0.5 MIC(512μg/mL)茶多酚能使亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、头孢吡肟、头孢噻肟和头孢他定的抑菌环直径增加3～28 mm不等,能明显与受试抗生素产生显著的协同作用,并且能逆转部分试验药物从耐药变为敏感。亚抑菌浓度下茶多酚能显著抑制肺炎克雷伯菌生物膜和胞外黏液样物质(slime)的产生。结论茶多酚与常用抗菌药物(亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、头孢吡肟、头孢噻肟和头孢他定)联合使用对多重耐药肺炎克雷伯菌具有协同杀菌作用,并且影响其细菌生物膜形成和胞外黏液样物质(slime)的产生。     

黄芩对多重耐药肺炎克雷伯菌生物学特性的初步研究

【目的】 研究黄芩对肺炎克雷伯菌体外生长、生物膜形成能力及耐药性的影响。 【方法】 制备黄芩药液,以多重耐药肺炎克雷伯菌为试验菌株,平板法检测黄芩液对该菌的最低抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。培养基中分别添加1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MI黄芩液,与未添加黄芩液作对比,通过紫外分光光度计检测OD600值,绘制细菌生长曲线,了解黄芩是否抑制肺炎克雷伯菌的生长。48孔培养板中建立肺炎克雷伯菌体外生物膜模型,建模初期实验组分别加入黄芩液使其终浓度为1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC,与空白对照组于1、3、7 d进行激光共聚焦显微镜检测,观察黄芩液对肺炎克雷伯菌黏附、生物膜形成时间、厚度以及形态的影响。细菌培养与药敏实验中分别加入0、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC黄芩液,检测细菌对抗生素的敏感度。 【结果】 平板法检测黄芩液对肺炎克雷伯菌的MIC和MBC分别为32 mg/mL和64 mg/mL。在不同浓度黄芩液作用下,肺炎克雷伯菌速度均有不同程度的减慢,其中以1/2MIC浓度减慢最为明显。体外生物膜模型试验显示,建模1 d和3 d时,实验组较空白对照组形成的绿色荧光生物膜减少;建模7 d,黄芩液终浓度为1/2 MIC实验组较空白对照组形成的绿色荧光生物膜有所减少,并出现大量红色死细菌,1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC浓度组与空白对照组相比形成的生物膜规模大体一致。药敏试验中,1/2 MIC、1/4MIC、1/8MIC实验组能逆转细菌对头孢类、喹诺酮类、单酰胺环类的新型β－内酰胺等抗生素的耐药性。 【结论】 黄芩可通过抑制肺炎克雷伯菌体外长、生物膜形成而抑制其生长,能增强耐药细菌对抗生素的敏感性。     

金黄色葡萄球菌生物膜形成机制及相关感染治疗的研究进展

金黄色葡萄球菌为革兰阳性致病菌,也是引起医院感染的常见化脓性病原菌;易在机体组织器官或某些惰性材料表面形成生物膜,使感染反复发作且难以控制。生物膜为细菌适应生存环境的一种保护性生存方式,与浮游菌相比生物膜内的细菌极易产生耐药性,且能抵抗宿主的防御机制,导致慢性持续性感染,给临床治疗带来极大的挑战。深入研究生物膜形成的调控机制,对积极寻找特异性的治疗方法至关重要。     

