人源性抗食管癌细胞单链抗体的表达纯化及活性鉴定

目的研究噬菌体抗体库中筛选得到的抗食管癌细胞的单链抗体的功能,对单链抗体进行包涵体表达纯化。方法将从噬菌体抗体库中筛选到的2个单链抗体基因分别连接到pET-28a、pET-SUMO原核表达载体中,分别构建原核表达重组载体pET-NFC20b、pET-NFC70a,将其转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)表达系统中进行融合表达,对诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG）浓度、诱导时间和温度等诱导表达条件进行优化。采用盐酸胍稀释滴定复性方法对抗食管癌肿瘤细胞表面抗原的抗体进行复性,并用SDS-PAGE及质谱技术鉴定表达产物。结果成功构建了重组载体pET-NFC20b、pET-NFC70a,对重组菌株pET-NFC20b、pET NFC70a蛋白表达进行鉴定,诱导条件为0.5 mmol/L IPTG、时间3 h、温度18 ℃,重组蛋白均以包涵体形式表达,经滴定复性后均获得了相对分子量为30 kD和40 kD的重组蛋白。细胞ELISA实验鉴定2种蛋白NFC20b、NFC70a能与KYSE-170、KYSE-150、SMMC7721、A549等细胞结合,具有生物学活性。结论噬菌体抗体库中筛选得到的抗食管癌细胞的单链抗体NFC20b和NFC70a,可以成功地构建到pET28a和pET-SUMO载体内进行包涵体表达,纯化后具有蛋白活性,可为后续实验及检测试剂的研发奠定基础。     

噬菌体表面展示技术的新发展及在病毒性肝炎研究中的应用

噬菌体展示技术是一种目的基因在噬菌体表面的表达产物与亲和选择相结合的技术。噬菌体结构蛋白pⅢ和pⅧ均可作为载体来展示外源多肽或蛋白质。初期阶段,噬菌体展示技术主要是用于单链可变区抗体、随机多肽库等的筛选,但近年来随着噬菌体cDNA表达型文库的构建,噬菌体展示技术的用途逐渐扩大。目前噬菌体展示技术不仅可以用于研究蛋白结合蛋白,而且还可以用来研究DNA／RNA结合蛋白,以及非蛋白小分子物质的结合蛋白等。因为蛋白-蛋白之间的结合是许多生物学效应的基础,因而噬菌体展示技术的应用范围进一步得到拓展。噬菌体展示技术在研究自身抗体结合与识别的自身抗原、信号转导过程中蛋白之间的相互作用以及肝炎病毒基因表达调节方面都有十分重要的应用前景。     

流式细胞术检测食管鳞癌患者外周血循环肿瘤细胞

目的 利用密度梯度离心法和流式细胞术联合检测食管鳞癌患者外周血循环肿瘤细胞（circulating tumor cells,CTCs）,以建立一种高效简单易行的食管鳞癌CTCs分离和检测方法。方法 选取中国人民解放军总医院第六医学中心胸外科2017年10月—2018年5月收治的20例食管鳞癌患者和5名健康志愿者,抽取外周血7.5 mL,用密度梯度离心法提取外周血中单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）,然后用流式细胞术的方法对提取的PBMC进行标记,用抗EpCAM、抗CD45以及抗Cytokeratin（CK）单克隆抗体对PBMC进行抗体染色标记,将其中CD45阴性,EpCAM阳性且CK阳性的细胞定义为CTCs。同时将健康志愿者外周血中加入不同数量的食管鳞癌细胞来检测该方法的敏感度。结果 以CTCs≥3/7.5 mL基数定义为CTCs阳性;CTCs<3/7.5 mL基数定义为CTCs阴性。观察组中CTCs检出率达75%,对照组中未检出。用流式细胞术检测食管鳞癌外周血中CTCs的敏感度为10-6。结论 初步建立了一种特异性好,敏感度较高,操作简单易行的食管鳞癌CTCs分离和检测方法。     

