甲基化CpG结合域重组蛋白的表达与鉴定

目的:在大肠杆菌中表达甲基化CpG结合域(methyl-CpG-binding domain,MBD)重组蛋白?方法:对人甲基化CpG结合蛋白2(methyl-CpG-binding protein 2,Mecp2)的MBD区行密码子优化,将人工合成的DNA克隆至原核表达载体pGS21a,在大肠杆菌E. coli Rosetta(DE3)中诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白表达;镍亲和层析柱纯化重组蛋白?表面等离子共振分析重组MBD蛋白与甲基化DNA的结合能力?结果:酶切和核酸测序证实,成功构建了含密码子优化的MBD基因的原核表达载体?SDS-PAGE和Western blot结果显示,MBD重组蛋白在大肠杆菌中得到表达?亲和层析法纯化后获得了相对分子量为38 000的MBD重组蛋白?SPR分析显示MBD重组蛋白能特异结合甲基化DNA?结论:成功构建含密码子优化的MBD基因的原核表达载体,MBD重组蛋白能在大肠杆菌中表达?     

甲基CpG结合蛋白2(MeCP2)基因多态性与长江以南汉族人群系统性红斑狼疮(SLE)的相关性

目的 探讨甲基CpG结合蛋白2(methyl-CpG- binding protein 2,MeCP2)基因单核苷酸多态性与中国长江以南汉族人群系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)的易感性.方法 采用病例对照研究设计,收集病例141例,对照144例.应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性( PCR- RFLP)技术对rs2239464、rs2075596两位点进行基因分型,在不同的遗传模式下分析两个位点基因多态性与SLE的相关性.根据赤池信息准则( Akaike's information criteria,AIC)值最小原则,筛选最优模型.结果 在显性、隐性、相加及相乘遗传模式下,两位点基因型或等位基因频率分布在病例组与对照组间的差异均有统计学意义(P＜0).05).显性遗传模式下,rs2239464、rs2075596位点GG/AG基因型为SLE的保护性基因型(ORrs2239464=0.528,95％CIrs2239464∶0.315～0.885;ORrs2075596=0.435,95％CIrs2075596∶0.264～0.717).隐性遗传模式下,rs2239464、rs2075596位点GG基因型在统计学上具有显著的保护性作用(ORrs2239464=0.108,95％ CIrs2239464∶0.013～0.863;ORrs2075596=0.097,95％CIrs2075596∶0.012～0.771).相加遗传模式下,以AA基因型为参照,rs2239464位点GG基因型为SLE的保护性基因型(OR=0.094,95％CI:0.012～0.758),rs2075596位点AG及GG基因型也具有保护性作用(ORAG=0.498,95％ CIAG∶0.298～0.832;ORGG=0.077,95％ CIGG∶0.010～0.612).相乘遗传模式下,rs2239464、rs2075596两位点的G等位基因为SLE的保护性等位基因(ORrs2239464=0.503,95％ CIrs2239464∶0.319～0.793; ORrs2075596=0.445,95％ CIrs2075596∶0.289～0.686). rs2239464,rs2075596位点的最优遗传模式均为相加遗传模式.结论 在中国长江以南汉族人群中MECP2基因rs2239464,rs2075596位点基因多态性与SLE相关,突变等位基因G可能是SLE保护性等位基因.     

