TAT-EGFP融合蛋白表达载体的构建及表达

目的:构建TAT-EGFP原核表达载体,在E.coli BL21中高效表达并纯化.方法:人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET28a后得到pET28a-TAT重组质粒,再连接绿色荧光蛋白(EGFP)基因,组成pET28a-TAT-EGFP重组表达子.转化大肠杆菌,IPTG诱导TAT-EGFP融合蛋白表达.表达产物用十二烷基硫钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,组氨酸亲和层析柱纯化融合蛋白.结果及结论:成功地构建了TAT-EGFP融合蛋白的原核表达载体,在诱导后获得了高效表达并纯化,为进一步研究TAT的蛋白转导作用奠定了基础.     

MPP—hPER1融合蛋白穿膜的实验研究

本课题研究了MPP－hPER1融合蛋白对多种细胞的穿膜性。在分析MPPs家族分子组成特点的基础上，合成了PLNG活性肽。并且应用重组技术构建了MPP－hPER1融合蛋白表达体系，通过细胞培养、转染、免疫荧光染色等手段，观察了不同作用时间、不同温度、不同细胞系的条件下，PLNG及MPP－hPER1融合蛋白对细胞膜的穿透能力。结果显示：PLNG及MPP－hPER1融合蛋白穿透细胞膜是非能量依赖型、非时间依赖型和非细胞种系依赖型。提示生物体中有一类特殊的生物大分子，按照非经典途径进入细胞发挥生物学活性作用。实验结果提示，PLNG可以作为一种特殊的生物分子载体，介导功能分子进入细胞，在基因治疗及细胞治疗领域发挥作用。     

TAT-EGFP融合蛋白的表达及在PC12细胞的转导活性

目的:构建pET28a-TAT-EGFP重组子,观察表达的融合蛋白TAT-EGFP在细胞内的转导活性.方法:人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET28a后再连接EGFP基因,组成pET28a-TAT-EGFP重组表达子.转化大肠杆菌,IPTG诱导TAT-EGFP融合蛋白表达,组氨酸亲和层析柱纯化.将融合蛋白加入培养的PC12细胞,观察荧光进入细胞的情况.结果:成功地构建了高表达pET28a-TAT-EGFP重组子,纯化了分子质量约为29 ku的融合蛋白TAT-EGFP,并在体外培养的PC12细胞中证实TAT-EGFP融合蛋白穿透生物膜的能力.结论:通过对TAT-EGFP融合蛋白的表达纯化及活性分析,证实了TAT的蛋白转导作用,为肽类及生物大分子药物进入组织细胞内发挥治疗作用提供了理论基础.     

TAT-NDPK-A蛋白的构建表达及穿膜初步研究

目的 构建pET-TAT-nm23-H1质粒,表达TAT-核苷二磷酸激酶A(TAT-nucleoside diphosphate kinase A,TAT-NDPK-A)融合蛋白,并研究融合蛋白穿膜进入A549细胞.方法 人工合成编码TAT蛋白转导区域的11个氨基酸序列于NDPK-A引物的上游,PCR扩增后将融合基因克隆到pET28(a)原核表达载体上,经IPTG诱导表达、镍离子树脂色谱纯化TAT-NDPK-A蛋白,Westen-blot鉴定分析重组蛋白的抗原性,将TAT-NDPK-A蛋白加入到A549细胞中,荧光免疫组化检测蛋白穿膜进入细胞内.结果 TAT序列与NDPK-A正确融合并插入pET28(a)载体上,经诱导表达纯化成功获得纯度为97%的TAT-NDPK-A蛋白,在培养的A549细胞中加入重组蛋白4 h后在细胞内检测到穿膜的蛋白.结论 构建表达TAT-NDPK-A蛋白,TAT序列能够引导重组蛋白穿过细胞膜进入细胞内,为进一步研究基因的功能奠定了基础.     

MPP-hPER1融合蛋白穿膜的实验研究

本课题研究了MPP-hPER1融合蛋白对多种细胞的穿膜性.在分析MPPs家族分子组成特点的基础上,合成了PLNG活性肽.并且应用重组技术构建了MPP-hPER1融合蛋白表达体系,通过细胞培养、转染、免疫荧光染色等手段,观察了不同作用时间、不同温度、不同细胞系的条件下,PLNG及MPP-hPER1融合蛋白对细胞膜的穿透能力.结果显示PLNG及MPP-hPER1融合蛋白穿透细胞膜是非能量依赖型、非时间依赖型和非细胞种系依赖型.提示生物体中有一类特殊的生物大分子,按照非经典途径进入细胞发挥生物学活性作用.实验结果提示,PLNG可以作为一种特殊的生物分子载体,介导功能分子进入细胞,在基因治疗及细胞治疗领域发挥作用.     