抗体分子在噬菌体表面蛋白Ⅷ上的展示

目的 观察抗体分子通过丝状噬菌体主要外壳蛋白Ⅷ和次要外壳蛋白Ⅲ在噬菌体表面呈现效果的差异。方法 分别构建通过次要外壳蛋白Ⅲ或主要外壳蛋白Ⅷ展示抗乙肝表面抗原Fab,ScFv和角蛋白Fab的表达载体，制备噬菌体抗体，比较其抗原结合活性和Fab呈现水平，用多种方法尝试提高主要外壳蛋白Ⅷ介导的噬菌体展示效果。结果 主要外壳蛋白Ⅷ对不同特异性抗体Fab段和不同形式的小分子抗体（Fab和ScFv)的展示效果均低于次要外壳蛋白Ⅲ的展示，增加主要外壳蛋白Ⅷ－Fab对野生型和主要外壳蛋白Ⅷ的表达比例、试用不同菌株、在Fab和主要外壳蛋白Ⅷ之间插入间隔序列、换用控制更为严密的启动子等措施，均未能改善主要外壳蛋白Ⅷ介导的噬菌体展示。结论 以前所报道的通过主要外壳蛋白Ⅷ多价展示Fab段不是普遍存在的现象，对有些抗体基因不能达到多价展示。     

抗丙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体的制备及免疫组织化学研究

目的 制备丙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体并进行免疫组织化学研究。方法以大肠杆菌表达的重组丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白为固相抗原,利用抗原抗体亲和性结合的原理,从半合成的人源可变区噬菌体抗体库中经过3轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选过程及酶联免疫吸附试验(ELISA)和DNA序列分析,获得HCV核心蛋白的人源单链抗体;用该抗体对7721转染全长HCV cDNA后筛选的阳性克隆细胞中的HCV核心蛋白抗原进行免疫组化鉴定。结果 ELISA结果表明,制备的HCV核心蛋白人源单链抗体能与HCV核心蛋白抗原特异性结合;免疫组化结果表明,该抗体能够特异性识别HCV核心蛋白抗原,与正常肝细胞无交叉反应。结论此法制备单链抗体方法简便,周期短,可为HCV核心蛋白病原的检测提供新的检测手段。     

食管癌相关血清小分子蛋白谱的初步研究

目的 分析食管鳞癌血浆蛋白表达谱改变,筛选恰当的蛋白分类芯片用于建立食管鳞癌血清标志诊断模型.方法 血浆蛋白经离子交换,按不同pH值范围预分离为6个组份,各组份分别在弱阳离子交换型和铜离子螯和型等两类蛋白芯片上分选与富集,经表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱技术分析食管鳞癌差异表达蛋白.分析5例食管鳞癌和2例性别、年龄匹配的对照血清,初步获得弱阳离子交换型和铜离子螯和型蛋白芯片表达图谱.结果 血浆蛋白经不同离子交换柱预分离和不同蛋白分类捕获芯片富集,在相对分子质量0～50 000范围内,弱阳离子交换型和铜离子螯和型蛋白芯片上检测到近百种差异蛋白峰,其中部分差异峰具有统计学意义(P＜0.05).结论 血浆蛋白经不同pH区段预分离和分类捕获后可降低高丰度蛋白干扰,提高负载疾病信息的低丰度蛋白/肽段显示度.弱阳离子交换型和铜离子螯和型蛋白芯片结合蛋白可呈现食管癌术前与术后,以及食管癌和健康对照者的差异表达谱.初步研究提示,食管癌外周血浆存在肿瘤候选标志分子(谱).     

利用荧光极化技术在均相系统内建立基于Bcl-2/Bak作用模式的高通量药物筛选体系

目的：利用荧光极化原理，在液相系统内建立基于Bcl-2／Bak相互作用模式的高通量药物筛选体系。方法：在液相系统内建立Bd-2蛋白和多肽的相互作用体系，用光度计检测荧光极化值，分析荧光极化值随蛋白或多肽浓度变化而改变的趋势。结果：对应于Bak蛋白BH3结构域的5FAM标记肽（LP）可与Bcl-2蛋白相互作用，建立了二者相互作用的饱和曲线；非标记竞争性短肽（CP）和LP竞争性地与Bcl-2蛋白结合，而无关肽（NP）则不与Bcl-2相互作用；基于Bcl-2结构筛选到的小分子化合物SC对体系内LP荧光极化值的影响模式与CP相同。结论：在均相系统内初步建立了基于抑制Bcl-2活性进而促进细胞凋亡的药物高通量筛选方法，为实现药物的高通量筛选奠定了基础。     