甲基CpG结合蛋白2(MeCP2)基因多态性与长江以南汉族人群系统性红斑狼疮(SLE)的相关

 目的 探讨甲基CpG结合蛋白2(methyl-CpG-binding protein 2,MeCP2)基因单核苷酸多态性与中国长江以南汉族人群系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)的易感性。方法 采用病例对照研究设计,收集病例141例,对照144例。应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术对rs2239464、rs2075596两位点进行基因分型,在不同的遗传模式下分析两个位点基因多态性与SLE的相关性。根据赤池信息准则(Akaike’s information criteria,AIC)值最小原则,筛选最优模型。结果 在显性、隐性、相加及相乘遗传模式下,两位点基因型或等位基因频率分布在病例组与对照组间的差异均有统计学意义(P<0.05)。显性遗传模式下,rs2239464、rs2075596位点GG/AG基因型为SLE的保护性基因型(ORrs2239464=0.528,95%CIrs2239464:0.315~0.885;ORrs2075596=0.435,95%CIrs2075596:0.264~0.717)。隐性遗传模式下,rs2239464、rs2075596位点GG基因型在统计学上具有显著的保护性作用(ORrs2239464=0.108,95%CIrs2239464:0.013~0.863;ORrs2075596=0.097,95%CIrs2075596:0.012~0.771)。相加遗传模式下,以AA基因型为参照,rs2239464位点GG基因型为SLE的保护性基因型(OR=0.094,95%CI:0.012~0.758),rs2075596位点AG及GG基因型也具有保护性作用(ORAG =0.498,95%CIAG:0.298~0.832;ORGG =0.077,95%CIGG:0.010~0.612)。相乘遗传模式下,rs2239464、rs2075596两位点的G等位基因为SLE的保护性等位基因(ORrs2239464= 0.503,95%CIrs2239464:0.319~0.793;ORrs2075596=0.445,95%CIrs2075596:0.289~0.686)。rs2239464,rs2075596位点的最优遗传模式均为相加遗传模式。结论 在中国长江以南汉族人群中MECP2基因rs2239464,rs2075596位点基因多态性与SLE相关,突变等位基因G可能是SLE保护性等位基因。     

甲基化CpG结合域蛋白1和VIMENTIN在胰腺癌中的表达及其临床意义

目的 探讨甲基化CpG结合域蛋白1(MBD1)和VIMENTIN蛋白在胰腺癌组织中的表达情况及其与胰腺癌临床病理特征的关系.方法 采用免疫组织化学方法检测40例经手术切除的胰腺癌组织和10例良性肿瘤患者的正常胰腺组织中MBDI和VIMENTIN蛋白的表达.结果 在40例胰腺癌标本中有28例(70.0%)MBD1呈阳性表达,16例(40.0%)VIMENTIN蛋白呈阳性表达,显著高于正常胰腺组织标本的1例(1/10)和0例(P值均<0.05).MBD1与VIMENTIN蛋白的阳性表达呈正相关(r=0.423,P=0.012).在有淋巴结转移的胰腺癌中的MBD1表达阳性率显著高于无淋巴结转移的胰腺癌(P=0.023).在病理分化较差和有淋巴结转移的胰腺癌中的VIMENTIN表达阳性率显著高于病理分化较好及无淋巴结转移的胰腺癌(P值分别=0.027、0.003).结论 胰腺癌组织中存在MBD1和VIMENTIN的过表达,并与病理分级和淋巴结转移有关,MBD1可能通过调控甲基化过程,干预VIMENTIN的表达,在胰腺癌的发生、发展中起到重要作用.     

甲基化CpG结合结构蛋白2在胃癌的表达及靶向抑制

目的：研究甲基化CpG 结合结构蛋白2（methyl-CpG-binding domain protein 2,MBD2）在胃癌的表达及靶向抑制。方法：免疫组化法对40例胃癌及配对胃黏膜组织,免疫荧光法对胃癌细胞SGC-7901行MBD2表达研究。构建3个靶向抑制MBD2的siRNA（MBD2-siRNA-1、MBD2-siRNA-2、MBD2-siRNA-3）。转染MBD2-siRNA入SGC-7901,RT-PCR及Western blot验证MBD2的抑制效果。噻唑蓝比色法检测SGC-7901增殖率。结果：胃癌组织MBD2表达较对照胃黏膜组织增强（χ2=6.646,P=0.010）;且低分化胃癌与伴幽门螺杆菌感染的胃癌中MBD2表达更强（ χ2值分别为9.730、8.700,P值分别为0.01和0.04）。MBD2蛋白在胃癌胞核分布。MBD2-siRNA可成功转染SGC-7901,并成功筛选靶向抑制MBD2的siRNA（MBD2-siRNA-2）。发现转染MBD2-siRNA-2后96 h,SGC-7901增值率被抑制。结论：MBD2在胃癌表达增强,抑制MBD2可能抑制胃癌增殖。     