融合蛋白TAT-EGFP的表达及其对膀胱癌细胞和组织的穿膜活性鉴定

目的构建穿膜肽-增强型绿色荧光蛋白(TAT-EGFP)融合蛋白的原核表达系统,研究该融合蛋白在体外对人膀胱癌细胞(EJ细胞)和膀胱癌组织的跨膜作用。方法以pEGFP-1载体为模板,设计包含TAT序列的引物,用PCR技术扩增TAT-EGFP基因,扩增产物插入载体pET30a,构建成重组质粒pET30a-TAT-EGFP。将重组质粒转入大肠杆菌BL21中,IPTG诱导TAT-EGFP融合蛋白表达。表达产物用十二烷基硫钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,Ni-NTA Superflow Cartvidge亲和层析柱纯化融合蛋白。将融合蛋白TAT-EGFP加入培养的EJ细胞和膀胱癌组织,荧光显微镜观察TAT-EGFP融合蛋白进入EJ细胞和膀胱癌组织的情况。结果成功构建了高表达pET30a-TAT-EGFP重组子,纯化了分子质量约为31 kD的融合蛋白TAT-EGFP。不同浓度的TAT-EGFP融合蛋白对膀胱癌细胞均无明显毒性。TAT-EGFP融合蛋白具有穿过膀胱癌细胞和膀胱癌组织的作用。结论通过对TAT-EGFP融合蛋白表达纯化及活性分析,证实TAT的蛋白转导作用,为肽类及生物大分子药物进入组织细胞内发挥治疗作用提供了理论基础。     

pET15b-YARA-EGFP原核表达质粒的构建及融合蛋白YARA-EGFP的表达与纯化

目的:构建原核表达载体pET15b-YARA-EGFP,并进行YARA-EGFP融合蛋白的表达和纯化。方法:用分子克隆技术构建出表达型载体pET15b-YARA-EGFP,在E.coliBL21(DE3)中表达融合蛋白YARA-EGFP,并进行Ni2+-NTA树脂柱亲和层析以纯化蛋白。结果:经测序证实成功构建了表达型载体pET15b-YARA-EGFP,YARA-EG-FP融合蛋白在E.coliBL21(DE3)中得到表达,纯化后的蛋白浓度为1.098mg/mL。SDS-PAGE和Western blot分析表明纯化蛋白为目的蛋白YARA-EGFP。结论:已成功制备出YARA-EGFP融合蛋白。     

TAT蛋白转导结构域介导的BCR/ABL融合蛋白在小鼠体内的跨膜转运

目的　探讨HIV 1反式激活蛋白 (TAT)的蛋白转导结构域 (PTD)介导的BCR ABL(TATPTD BCR ABL)融合蛋白在小鼠体内的跨膜转运和通过血脑屏障作用。方法　在大肠杆菌中表达PTD BCR ABL融合蛋白 ,经Ni NTA树脂亲合层析 ,纯化后的融合蛋白经小鼠尾静脉注射体内 ,用免疫组织化学方法对小鼠组织细胞内的PTD BCR ABL融合蛋白进行检测。结果　①表达和纯化了分子量为 2 3× 10 3的PTD BCR ABL融合蛋白 ;②在接受融合蛋白的小鼠肝、脾、肾及心肌组织的细胞内检测到了PTD BCR ABL融合蛋白 ;③接受融合蛋白的小鼠脑组织细胞中可以检测到融合蛋白的存在。结论　PTD可在体内介导较大分子量的融合蛋白进入组织细胞和通过血脑屏障 ,有望为利用外源性蛋白质进行细胞内治疗和中枢神经系统疾病的治疗提供一种新的工具     

TA-SOD融合蛋白表达载体的构建

目的:构建pET28a-TAT-SOD原核表达载体,纯化并测定其活性.方法:PCR法扩增TAT-SOD片段,插入载体pET28a后得到pET28a-TAT-SOD重组表达子,转化人肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导TAT-SOD融合蛋白表达.表达产物用SDS-PAGE电泳鉴定,组氨酸亲和层析柱纯化融合蛋白,利用SOD活性测定试剂盒测定其活性.结果:构建了高表达重组子pET28a-TAT-SOD,获得了相对分子质量约为25 000的具有活性的融合蛋白TAT-SOD,纯度达90%.纯化的蛋白浓度为700 mg/L,活性为197.54 U/L.结论:成功构建了具有活性TAT-SOD融合蛋白的表达载体.     