壳聚糖季铵盐对肺炎克雷伯菌的体外抑菌作用

目的 探讨壳聚糖季铵盐对肺炎克雷伯菌的体外抑菌作用.方法 以梯度稀释涂布平板法检测壳聚糖和壳聚糖季铵盐对肺炎克雷伯菌的直接抑菌作用;采用Real-Time PCR技术检测肺炎克雷伯菌生物膜形成相关的重要基因lsrR、lsrK和gmd的表达;并以结晶紫染色法检测肺炎克雷伯菌的生物膜形成情况.结果 干预后6h时点开始,壳聚糖和壳聚糖季铵盐孔的存活菌计数均显著降低(P＜0.05);干预后12 h壳聚糖季铵盐孔的存活菌计数显著低于壳聚糖组,壳聚糖季铵盐和壳聚糖对待检肺炎克雷伯菌的12h抑菌率分别为(72.6±8.0)％和(50.2±9.3)％(P＜0.05).壳聚糖和壳聚糖季铵盐均能上调lsrR基因表达;壳聚糖季铵盐使lsrK基因表达下调,gmd基因表达也有下调趋势.从干预后6h开始,壳聚糖和壳聚糖季铵盐对肺炎克雷伯菌的生物膜形成都有显著抑制作用,与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05);但壳聚糖组与壳聚糖季铵盐组之间比较差异并无统计学意义(P＞0.05).结论 壳聚糖和壳聚糖季铵盐能够有效抑制肺炎克雷伯菌增殖及生物膜形成.壳聚糖季铵盐的抑菌能力强于壳聚糖,同时可影响肺炎克雷伯菌生物膜形成相关的多个基因的表达.     

厚朴煎剂对白色念珠菌及其生物膜影响的初步研究

目的 观察厚朴煎剂对白色念珠菌(Candida albicans)芽管形成、早期黏附基因及成熟期生物膜的影响。方法 采用芽管形成试验检测厚朴煎剂对白色念珠菌芽管形成的影响;实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测厚朴煎剂作用后,凝集素样序列1(agglutinin-like sequencefamily1,ALS1)、ALS2、ALS3基因的表达情况;荧光显微镜及扫描电镜观察厚朴煎剂对白色念珠菌成熟期生物膜的影响;共聚焦显微镜观察厚朴煎剂对生物膜中菌活性的影响。结果 芽管形成试验结果显示,厚朴煎剂可抑制白色念珠菌的芽管形成且抑制作用具有浓度依赖性(P＜0.05)。厚朴煎剂能使ALS1、ALS2、ALS3基因表达下调且具有浓度依赖性(P＜0.05)。荧光显微镜下空白对照组生物膜以菌丝为主,厚朴煎剂作用24、48及72 h后生物膜结构被破坏。扫描电镜结果也提示厚朴煎剂可以破坏生物膜的结构。共聚焦显微镜下空白对照组白色念珠菌以活菌为主,15.625 mg/L厚朴煎剂作用48 h后死菌数量明显增加。结论 厚朴煎剂可通过下调ALS1、ALS2、ALS3基因抑制白色念珠菌早期黏附,同时可通过破坏成熟期生物膜的结构促进药物进入生物膜内抑制芽管形成和发挥杀菌作用。     

纳米孔测序技术在2019冠状病毒病重型患者继发感染诊断中的应用

目的：探讨纳米孔测序技术在2019冠状病毒病（COVID-19）重型患者继发感染诊疗中的应用价值。方法：共入组了来自3例COVID-19重型患者的77份临床标本,所有标本均经过热灭活后进行基于磁珠富集的总核酸抽提,构建DNA文库,通过纳米孔测序技术进行病原体检测。测序数据采用Centrifuge软件进行病原体数据库比对和R语言差异分析,以获得病原微生物的鉴定结果。比较纳米孔测序结果与呼吸道病原体筛查多重定量聚合酶链反应（PCR）检测及同一时期临床微生物检验结果,以验证纳米孔测序技术的有效性。结果：纳米孔测序结果显示,44份标本检出病原体（阳性率为57.1%）,包括肺炎克雷伯菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌和狡诈菌等。其中,肺炎克雷伯菌、表皮葡萄球菌和屎肠球菌均在基于微生物培养的临床微生物检验中检出;肺炎克雷伯菌同时在呼吸道病原体筛查多重定量PCR检测中检出;狡诈菌仅在纳米孔测序中检出,综合考虑患者的临床症状进行抗菌药物治疗,患者的感染情况得到控制。结论：纳米孔测序可快速鉴定临床标本中的潜在病原体,辅助COVID-19重型患者的临床诊断和治疗方案的制订。     