甲基化CpG结合蛋白-2基因多态性与女性精神分裂症患者的关联性研究

目的研究甲基化CpG结合蛋白-2（MeCP2）基因多态性与女性精神分裂症患者的关联性。方法采用基于质谱微阵列技术的基因多态性分析法对符合DSM-Ⅳ诊断标准的126例精神分裂症患者和144例正常对照组患者MeCP2基因上的4个SNP位点进行基因分型,用x。检验比较上述4个位点的基因型频率和等位基因频率的组间差异。结果MeCP2基因rsl616369位点G／A基因型分布频率（24-8％VS34．3％）组间差异有统计学意义（P〈0．05）;rs3027933位点G／C基因型分布频率（25．6％vs34．8％）组间差异有统计学意义（P〈0．05）;位点rs17435基因型．T／A分布频率（25．6％vs35．5％）组间差异有统计学意义（P〈0．05）;位点rs2239464基因型A／A分布频率（58．5％VS71.8％）,组间差异有统计学意义（P〈0．05）;单体型GCCA分布频率在病例组为0．1581,在对照组为0．2389,组间差异有统计学意义（P〈0．05）。结论女性精神分裂症患者MeCP2基因的相关基因型可能跟精神分裂症发病有相关性,MeCP2基因可能是女性精神分裂症易感基因,单体型GCCA可能是女性精神分裂症发病的保护因素。     

CpG甲基化调节神经黏附分子多聚唾液酸的合成

目的探讨DNA甲基化是否能够用来作为多聚唾液酸（PSA）表达的基因外调控。方法用甲基化PCR分析成年小鼠和18d的胚胎鼠（E18）大脑不同区域合成多聚唾液酸的酶的基因-mSTSSiaIV（PST）和mST8SiaII（STX）启动子甲基化水平;用dot—blotting分析不同浓度的甲硫胺酸和丙戊酸对PSA表达的影响;用CBRA（Combined bisulfite restriction analysis）进一步确认基因-ST8SiaIV和mSTSSiaII启动子甲基化水平,神经细胞和神经胶质的原代培养。结果（1）胎儿鼠与小鼠的大脑、小脑、基底核和海马,甲基化特异性的PCR结果显示：STX基因转录起始区没有甲基化,PST基因转录起始区在18d的胎儿鼠的所有4个区域和成年鼠的2个区域一大脑和小脑都有甲基化。（2）甲基化特异性的PCR分析原代培养的神经细胞和神经胶质细胞STX基因未发生甲基化,但是在PST基因在神经胶质细胞发现轻微的甲基化。（3）小鼠神经纤维母细胞瘤细胞株-Neuron2A细胞的PST基因启动子几乎完全被甲基化。（4）不同浓度甲硫氨酸处理Neuron2A细胞,PSA表达下降;相反丙戊酸增强了PSA的表达。结论甲基化能够用来作为多聚唾液酸表达的基因外调控,多聚唾液酸表达的基因外调控可能与突触的形成和记忆的形成有关。     

自闭基因Fmr1和MeCP2与GABA神经微环路调控

自闭症是兴奋与抑制失衡性神经发育相关疾病.本文以Fmr1与脆性X综合征、MeCP2与Rett综合征为例,基于GABA网络微环路,比较了 Fmr1和MeCP2在不同类型GABA神经元中的差异表达,构建了 Fmr1和MeCP2与GABA神经元蛋白互作网络和关键分子功能路径,以解析自闭基因与GABA神经微环路的兴奋/抑制平衡...     

CITED2基因CpG岛甲基化与先天性心脏病的关系

目的 研究先天性心脏病患儿CITED2基因启动子区CpG岛的甲基化情况,并探讨其在该病发病中所起的作用.方法 收集43例先天性心脏病患儿及2例意外死亡儿童右心耳组织,对CITED2基因进行突变筛查,同时利用生物信息学筛选,分别用亚硫酸氢盐修饰结合测序(BSP)及甲基化特异性PCR (MSP)检测CITED2基因启动子区CpG岛的甲基化情况,并运用实时荧光定量PCR检测CITED2基因mRNA的表达.结果 先天性心脏病组启动子区存在4例杂合子突变(均为-341 T＞G),此突变对CITED2基因mRNA的表达无影响.其中BSP法成功检测到先天性心脏病组甲基化阳性率为83.3％(10/12),MSP法分析发现甲基化阳性率为84.2％(16/19),同时CITED2基因异常甲基化使其mRNA的表达明显减低(P＜0.05).结论 先天性心脏病中存在CITED2基因CpG岛的异常甲基化,此甲基化下调了CITED2基因mRNA的表达.     

