神经酰胺诱导人结肠癌HT-29细胞凋亡的研究

目的探讨外源性神经酰胺诱导人结肠癌HT-29细胞的凋亡作用及对Bcl-2家族蛋白基因表达的影响。方法不同浓度C2-神经酰胺处理HT-29细胞,采用Hoechest荧光染色和琼脂糖凝胶电泳方法检测细胞凋亡,RT-PCR方法检测Bcl-2、Bcl-xl、Bax、Bad和Bid基因表达水平。结果C2-神经酰胺诱导HT-29细胞发生核染色质断裂、出现凋亡小体等典型凋亡改变,50μmol/L神经酰胺作用12和24小时凋亡细胞率分别达到64·7%和81·3%。同时神经酰胺使Bax、Bad和Bid基因表达水平增高,使Bcl-2和Bcl-xl基因表达水平减弱,Bcl-2与Bax比值下降,呈现剂量-效应关系。结论外源性神经酰胺能通过上调或下调Bcl-2家族基因表达水平诱导人结肠癌HT-29细胞发生凋亡。     

神经酰胺诱导人结肠癌细胞凋亡的作用

目的 探讨外源性神经酰胺诱导结肠癌HT-29细胞凋亡的作用。方法 采用噻唑兰(MTT)显色法、荧光显微镜、电镜观察以及通过免疫组化方法检测Fas、P53的表达情况。结果 神经酰胺对HT-29细胞的生长有明显抑制作用，并可诱导HT-29细胞产生凋亡，并随着神经酰胺浓度的增加，细胞凋亡率逐渐增加；Fas蛋白的表达随着神经酰胺浓度的增加呈现逐渐升高的趋势，p53蛋白的表达随着神经酰胺浓度的增加呈现降低的趋势。结论 神经酰胺能诱导HT-29细胞产生凋亡。     

丹皮酚对人大肠癌HT-29细胞bcl-2和bax基因表达的影响

目的探讨丹皮酚（Pae）对人大肠癌HT-29细胞的增殖抑制、凋亡诱导作用及可能的作用机制,为寻求大肠癌治疗的新策略提供理论依据。方法应用荧光显微镜和透射电镜技术观察不同浓度的Pae对HT-29细胞增殖的抑制及凋亡诱导作用;应用免疫细胞化学技术检测用药前后凋亡相关基因bcl-2、bax表达的变化。结果荧光显微镜及透射电镜观察到Pae作用后HT-29细胞出现典型的细胞凋亡形态;Pae在15.63 mg/L、62.5 mg/L、250 mg/L3种浓度下作用48 h均可诱导HT-29细胞凋亡;免疫细胞化学结果显示Pae作用后HT-29细胞bcl-2蛋白表达显著降低,bax蛋白表达无显著改变。结论Pae可抑制HT-29细胞增殖并诱导其凋亡,并呈现明显的剂量-效应关系和时间-效应关系,其作用机制可能与下调bcl-2/bax的表达比例有关。     

肌醇六磷酸诱导HT-29细胞凋亡及相关基因表达

目的研究肌醇六磷酸(IP6)对人结肠癌细胞系(HT-29)的凋亡诱导作用。方法将不同浓度IP6以不同时间作用于HT-29细胞,运用透射电镜观察IP6对HT-29细胞凋亡作用;流式细胞仪检测细胞凋亡率变化;钙离子荧光探针(Fura-2/AM)法测定细胞内Ca2+浓度变化;RT-PCR法检测细胞内caspase-3 mRNA表达。结果IP6诱导HT-29细胞发生凋亡的形态学变化为染色体固缩,可见凋亡小体;3.3mmol/L IP6作用6个月HT-29细胞凋亡率为4.4%,细胞内Ca2+浓度为38.66 mmol/L,与对照组比较明显升高(P0.05);各IP6组Caspase-3mRNA表达均升高(P0.05);IP6诱导HT-29细胞凋亡作用及Ca2+、Caspase-3mRNA的表达变化具有时间依赖关系。结论IP6对HT-29细胞有诱导凋亡作用,其机制可能是通过调节细胞内Ca2+浓度及Caspase-3的表达来实现。     