SARS 冠状病毒S2蛋白胞外段的原核表达及其细胞膜融合效应研究

目的 构建SARS冠状病毒S2蛋白胞外段( S2ED)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的融合蛋白表达质粒,获得在原核细胞中表达的目的 蛋白.方法 在生物信息学预测基础上,利用PCR方法 扩增S2ED和EGFP的编码序列,插入到质粒pET-14b中构建融合表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白His-S2ED-EGFP.采用Ni-NTA亲和树脂纯化融合蛋白可溶部分,利用SDS-PAGE和免疫印迹的方法 鉴定纯化后的蛋白,通过荧光显微镜考察S2ED与Hela细胞胞膜能否发生融合效应.结果 重组质粒pET-14b-S2ED- EGFP的构建正确无误,并能够在BL21(DE3)中高效表达.纯化后的蛋白与Hela细胞孵育后,未观察到蛋白通过膜融合的过程内化进入细胞.结论 S2ED的绿色荧光蛋白融合表达载体构建成功,并在原核细胞中获得了部分可溶的表达和有效的纯化.虽然原核表达的重组蛋白未能在Hela细胞上发挥预期的生物学效应,但是该工作将为加深S2蛋白介导的胞膜融合过程的认识以及未来进行以特异性细胞结合肽为基础的定向靶细胞转运系统研究奠定重要的基础.     

原核表达的含PTD—eGFP不同分子质量融合蛋白穿膜能力的比较

目的: 评价HIV-1 TAT蛋白转导结构域(PTD)携带的不同分子质量融合蛋白的穿细胞膜能力.方法: 诱导表达、纯化含PTD-eGFP的不同分子质量的融合蛋白,与细胞共育后,通过流式细胞术、激光共聚焦评价融合蛋白穿膜能力.结果: 诱导表达、纯化获得3种含PTD-eGFP的不同分子质量的融合蛋白.流式细胞术和激光共聚焦方法分析发现3种融合蛋白均具有高效穿膜能力.结论: PTD介导融合蛋白的穿膜能力与分子质量无直接关系.     

PTD-eGFP-△ E250 mFoxp3融合蛋白的表达与穿膜能力鉴定

目的:构建、表达并纯化含有蛋白转导结构域(protein transduction domain,PTD)、eGFP的小鼠Foxp3突变体(PTD-eGFP-△E250 mFoxp3)融合蛋白,为研究小鼠Foxp3的功能奠定基础.方法:利用重叠延伸PCR方法构建pET28a-PTD-eGFP-△E250 mFoxp3原核表达载体,并在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中表达此融合蛋白,经Ni2柱纯化,通过流式细胞仪和激光共聚焦显微镜观察其穿膜效率.结果:成功构建了pET28a-PTD-eGFP-△E250 mFoxp3原核表达载体,并表达和纯化了PTD-eGFP-△E250 mFoxp3融合蛋白,流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测结果显示融合蛋白能很好地穿过细胞膜进入细胞内,并定位于细胞质和细胞核.结论:成功制备了具有穿膜活性的PTD-eGFP-△E250 mFoxp3融合蛋白,为更好地研究小鼠Foxp3的功能与特性奠定了实验基础.     