大鼠Mecp2基因的RNA干扰有效序列筛选

目的:以RNAi技术寻找抑制大鼠Mecp2基因表达的有效序列.方法:首先构建大鼠Mecp2基因与红色荧光蛋白(RFP)的融合基因表达质粒,然后分别与针对大鼠Mecp2基因的4个备选小干扰RNA(siRNA, small interference RNA)共转染HEK293T细胞,构成外源基因系统,以此对于4个备选的siRNA对大鼠Mecp2基因的抑制有效性进行筛选.然后将筛选到的有效序列siRNA转染自身表达大鼠Mecp2基因的PC12细胞,以免疫荧光染色显示大鼠Mecp2蛋白的表达情况,通过内源大鼠Mecp2基因表达被抑制的情况验证所筛选序列的RNA干扰有效性.结果:针对大鼠Mecp2基因mRNA 918～936位核苷酸的siRNA(序列:5′-GCUGUGAAGGAAUCUUCUA-3′)是对大鼠Mecp2基因进行RNA干扰的有效序列.此有效siRNA序列所在的位置相当于大鼠Mecp2基因第4外显子,推测可同时抑制大鼠Mecp2α和大鼠Mecp2β的表达.且此靶序列位于大鼠Mecp2基因编码区,推测可同时抑制1.9 kb和10 kb的大鼠Mecp2基因mRNA的表达.结论:本研究为建立稳定的大鼠神经元Mecp2基因表达敲低的神经细胞模型和研究脑发育过程中Mecp2基因的功能打下了基础.     

Crosstalk between CpG Methylation and Polymorphisms (CpG-SNPs) in the Promotor Region of DIO2 in Kashin-Beck Disease

ObjectiveThis study was designed to determine the methylation profile of four CpGs and the genotypes of two CpG-SNPs located in promoter region of DIO2 in patients with Kashin-Beck disease (KBD). We also analyzed the interaction between the CpGs methylations and CpG-SNPs.MethodsWhole blood specimens were collected from 16 KBD patients and 16 healthy subjects. Four CpGs and two CpG-SNPs in the promoter regions of DIO2 were detected using matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). The CpGs methylation levels were compared between samples from KBD patients and healthy subjects. The methylation levels were also analyzed in KBD patients with different CpG-SNP genotypes.ResultsThe mRNA expression of DIO2 in whole blood of KBD patients was significnatly lower than in healthy controls (P “0.05). The methylation levels of DIO2-1_CpG_3 in KBD patients were significantly higher than those in healthy controls (P <0.05). The methylation levels of four CpGs were not significantly different between KBD patients and healthy controls. The methylation level of DIO2-1_CpG_3 in the promoter region of DIO2 in KBD patients with GA/AA genotype was significantly higher than that of KBD patients with GG genotype (P <0.05).ConclusionThe methylation level of DIO2 increases in KBD patients. Similar trends exist in KBD carriers of variant genotypes of CpG-SNPs DIO2 rs955849187.     

大鼠MeCP2-shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的 构建并鉴定大鼠MeCP2-shRNA慢病毒表达载体,以便应用RNAi技术进一步研究MeCP2功能.方法 设计针对大鼠MeCP2 mRNA靶序列的小发夹状RNA,化学合成含茎环结构的正义链与反义链,退火形成双链后,与酶切后的pLentiLox3.7载体片段进行连接、转化.用菌落PCR法、酶切及DNA测序鉴定重组克隆.结果 重组克隆经菌落PCR及酶切证实shRNA正确插入慢病毒载体,DNA测序证实插入的序列正确.结论 两个大鼠MeCP2-shRNA慢病毒表达载体的成功构建为应用RNAi研究大鼠MeCP2功能打下了基础.     

胶质瘤患者血清IGFBP-2的临床意义

目的探讨胰岛素样生长因子结合蛋白-2（IGFBP-2）在胶质瘤患者血清中的表达及其临床意义。方法健康体检者（对照组）20例,胶质瘤患者74例,其中Ⅳ级26例,Ⅲ级14例,Ⅱ级27例,Ⅰ级7例。采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清IGFBP-2的浓度。结果胶质瘤Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级组浓度均高于对照组（P〈0.05）,Ⅳ级组浓度高于Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级组（P〈0.05）;Ⅳ级胶质瘤中,随着肿瘤的增大,IGFBP-2浓度不断增加;复发性肿瘤组IGFBP-2浓度显著高于未复发组（P〈0.05）。结论监测血清IGFBP-2浓度对判断胶质瘤病变性质、恶性程度及复发具有一定的临床意义。     