家蝇3龄幼虫抗肿瘤肽促K562细胞凋亡作用及其机制研究

目的观察家蝇3龄幼虫抗肿瘤肽对K562细胞核和线粒体膜电位及K562细胞凋亡蛋白半胱天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的影响,进而探讨家蝇3龄幼虫抗肿瘤肽是否可以影响线粒体膜电位及促进K562细胞凋亡。方法首先采用Hoechst33258荧光标记法,将家蝇3龄幼虫峰5、峰8组分作用于K562细胞,用荧光显微镜检测K562细胞核荧光强度的变化;其次采用荧光探针罗丹明123标记K562细胞,在激光扫描共聚焦显微镜下观察K562细胞中罗丹明123荧光强度,以细胞内荧光强度表示线粒体膜电位大小;最后用caspase-3检测试剂盒和酶标仪测定K562细胞caspase-3的含量。结果采用Hoechst33258荧光标记法,用荧光显微镜观察到家蝇3龄幼虫峰5、峰8组分作用于K562细胞后部分细胞核的荧光强度增强,说明其可以引起K562细胞发生凋亡;用罗丹明123标记,激光共聚焦显微镜观察发现,家蝇3龄幼虫峰5、峰8组分作用组的K562细胞荧光强度值明显低于对照组(t1=21.30,t2=196.23,P<0.05),说明家蝇3龄幼虫抗肿瘤肽可以使K562细胞线粒体膜电位降低;峰5、峰8组分作用组caspase-3的含量明显高于对照组(t1=146.92,t2=189.56,P<0.05),说明3龄幼虫抗肿瘤肽可以促进K562细胞发生凋亡。结论家蝇3龄幼虫抗肿瘤肽峰5、峰8组分对K562细胞核具有损伤作用,可以引起K562细胞发生凋亡,作用机制是通过降低K562细胞线粒体膜电位,激活caspase-3,扰乱其生理功能,促使其凋亡。     

姜黄素诱导人结肠癌细胞凋亡作用

目的探讨姜黄素对人的结肠癌细胞系(HT-29)体外增殖及凋亡的影响。方法采用噻唑蓝(MTT)比色法测定姜黄素在不同浓度对HT-29细胞的抑制作用;利用流式分光光度技术、荧光显微镜技术和电镜技术,观察姜黄素对HT-29细胞诱发凋亡及细胞周期的变化。结果姜黄素可明显抑制HT-29细胞的生长,其抑制率与药物浓度成剂量依赖关系,半数抑制浓度为(15.9±1.96)μmol/L。流式细胞分析仪结果表明,姜黄素能使HT-29在加药后24h出现凋亡峰;荧光显微镜下可见姜黄素处理组织细胞核呈现深染、致密的颗粒块状荧光。电镜观察可见姜黄素能使细胞发生凋亡,出现核边集及染色质浓缩成块状。结论姜黄素可抑制大肠癌细胞的生长,其机制可能与诱导细胞凋亡有关。     

镉致大鼠心肌细胞H9c2凋亡作用

目的 研究不同浓度氯化镉(CdCl2)引起大鼠心肌细胞H9c2凋亡作用.方法 采用姬姆萨染色法观察氯化镉对细胞毒作用的形态学改变;采用Annexin V-FITC/propidium iodide(PI)流式细胞技术(flowcytometric,FCM)检测氯化镉对H9c2细胞凋亡的影响;采用流式细胞术法检测线粒体膜电位(MMP)的变化;采用免疫细胞化学法检测细胞色素C表达.结果 5,10,30,50,80 lamol/L的氯化镉分别作用H9c2细胞6,12,24 h可以诱导细胞凋亡;随着镉剂量的加大及作用时间的延长,线粒体膜电位明显下降,与阴性对照比较,差异有统计学意义(P<0.05);随着镉剂量增加,CytC表达增强.结论 镉可以通过线粒体途径诱导H9c2细胞凋亡.     