从人源大容量噬菌体抗体库中筛选抗生存素抗体

目的从大容量天然噬菌体抗体库中筛选抗生存素(survivin)的人源单链抗体(single chainfragment variable,scFv)并进行鉴定。方法以survivin为抗原,固化在抗原管上,通过吸附—洗脱—扩增过程,从大容量天然噬菌体抗体库中筛选特异性噬菌体抗体,并转染HB2151菌,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导制备成可溶性抗体,采用酶联免疫吸附测定法对其抗原结合活性进行检测,指纹图谱分析法分析抗体基因的种类。结果经过4轮筛选,共获得21个与survivin结合的阳性克隆,其中10个特异性结合的克隆,指纹分析有8种不同的抗survivin的scFv基因,在这8种中有5种获得可溶性表达。结论利用噬菌体抗体库技术获得了特异性的人源抗生存素抗体,为其在今后肿瘤治疗中的应用奠定基础。     

抗平颏海蛇短链神经毒素全人源单克隆抗体的筛选、制备及生物活性研究

目的 重组表达3种平颏海蛇短链神经毒素,利用噬菌体抗体库筛选制备全人源抗毒素单克隆抗体并评估其生物活性.方法 以重组表达纯化的神经毒素蛋白作为抗原,从自主构建的噬菌体抗体库中筛选获得噬菌体抗体,经序列测定确定其抗体类型后构建完整抗体.利用真核表达系统表达纯化抗体后鉴定其抗原结合活性、生化特性及药代动力学特性.在体内验证抗体药物的抗毒素作用.结果 经过4轮筛选,获得2株能同时结合3种神经毒素的噬菌体单链抗体,并将其制备成完整的抗体,进一步证实所获得的抗体可特异性结合3种抗原.2株全人源抗体均可拮抗神经毒素对昆明小鼠的致死作用.结论 利用重组神经毒素和噬菌体抗体库技术成功获得了特异性抗平颏海蛇短链神经毒素的全人源治疗性抗体.     

抗体库技术中辅助噬菌体的研究进展

噬菌体抗体库作为噬菌体展示和抗体库2种技术的集合体,可以不需经过免疫而直接获取各种人源抗体,目前已广泛应用于生物学及医学等领域.在通常使用的噬菌粒系统中,使用野生型辅助噬菌体会导致"噬菌体污染",使得仅有很少部分子代噬菌体带有抗体片段,这对抗体库的筛选工作非常不利.近年来,研究人员通过对噬菌体衣壳蛋白基因(g3)部分缺失、引入琥珀突变、构建新型辅助噬菌体或辅助质粒等策略,不仅有效避免了辅助噬菌体污染问题,使抗体展示效率提高了5～20倍,进而通过增加单价抗体展示在每个噬菌体表面,使抗原结合能力提高400倍,并且在第二轮筛选中即可得到有效富集(阳性克隆率超过50%).本文综述了近年来应用在噬菌体抗体库的一些新型的辅助感染系统.     

新辅助化疗对局部晚期食管癌循环肿瘤细胞及生存率的影响

 

目的 探讨新辅助化疗(neoadjuvant chemotherapy ,NAC)联合手术对局部晚期食管癌循环肿瘤细胞及生存率的影响。方法 选取2010-08至2015-08在医院接受治疗的局部晚期食管癌110 例,随机分为观察组和对照组,每组55例。观察组于术前给予NAC后行手术治疗,对照组单纯行手术治疗。采用免疫富集法和免疫荧光染色技术鉴别分离外周血中循环肿瘤细胞(circulating tumor cells ,CTC),分别于治疗前和治疗后3、6、12、24、36个月检测CTC值。随访3年并记录两组的近期生存率。结果 治疗前两组患者外周血中的CTC值差异无统计学意义。治疗后1、2、3年内,观察组外周血中的CTC值分别为6.88、6.56、7.20;对照组为12.8、13.0、13.2,观察组显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。观察组术后1、2、3年生存率分别为96.36%、89.09%、65.45%;明显高于对照组的78.18%,56.36%,34.55%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 NAC联合手术可提高局部晚期食管癌患者的近期疗效、降低肿瘤恶性程度,提高患者近期生存率。

     