TAT蛋白转导结构域介导融合蛋白在小鼠活体的跨膜递送作用

目的 探讨跨膜递送短肽--TAT蛋白转导结构域(简称TAT)介导的与其融合的活性蛋白在活体的跨膜递送作用.方法 以融合蛋白GST-TAT-GFP,GST-GFP-TAT和GST-GFP为研究模型蛋白,不经过蛋白质的变性处理、直接通过向小鼠腹腔注射和皮肤涂抹这两种含TAT的融合蛋白及作为对照的融合蛋白GST-GFP,一定时间作用后取体内器官和皮肤做冷冻切片,荧光显微镜检测这些融合蛋白的跨膜递送情况;并对分别融合在C端或者N端的TAT介导GFP在活体动物体内和皮肤的跨膜递送作用进行对比.结果 腹腔注射实验结果表明,TAT可以介导不经过蛋白质的变性处理的融合蛋白GST-TAT-GFP和GST-GFP-TAT跨膜递送进入到小鼠的心脏、肝、肾、脾和肺,甚至脑组织;其中GST-GFP-TAT跨膜递送效率比GST-TAT-GFP更高.结构模拟分析提示GST-GFP-TAT与GST-TAT-GFP中的TAT的暴露情况不同可能是造成两种蛋白跨膜递送活性差异的重要因素.皮肤实验的结果则表明TAT不仅介导融合蛋白GST-TAT-GFP和GST-GFP-TAT进入小鼠表皮,而且使其进入小鼠皮肤的真皮层.结论 TAT可以跨膜递送不经过变性处理的融合蛋白进入小鼠皮肤和体内,递送效率可能与TAT的暴露程度相关;这些结果为在蛋白质疗法方面应用TAT提供了进一步的理论依据.     

TAT-SOD融合蛋白表达载体的构建

目的:构建pET28a-TAT-SOD原核表达载体,纯化并测定其活性。方法:PCR法扩增TAT-SOD片段,插入载体pET28a后得到pET28a-TAT-SOD重组表达子,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导TAT-SOD融合蛋白表达。表达产物用SDS-PAGE电泳鉴定,组氨酸亲和层析柱纯化融合蛋白,利用SOD活性测定试剂盒测定其活性。结果:构建了高表达重组子pET28a-TAT-SOD,获得了相对分子质量约为25000的具有活性的融合蛋白TAT-SOD,纯度达90%。纯化的蛋白浓度为700mg/L,活性为197.54U/L。结论:成功构建了具有活性TAT-SOD融合蛋白的表达载体。     

融合蛋白TAT-HIF-1α-PAS-B原核表达载体的构建、表达及纯化

目的 构建蛋白转导结构域TAT和人缺氧诱导因子1α PAS-B结构域融合蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达及纯化.方法 分别构建原核表达质粒pTAT-PAS-B、pET-PAS-B和pTAT-EGFP;在大肠杆菌BL21(DE3)pLyss内,以IPTG诱导融合蛋白的表达,表达产物经SDS-PAGE及Western blot分析鉴定,利用镍-亚硝胺乙酸-组氨酸(NiNTA-His)亲和层析法对重组蛋白进行纯化.结果 成功构建了PAS-B结构域的原核表达载体,经过优化表达和纯化条件,融合蛋白在IPTG诱导下获得特异性表达,纯化得到了高纯度的目的蛋白.结论 含人缺氧诱导因子1αPAS-B和TAT结构域融合蛋白的成功表达及纯化,为应用该融合蛋白调控体内HIF-1α的活性奠定了基础.     

Tat-GFP融合蛋白的表达纯化及其穿膜活性

目的：获得具备穿膜活性与绿色荧光蛋白（GFP）标记的Tat-GFP融合蛋白,探讨Tat-GFP在MCF-7细胞中的跨膜转运特性。方法：应用pET-24a-Tat-GFP质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,检测不同异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）浓度（0.5和1.0 mmol•L^-1）和不同温度（22℃和37℃）诱导融合蛋白的表达情况;利用Ni-IDA树脂亲和纯化Tat-GFP蛋白,利用GFP特异性抗体采用Western blotting法分析洗脱液中的蛋白;激光共聚焦荧光显微镜下检测Tat-GFP融合蛋白的跨膜转运活性。 结果：0.5和1.0 mmol•L^-1 IPTG诱导出的细菌总蛋白中所含的Tat-GFP蛋白量无明显差异;低温（22℃）诱导生产的Tat-GFP蛋白量较37℃更高;Western blotting分析,GFP抗体能够特异性识别PVDF膜上的蛋白,条带灰度与Tat-GFP蛋白上样量有关联;细胞穿膜实验,绿色荧光分布于MCF-7细胞的细胞质和细胞核中。 结论：低温诱导时大肠杆菌BL21菌体上清液中Tat-GFP融合蛋白量更高,所生产的Tat-GFP融合蛋白既具备穿膜活性又具有易于检测的绿色荧光。     