阿尔茨海默病患者甲状腺功能与神经精神症状关系的研究

Background Growing evidence links alternation of the thyroid function to the pathogenesis and progression of Alzheimer disease (AD). However, only a few studies evaluate the association between thyroid hormone levels and neuropsychiatric manifestations in patients with AD. Objective To investigate the relationship of thyroid hormone levels and neuropsychiatric symptoms in euthyroid patients with AD. Method Forty patients with AD (26 women and 14 men), with no prior AD treatment within 4 weeks before study entry, were evaluated on their thyroid status (total triiodothyronine [TT3], total thyroxine [TT4] and thyroid-stimulating hormone [TSH]), cognition (Mini-Mental State Examination [MMSE] and Alzheimer’s disease Assessment Scale–Cognitive Subscale [ADAS-cog]), neuropsychiatric symptoms (Neuropsychiatric Inventory [NPI]) and depression (Hamilton Rating Scale for Depression [HAMD17]). Results In euthyroid patients with AD, agitation and irritability of NPI are negative related to the serum level of TSH (t=-2.130, P<0.05; t=-2.657, P<0.05), and core score of HAMD is significant associated with the serum level of TSH (β=0.395, t=2.985, P<0.01). There is no significant association between thyroid hormone levels and cognition (MMSE, ADAS-cog and its subscale score). Conclusions There might be a relationship between thyroid hormone levels and the neuropsychiatric symptoms in euthyroid patients with AD.     

PPARγ、UCP2与非乙醇性脂肪性肝病

研究显示过氧化物酶体增殖物激活受体γ和解耦联蛋白2参与了非乙醇性脂肪性肝病的发病。过氧化物酶体增殖物激活受体γ和胰岛素抵抗及脂肪细胞因子间有密切联系。解耦联蛋白2也可调节胰岛素分泌、限制活性氧产生、调节ATP合成等。阐明过氧化物酶体增殖物激活受体γ、解耦联蛋白2与非乙醇性脂肪性肝病之间的联系有助于进一步防治非乙醇性脂肪性肝病。     

pEGFP-C2-MeCP2重组质粒的构建和表达

目的构建人类甲基化CpG结合蛋白( MeCP2)基因的真核表达载体pEGFP-C2-MeCP2,在非洲绿猴肾成纤维细胞(COS-7)中检测其表达及定位。方法从人肝癌细胞(HepG2)中获得cDNA,以其为模板扩增MeCP2全长编码基因,克隆到载体 pEGFP-C2上。构建的重组质粒测序后转染至COS-7细胞中,荧光倒置显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,检测MeCP2蛋白定位,Western blot法和RT-PCR法鉴定MeCP2蛋白和基因表达。结果成功构建 pEGFP-C2-MeCP2重组质粒,酶切鉴定片段为1461 bp。 MeCP2蛋白及基因表达水平明显增加。细胞定位实验结果显示MeCP2蛋白定位于胞核。结论成功构建重组质粒 pEGFP-C2-MeCP2,该质粒的构建为进行MeCP2功能研究提供了依据。     

脑神经胶质细胞瘤和脑膜瘤患者血清IGFBP-2水平测定及临床意义

目的探讨神经胶质细胞瘤及脑膜瘤患者血清类胰岛素样生长因子结合蛋白2（IGFBP-2）浓度与肿瘤病理分级关系及其临床意义。方法42例神经胶质细胞瘤患者全部采用ELISA法进行检测（其中Ⅱ级15例、Ⅲ级13例和Ⅳ级14例）,另外脑膜瘤患者19例、健康者（对照组）22例,均检测血清IGFBP-2表达情况。结果神经胶质细胞瘤组血清IGFBP-2浓度显著高于脑膜瘤组及健康对照组（P〈0．05,P〈0．01）;脑膜瘤组血清IGFBP-2浓度显著高于健康对照组（P〈0．05）。WHOⅣ级与WHOm级神经胶质细胞瘤患者血浆IGFBP-2浓度都显著高于WHOⅡ级神经胶质细胞瘤患者血浆IGFBP-2浓度（P〈O．05,P〈O．05）;WHOⅢ级与Ⅳ级神经胶质细胞瘤患者血浆IGFBP-2浓度无显著性差异（P=0．812：〉0．05）。结论神经胶质细胞瘤患者血浆和肿瘤组织IGFBP-2表达可作为神经胶质细胞瘤患者预后判断的标志物。