铜对L-02细胞线粒体的损伤作用

[目的]观察铜对人肝细胞L-02线粒体的损伤作用。[方法]将硫酸铜用D-Hank’s液和培养液稀释成终浓度分别为50、100、150、200μmol/L的硫酸铜与L-02细胞共培养18h,进行量效关系研究;以150μmol/L浓度与L-02细胞共培养0、6、12、18、24h进行时效关系研究。正常对照组：加入与处理组等体积的D-Hank’s液。采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT法）检测线粒体酶抑制率和整体功能的变化;透射电镜观察线粒体超微结构的变化;罗丹明123（Rh123）和碘化丙啶（PI）结合流式细胞仪（FCM）检测线粒体膜电位（MMP）的变化和细胞凋亡率;免疫细胞化学法检测细胞色素C的释放。[结果]铜可引起线粒体酶抑制率和线粒体功能的变化;透射电镜下观察到线粒体结构受到不同程度的损伤,并随剂量增大和时间延长损伤加重;FCM结果表明随着铜剂量增大,实验组Rh123平均荧光强度逐渐降低,由对照组93.60±18.12下降至200μmol/L组59.94±13.55,即膜电位呈逐渐降低趋势;而细胞凋亡率逐渐增加,由对照组2.73%增加至200μmol/L组17.07%（P〈0.05,P〈0.01）。随着铜作用时间的延长,Rh123平均荧光强度逐渐降低,由对照组93.60±18.12降低至24h组55.74±15.45,即膜电位呈逐渐降低趋势;而细胞凋亡率逐渐增加,由对照组2.73%降低至24h组20.45%（P〈0.05,P〈0.01）。免疫细胞化学实验显示,细胞色素C从线粒体释放入胞质,释放量呈现一定的剂量依赖性和时间依赖性。[结论]铜可诱导L-02细胞线粒体损伤,引起膜电位降低,细胞色素C释放入胞质,线粒体结构和整体功能遭破坏,导致细胞损伤甚至凋亡。     

亚砷酸钠诱导大鼠胰岛β细胞株INS-1凋亡及其机制的研究

目的 研究亚砷酸钠( sodium arsenite)对大鼠胰岛β细胞株INS-1(INS-1细胞)的凋亡作用及其机制.方法 将INS-1细胞暴露于不同浓度的亚砷酸钠,首先进行噻唑蓝(MTT)试验,并用荧光分光光度计测定INS-1细胞线粒体膜电位及溶酶体膜电位的吸光度(A)值;并于亚砷酸钠作用后,应用荧光显微镜和流式细胞仪观察并检测INS-1细胞的凋亡情况.结果 经亚砷酸钠作用后,INS-1细胞的活性明显下降,且细胞活性随着亚砷酸钠剂量的升高而降低;24h后,细胞线粒体膜电位荧光值明显下降,且随着亚砷酸钠剂量的增加而降低,差异有统计学意义(P＜0.01);48h后,细胞溶酶体膜电位荧光值明显上升,且随着亚砷酸钠剂量的增加而升高,差异有统计学意义(P＜0.01);72 h后,荧光显微镜下观察细胞,出现凋亡,随着亚砷酸钠剂量的增加,凋亡的细胞也随之增多,镜下呈亮蓝色,胞核固缩、裂解为碎块出现凋亡小体和核碎裂,部分染色质出现浓缩状态;流式细胞仪检测结果,经亚砷酸钠处理后,凋亡的细胞明显增多,且随着亚砷酸钠剂量的增高,凋亡细胞数量也随之增多.结论 亚砷酸钠通过线粒体-溶酶体途径诱导大鼠胰岛β细胞株INS-1凋亡.     