前列腺组织特异性启动子介导的TAT-EGFP的靶向表达

目的〓〖HTK〗构建由前列腺特异抗原（PSA）启动子介导、表达带有蛋白转导结构域序列（TAT）的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合蛋白pPSA-TAT-EGFP表达载体,使TAT所携带的目的蛋白能够在靶组织中高效表达,提高其特异性及表达效率。〖HTW〗方法〓〖HTK〗以pEGFP-1载体为模板,设计包含TAT序列的引物,PCR技术扩增含有酶切位点的小片段Sal I-TAT-EGFP-Not I,经胶回收纯化,连接到T克隆载体。双酶切及测序鉴定后,提取质粒、双酶切后胶回收得到目的小片段。 含有PSA启动子的pPSA-EGFP载体经Sal I和Not I双酶切后,胶回收含有PSA启动子序列的大片段。过夜连接目的小片段与PSA启动子大片段,得到pPSA-TAT-EGFP表达载体。转化、筛选阳性克隆后酶切与测序鉴定。将构建载体分别转染前列腺癌细胞和大肠癌细胞检测其表达情况。〖HTW〗结果〓〖HTK〗成功构建pPSA-TAT-EGFP表达载体。转染结果显示其能够在前列腺癌细胞中特异性表达。〖HTW〗结论〓〖HTK〗引入了PSA组织特异性启动子的TAT所携带的目的蛋白能够在前列腺癌组织中表达。     

细胞穿透肽核靶向运输蛋白表达载体的构建及其蛋白转导功能的研究

目的 构建基于细胞穿透肽靶向细胞核运输的蛋白表达载体，并研究其蛋白转导功能。方法 在带His标记的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）表达载体pET14b—HE（pET14b-His-EGFP）基础上，利用点突变的方法构建依次含细胞穿透肽（CPP）、连接子、核定位信号（NLS）序列和EGFP的融合蛋白表达载体pET14b—HC（L）NE（pET14b—His—CPP—Linker-NLS—EGFP）；经酶切、测序鉴定载体构建正确后，将重组质粒转化BL21（DE3）宿主菌，经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导表达后、用Ni^2＋亲和层析纯化得到融合蛋白：将融合蛋白透析、过滤除菌后加入培养的真核细胞中，荧光显微镜下观察并进行Western blot检测分析其在活细胞的蛋白转导功能。结果 酶切、测序证实载体构建成功，融合蛋白在大肠杆菌中可有效表达：蛋白转导实验可见融合蛋白可快速穿透细胞膜并进入细胞核，并且这种内化转导功能存在时间和剂量依赖效应。结论 成功构建了基于细胞穿透肽的蛋白表达运输载体，建立了可携带外源蛋白进入细胞浆及细胞核的运输系统，为研究蛋白或多肽的细胞内功能以及运输药物提供了一种经济有效的工具。     

人乳腺癌细胞特异性多肽跨膜转导机制初步研究

目的:初步探讨人乳腺癌细胞MDA-MB-231特异性多肽PI的跨膜转导机制.方法:合成PI肽链,并在其N端进行FITC标记;探讨FITC-PI的跨膜转导与MHC-Ⅰ表达的关系,利用MHC-Ⅰ抗体阻断MDA-MB-231细胞和Calu-1细胞表面MHC-Ⅰ抗原,聚合酶链反应-序列特异性引物法进行基因分析;探讨FITC-P...     

穿膜肽TAT的固相合成及体外活性研究

目的 以固相合成法合成穿膜肽TAT,并对合成产物进行活性评价.方法 采用Na-芴甲氧羰基(fluorenyl-methyloxyloxycarbonyl,FMOC)作为α-氨基的保护基,以逐个延伸的固相合成法合成穿膜肽TAT.应用高效液相色谱和质谱仪测定其纯度及相对分子质量;荧光显微镜观察穿膜肽TAT介导增强型绿色荧光蛋白(enhanced green flutescent pro-tein,pEGFP)质粒在体外培养人脐静脉内皮细胞中的转染效果以评价穿膜肽TAT的生物活性;MTT法检测穿膜肽TAT与质粒DNA复合物对人脐静脉内皮细胞生长活性的影响.结果 高效液相色谱和质谱鉴定所制备穿膜肽TAT的纯度为96.6%,相对分子质量1 880.它能够携带质粒DNA穿过细胞膜进行基因转染,并对细胞活性无明显影响.结论 采用Fmoc固相肽合成法可以成功地合成有生物活性的穿膜肽TAT.