亚抑菌浓度哌拉西林/他唑巴坦对大肠埃希菌生物膜形成能力的影响

目的 探讨亚抑菌浓度(亚-MIC)哌拉西林/他唑巴坦对大肠埃希菌生物膜形成能力的影响,为临床抗感染治疗提供理论依据.方法 大肠埃希菌最低抑菌浓度检测采用微量肉汤稀释法,生物膜形成能力分析采用96孔板结晶紫染色法,黏附能力检测采用菌落平板计数法,采用泳动运动检测亚-MIC哌拉西林/他唑巴坦对大肠埃希菌运动性的影响.结果 亚-MIC哌拉西林/他唑巴坦能显著抑制大肠埃希菌生物膜形成能力(P＜0.05).此外,亚-MIC哌拉西林/他唑巴坦不但能显著降低细菌的黏附性而且能使其运动能力减弱.结论 亚-MIC哌拉西林/他唑巴坦可能通过抑制大肠埃希菌的黏附性和运动性而抑制其生物膜形成.     

中医药抑制葡萄球菌生物膜形成及机制研究进展

近年来,中医药在预防及治疗感染方面已显示出独特的优势,且大量体外研究也证实了中医药对于抑制基于葡萄球菌生物膜形成的相关感染的明显效果,是当前抗感染研究的重点之一.但目前有关中医药抑制葡萄球菌生物膜形成的基础研究相对较少,与骨科内植物细菌生物膜形成相关的基础研究更少;同时,对其复杂作用机制的研究亦相对薄弱,且文献报道也仅...     

细菌生物膜与导管伴生感染相关性的研究

目的：探讨细菌生物膜在置入导管伴生感染中的作用。方法：对置入性导管于撤除导管时行导管内细菌检查及分离培养,用结晶紫和阿利新蓝染色法对细菌生物膜进行定位及定量检测,分析导管细菌生物膜形成与导管伴生感染的关系。结果：患者置入性导管细菌生物膜阳性率为61.29%（38/62）,染色技术可用于观察导管内细菌生物膜形成情况。结论：细菌生物膜形成是置入导管伴生感染的重要致病因素,染色技术简便快速,可作为临床快速诊断的方法。     

选择性抑制变异链球菌的材料及其研究进展

龋病是在以细菌为主的多种因素影响下,牙体硬组织发生慢性进行性破坏的一种疾病。牙菌斑生物膜是龋病发生的关键因素。正常情况下,菌斑内各微生物通过协同、竞争和拮抗作用来保持动态平衡,但当环境发生变化时,生物膜内平衡就会被打破,致龋菌特别是变异链球菌的数量明显增加,导致牙面上大量有机酸生成,牙齿发生脱矿,龋齿形成。因此如何通过选择性抑制变异链球菌进而恢复口腔微生物动态平衡是防治龋病的关键。本文综述了近年来研发的具有选择性抗菌作用材料的研究进展,以期对防治龋病药物的进一步发展提供参考。未来的研究应重点关注机制机理、临床有效性、化学改性以及安全性等几个方面,补充完善相关研究,推进龋病防治药物研发的进程。     

人参皂苷对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的影响

目的 探讨人参皂苷Rh2单体对金黄色葡萄球菌(S.aureus)生物被膜形成的影响。 方法 通过96孔细胞培养板构建S.aureus生物被膜,探讨Rh2对生物被膜形成的影响;通过RNA提取及实时荧光定量PCR检测,探讨Rh2对S.aureus黏附素相关基因表达量的影响;将Rh2与抗生素环丙沙星(CIP)、庆大霉素(GEN)和万古霉素(VAN)联用,采用96孔细胞培养板结合结晶紫染色法探讨其与抗生素之间是否存在协同抑制生物被膜形成的能力。 结果 Rh2对S.aureus浮游菌的增殖无影响,但5 μg/mL的Rh2能显著降低S.aureus生物被膜的形成量(P<0.05),且具有剂量依赖性;10 μg/mL的Rh2能显著抑制S.aureus黏附相关基因icaA、icaC和icaD的表达(P均<0.05);此外,10 μg/mL的Rh2可显著促进亚抑菌浓度CIP、GEN和VAN抑制S.aureus生物被膜的形成能力(P均<0.01)。 结论 人参皂苷Rh2单体能通过抑制S.aureus黏附相关基因icaA、icaC和icaD的表达而抑制其生物被膜的形成,并能显著促进CIP、GEN和VAN抑制S.aureus生物被膜形成的能力。     