二十碳五烯酸（EPA）对胃癌细胞增殖与凋亡的影响

目的观察二十碳五烯酸（EPA）对人胃癌细胞系增殖与凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法以终浓度为10、20、40μg／ml的EPA作用于SGC-7901和MGC-803人胃癌细胞系24-72h。采用四甲基偶氮唑蓝法检测细胞增殖抑制率,采用流式细胞技术分析细胞周期分布与细胞凋亡,利用荧光探针rhodamine 123测定线粒体膜电位,酶联免疫吸附法测定线粒体和胞浆中细胞色素C水平,荧光光谱法测定凋亡效应酶半胱天冬蛋白酶-3（caspase-3）活性。结果经10-40μg／ml EPA处理的胃癌细胞增殖率显著降低,且呈现时间依赖性。与对照组比较,经40g／ml EPA作用72h后,SGC-7901和MGC-803细胞G0／G1期细胞的比例均增加（P=0.006、P=0.009）。经40g／ml EPA作用24h后,胃癌细胞线粒体膜电位显著低于对照组（P=0.001、P=0.047）;线粒体内细胞色素C的含量明显少于对照组（P=0.001、P=0.000）,而细胞浆中细胞色素C含量显著高于对照组（P=0．001、P=0．000）。在SGC-7901细胞中,caspase-3活性随着EPA（40g／mL）作用时间延长而升高。结论EPA通过诱导细胞周期阻滞和激活线粒体通路,抑制人胃癌细胞增殖,诱导细胞凋亡。     

舒林酸抑制结肠癌细胞株增殖及其转移机制的研究

目的 研究非选择性COX抑制荆舒林酸对结肠癌细胞株HT-29生长的影响及其参与引起细胞死亡的可能机制.方法 采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测舒林酸对结肠癌细胞增殖的抑制,激光共聚焦显微镜(LSM)及荧光显微镜观察细胞凋亡,流式细胞仪(FCM)分析其对细胞凋亡及细胞周期的影响.结果 MTT显示舒林酸能呈剂量和浓度依赖性抑制HT-29的增殖.TUNEL染色荧光显微镜下观察凋亡细胞呈棕褐色,AnnexinV/PI染色后LSM观察凋亡细胞胞膜绿染,胞核红染或呈桔黄色,FCM显示此药促进细胞的凋亡,使处于G0/G1期的细胞比例显著降低.结论 舒林酸可抑制结肠癌细胞株HT-29生长,促进其凋亡,其机制可能与其阻止细胞周期的进展有关.     

Induction of apoptosis in HT-29 colon cancer cells by phloretin

Phloretin, which is present in apples and pears, has been found to inhibit the growth of several cancer cells and induce apoptosis of B16 melanoma and HL60 human leukemia cells. The present study examined whether and how phloretin induces apoptosis of HT-29 human colon cancer cells. Phloretin (0-100 micromol/L) substantially decreased viable cell number and induced apoptosis of HT-29 cells in a dose-dependent manner. Western blot analysis of total cell lysates revealed that phloretin increased the protein levels of Bax but had no effect on Bcl-2. In addition, phloretin induced cleavage of caspase-8, -9, -7, and -3 and poly(ADP-ribose) polymerase. Furthermore, phloretin increased the levels of cytochrome c and Smac/Diablo in the cytosol. The present results indicate that phloretin inhibits HT-29 cell growth by inducing apoptosis, which may be mediated through changes in mitochondrial membrane permeability and activation of the caspase pathways.     

鱼藤酮对PC12细胞的毒性作用

目的 研究鱼藤酮对PC12细胞的毒性作用及其机制.方法 分别用0.1、0.5、1.0μmol/L的鱼藤酮染毒PC12细胞72 h,对照组加入相同剂量的DMS0,采用四甲基偶氮唑盐（MT T）比色法检测细胞活力,借助流式细胞仪检测各浓度下细胞的凋亡率和线粒体膜电位的变化.结果 0.1、0.5、1.0μmol/L鱼藤酮作用于PC12细胞72 h时,细胞活力随染毒浓度的增加而降低.细胞虽未发生明显的凋亡,但处于G1期细胞随染毒浓度增加而增多,G2/S期细胞相对减少,说明鱼藤酮抑制细胞增殖明显,线粒体膜电位降低显著.结论 鱼藤酮在小剂量长时间的持续作用时,启动了细胞凋亡,表现为对PC12细胞的线粒体膜电位的降低.     