非小细胞肺癌术后外周血循环肿瘤细胞的检测及其意义

 目的探讨对非小细胞肺癌术后外周血中循环肿瘤细胞(circulatingtumorcells,CTCs)的检测及意义。方法经根治手术治疗并经病理确诊的肺腺癌患者38例,术后TNM分期为Ⅰ期19例,Ⅱ期6例,Ⅲ期13例。10例肺良性病变患者作为对照组,术后病理为肺结核4例,肺部炎性病变6例。采用免疫磁珠富集联合流式细胞术方法检测外周血CTCs(每7.5ml)。结果10例肺良性病变患者术后外周血中CTCs阳性率为10%(1/10),38例非小细胞肺癌患者术后外周血中CTCs阳性率为39.5%(15/38)。肺良、恶性组CTCs阳性率比较差异无统计学意义(P=0.132)。Ⅰ期与Ⅲ期CTCs阳性率相比差异具有统计学意义(χ²=3.970,P=0.046)。结论非小细胞肺癌术后外周血中存在CTCs,其阳性率与肿瘤TNM分期相关。CTCs检测可用于指导术后治疗。     

Variations in radioimmunoscintigraphic detection of tumor showed by five monoclonal antibodies to carcinoembryonic antigen

Radioimmunoscintigraphy using mouse monoclonal antibodies to various parts of a carcinoembryonic antigen (CEA) molecule was performed. Four radiolabeled antibodies (F4-82, 28A, F3-30, F33-104) were injected into tumor transplanted nude mice to compare the accumulation of these antibodies in tumors. The four antibodies were accumulated selectively in CEA- producing tumors. The tumor visualization correlated with the tumor/blood radioactivity ratio, whereas the tumor/blood radioactivity ratio did not correlate with the in vitro percent binding to tumor cells or the in vivo percent injected dose in CEA-producing tumors. Among the four antibodies, F33-104 showed the highest tumor/blood radioactivity ratio and the best image quality in any CEA-producing tumor. These results suggest that the antibody which has a high tumor/blood ratio rather than high total tumor uptake may be useful for radioimmunoscintigraphy.     

A case of incarcerated lesser sac hernia protruding simultaneously through both the gastrocolic and gastrohepatic omenta

Small bowel obstruction due to lesser sac herniation through both the gastrocolic and gastrohepatic omenta is extremely rare, and only a few reported cases have been concerned with imaging diagnosis. CT images showed distended bowel loops at the level of the cephalad part of the stomach, collapsed triangular loops and attached mesentery were depicted just behind the caudal part of the stomach. These findings provided clues to the diagnosis of this type of lesser sac hernia.     

早期肺癌外周血中肿瘤细胞的检测及其临床意义探讨

目的探讨检测早期肺癌循环肿瘤细胞(CTCs)的可行性及临床意义。方法应用免疫磁性分离(IMS)＋免疫细胞化学(ICC)法及RT-PCR法检测3组标本(A组：早期肺癌组,15例;B组：肺部良性病变组,20例;C组：健康志愿者组,20例)的CTCs,并对A组患者进行了6～9个月的随访。结果应用IMS＋ICC法检测,A组有5例阳性,B、C组均为阴性;应用巢式RT-PCR法检测,A组7例、B组8例、C组6例检测为阳性。A组患者随访中有2例术前及术后检测均为阳性的患者发生了复发。结论IMS＋ICC法是检测早期肺癌CTCs的敏感方法;早期肺癌患者CTCs的检出可能与临床预后有一定的关系。     

人外周血白细胞黏附分子的辐射效应研究

目的 研究外周血白细胞表面黏附分子的表达及其介导的细胞黏附能力变化与辐射剂量的关系。方法 人外周血细胞经不同剂量照射后不同时间用流式细胞仪双色标记分析不同白细胞表面不同黏附分子表达,特异底物包被微孔板法和结晶紫染色分析检测单核细胞对不同底物的黏附能力。结果 单核细胞表面CD11b和粒细胞表面CD29表达下降与辐射剂量间存在良好量效关系,照射后单核细胞对底物β1-整合素和胶原蛋白I的黏附能力改变与辐射剂量存在一定量效关系。结论 外周血白细胞表面黏附分子表达及功能改变展现出的与辐射剂量间的良好关系,为进一步深入研究将其作为评估生物受照剂量指标的可能打下基础。     

Effect of DTPA conjugation on the antigen binding activity and biodistribution of monoclonal antibodies against alpha-fetoprotein

Indium-111-(111In) labeled monoclonal antibodies (Ab) prepared with a bifunctional chelating agent, diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA), have been used for the radioimmunoimaging of cancer. In the present experiment, using monoclonal Ab against human alpha-fetoprotein (AFP) as a model, we have studied the effect of DTPA conjugation on the antigen binding activity and the biodistribution in nude mice transplanted with AFP-producing human testicular tumor. In Ab heavily conjugated with DTPA, the Scatchard plot analysis demonstrated that the maximum binding capacity rather than the affinity constant was affected. Under selected conditions, 111In-labeled Ab were made available with almost full retention of the antigen binding activity and scintigrams of nude mice clearly delineated the site of the tumor. However, the number of DTPA molecules incorporated per Ab molecule markedly influenced the in vivo biodistribution as well as the in vitro antigen binding activity.     