重症监护病房院内获得性感染的临床分析

目的 对重症监护病房（intensive care unit,ICU）院内获得性感染的病原菌分布及耐药情况进行分析,为临床抗生素的应用提供依据。方法 采用回顾性调查方法,对2015年1月1日至2016年12月31日期间在首都医科大学附属北京友谊医院ICU住院并且发生院内感染的患者送检标本检出病原菌及药敏结果进行分析。结果 调查期间院内感染上报共363人次,分离出271例菌株,居前5位的病原菌分别为为肺炎克雷伯杆菌（16.97%）、鲍曼不动杆菌（13.28%）、铜绿假单胞菌（12.18%）、屎肠球菌（10.7%）、金黄色葡萄球菌（5.9%）。居前3位的感染部位分别为下呼吸道（55.7%）、血液（17.6%）、腹部盆腔内组织（9.9%）。2016年较2015年肺炎克雷伯杆菌的发生率明显增加（P<0.05）。结论 近两年重症监护病房院内获得性感染的主要部位在下呼吸道,肺炎克雷伯杆菌的发生率明显增加,且呈现多重耐药,需引起重视。     

儿童肺炎支原体诱导的皮疹和黏膜炎临床特征分析

目的 比较肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)和药物诱导的儿童Stevens-Johnson综合征(Stevens-Johnson syndrome, SJS)的临床特征、治疗管理和预后之间的差异。方法 对河北省儿童医院2010-2021年收治的94例SJS和206例多形性红斑患儿进行筛选,对MP检测阳性的患儿(MP病例组,26例)与MP阴性且有明确药物因素的患儿(药物对照组,31例)进行比较分析。结果 与药物对照组相比,MP病例组患儿以年长儿多见,大于72月龄儿童的占比明显高于药物对照组,且均存在黏膜受累,以眼周黏膜(n=25,96.2%)最常见。其治疗主要为大环内酯类抗生素(100%)、皮质类固醇(84.6%)、免疫球蛋白(26.9%),中毒性表皮坏死松解症严重程度评分(severity-of-illness score for toxic epidermal necrolysis, SCORTEN)在2分及以上,均使用皮质类固醇,应用静脉注射用免疫球蛋白比例随SCORTEN评分增高而升高,MP病例组患儿平均住院日短于药物对照组,未见死亡病例。结论 MP相...     

Bacterial biofilm and associated infections

Microscopic entities, microorganisms that drastically affect human health need to be thoroughly investigated. A biofilm is an architectural colony of microorganisms, within a matrix of extracellular polymeric substance that they produce. Biofilm contains microbial cells adherent to one-another and to a static surface (living or non-living). Bacterial biofilms are usually pathogenic in nature and can cause nosocomial infections. The National Institutes of Health (NIH) revealed that among all microbial and chronic infections, 65% and 80%, respectively, are associated with biofilm formation. The process of biofilm formation consists of many steps, starting with attachment to a living or non-living surface that will lead to formation of micro-colony, giving rise to three-dimensional structures and ending up, after maturation, with detachment. During formation of biofilm several species of bacteria communicate with one another, employing quorum sensing. In general, bacterial biofilms show resistance against human immune system, as well as against antibiotics. Health related concerns speak loud due to the biofilm potential to cause diseases, utilizing both device-related and non-device-related infections. In summary, the understanding of bacterial biofilm is important to manage and/or to eradicate biofilm-related diseases. The current review is, therefore, an effort to encompass the current concepts in biofilm formation and its implications in human health and disease.