Increased carnitine-dependent fatty acid uptake into mitochondria of human colon cancer cells induces apoptosis

Carnitine-dependent fatty acid import into mitochondria and beta-oxidation seem to be impaired in tumor cells. In the present study we show that a supply of palmitoylcarnitine together with L-carnitine potently induces apoptosis in HT-29 human colon cancer cells as a consequence of accelerated fatty acid oxidation. Caspase-3-like activities, measured by the cleavage rate of a fluorogenic tetrapeptide substrate and nuclear fragmentation determined after DNA labeling in fixed cells by fluorescence microscopy, served as indicators of apoptosis. Neither L-carnitine nor palmitoylcarnitine alone were able to increase caspase-3-like activities and DNA fragmentation, but when provided together, apoptosis occurred. That exogenous carnitine was indeed able to enhance fatty acid uptake into mitochondria was demonstrated by an increased influx of a fluorescent palmitic acid analog. Enhanced fatty acid availability in mitochondria led to an increased generation of O*2-, as detected by a O*2- -sensitive fluorogenic dye, indicating oxidation of delivered substrates. Benzoquinone, an O*2- scavenger, blocked O*2- generation and prevented apoptosis as initiated by the combination of palmitoylcarnitine and carnitine. The lack of effect of the ceramide synthesis inhibitor fumonisin on palmitoylcarnitine/carnitine-induced apoptosis further supports the notion that apoptotic cell death is specifically due to fatty acid oxidation. In contrast to HT-29 cells, nontransformed human colonocytes did not respond to exogenous palmitoylcarnitine/carnitine and no apoptosis was observed. In conclusion, our studies provide evidence that a limited mitochondrial fatty acid import in human colon cancer cells prevents high rates of mitochondrial O*2- production and protects colon cancer cells from apoptosis that can be overcome by an exogenous carnitine supply.     

Andrographolide Exhibits Anticancer Potential Against Human Colon Cancer Cells by Inducing Cell Cycle Arrest and Programmed Cell Death via Augmentation of Intracellular Reactive Oxygen Species Level

Andrographolide, a diterpenoid lactone and a major constituent of Andrographis paniculata Nees, exhibits remarkable anticancer activity. However, the effect of andrographolide on colon cancer has not been completely elucidated yet. Thus, we investigated the chemopreventive potential of andrographolide in colon cancer HT-29 cells. The cytotoxic potential of andrographolide on HT-29 cells was determined by MTT assay, trypan blue exclusion assay, colony formation assay, and morphological analysis; and apoptotic property by DAPI and Hoechst staining, FITC-Annexin V assay, DNA fragmentation assay and caspase-3 activity assay. To elucidate andrographolide action, intracellular reactive oxygen species (ROS) level was determined by DCFDA dye; change in mitochondrial potential by Rhodamine123 and Mito Tracker Red CMXRos dye; and cell cycle modulatory property by flow cytometric analysis. Results of the study have shown that andrographolide decreased cell viability of HT-29 cells in a dose- and time-dependent manner. Furthermore, andrographolide induced apoptosis in HT-29 cells which seemed to be linked with augmented intracellular ROS level and disruption of mitochondrial membrane potential. Interestingly, andrographolide caused significant cell cycle arrest in G2/M phase at lower doses, but, in G0/G1 phase at higher doses. In summary, our results indicated that andrographolide exhibited antiproliferative and apoptotic properties against colon cancer HT-29 cells.     

丁酸钠对大肠癌HT-29细胞凋亡以及钙离子浓度的影响

目的研究丁酸钠(sodium butyrate,NaB)诱导大肠癌细胞HT-29凋亡的机制。方法 Hoechst 33342染色、Annexin V+PI和免疫印迹法检测NaB诱导大肠癌HT-29细胞的凋亡作用;激光共聚焦显微镜检测内质网(endoplasmic reticulum,ER)和细胞质中游离Ca2+浓度。结果 NaB可诱导大肠癌HT-29细胞凋亡,且具有剂量和时间反应关系;NaB浓度为2.5mmol/L,作用24h时凋亡标志分子(poly ADP-ribose polymerase,PARP)出现明显的切割片段;NaB可降低ER中游离Ca2+浓度以及升高细胞质内游离Ca2+浓度。结论 NaB可通过调节ER和细胞质中Ca2+浓度而诱导大肠癌HT-29细胞凋亡。