Can detection of the yolk sac in the first trimester be used to predict the outcome of pregnancy? A prospective sonographic study.

Recent reports have indicated that identification of the yolk sac should precede the detection of the embryo in a normal first-trimester sonographic examination and that failure to visualize a yolk sac strongly suggests an abnormal intrauterine pregnancy. A first-trimester prospective study was performed in 163 normal and 49 abnormal consecutive singleton gestations. All women were examined both abdominally and transvaginally, with pregnancy outcome determined by delivery of a normal infant or a spontaneous abortion. The yolk sac was analyzed in all patients in whom an embryo was not identified (n = 76). When the yolk sac was identified, the following was found: by the abdominal approach with the mean sac diameter (MSD) less than 27 mm (n = 15), nine gestations were normal and six were abnormal, and by the transvaginal approach with the MSD less than 18 mm (n = 13), seven gestations were normal and six were abnormal. The presence of a yolk sac was not consistently predictive of a normal early pregnancy. When the yolk sac was also not identified, the following was found: abdominally with the MSD less than 27 mm (n = 41), 19 gestations were normal and 22 were abnormal, and transvaginally with the MSD less than 18 mm (n = 11), six gestations were normal and five were abnormal. Absence of the yolk sac was not consistently predictive of a spontaneous abortion. When using the MSD range (20-27 mm abdominally and 7-16 mm transvaginally), over which the yolk sac but not the embryo should be identified sonographically, the yolk sac was again not consistently visualized. On abdominal sonograms, the yolk sac was present and absent in three and 10 patients, respectively, for both normal and abnormal pregnancies. On transvaginal sonograms, the yolk sac was present and absent in seven and five normal gestations and in six and four abnormal gestations, respectively. The results of this study suggest that detection of the yolk sac in the first trimester is not an early predictor of pregnancy outcome.     

卵黄囊瘤64层CT诊断及其病理学基础

目的探讨卵黄囊瘤的64层CT表现特征及病理学基础,提高对其诊断及鉴别诊断水平。资料与方法回顾性分析经手术及穿刺病理证实的9例卵黄囊瘤的临床特征及CT表现,并与病理对照研究。结果肿瘤位于纵隔3例,卵巢4例,盆腔隐睾1例,阴道1例。CT表现为圆形或卵圆形巨大肿块,以囊实性为主,内见大小不等的囊变区,增强扫描明显不均匀强化,实性为主者其内可见条状血管影。肿瘤病理学表现为间质排列成疏松的空网状结构,内见大量的瘤细胞,S-D小体等,8例治疗前检查血清甲胎蛋白(AFP)显著升高,均>1000μg/L,其中6例>3000μg/L。结论 64层CT增强扫描及多平面重组(MPR)能够清楚显示卵黄囊瘤形态、部位、大小及强化特征,结合血清AFP及年龄等临床资料,有利于其诊断和鉴别诊断。     

A fundamental study of immunoscintigraphy with 131I-labeled anti-CA 19-9 and anti-CEA monoclonal antibodies--imaging of tumor-bearing mice by IMACIS-1 and cell ELISA with human tumor cells

A study was made on 2 types of 131I-labeled anti-CA 19-9 and anti-CEA mouse monoclonal antibodies (IMACIS-1) against human cancer related antigen as to their usefulness in radioimmunoimaging. Tumor-bearing nude mice were used for comparison. The transplanted tumors (SW948, COLO 201) were clearly visualized 48-72 hours after administration of IMACIS-1. Tumor/blood ratio 72 hours after administration: 8.69 in COLO 201 and 5.70 in SW948, showing ca. 10-15 times as high as those in PC-3 and HEp-2. IMACIS-1 therefore is considered useful in radioimmunoimaging of cancer. Analysis was made by in vitro cell ELISA. As a result, both of the cells specifically reacted with anti-CA 19-9 but not anti-CEA.