融合蛋白D2C-SN对登革2型病毒增殖的影响

目的：观察登革2型病毒衣壳蛋白（D2C）与葡萄球菌核酸酶（SN）融合蛋白在哺乳动物细胞中对登革2型病毒增殖的影响。方法：通过基因重组构建可在哺乳动物细胞中表达融合蛋白D2C-SN的重组质粒pc／D2C-SN，同步构建pc／D2C-SN用作对照。病毒感染BHK21细胞后，通过阳离子转染试剂将重组质粒导入感染细胞，在此基础上评价融合蛋白D2C-SN抗登革病毒感染的治疗效果。结果：融合蛋白D2C-SN能够在哺乳动物细胞中表达，对宿主细胞没有明显的毒性；与正常BHK21细胞相比较，可导致病毒感染性滴度降到原来的1／60—1／12。结论：融合蛋白D2C-SN在细胞水平能够有效抑制登革病毒的增殖。有可能成为潜在的抗登革病毒感染的治疗性药物。     

钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL32的重组表达及纯化

目的：构建L32-pQE32重组质粒，诱导表达重组钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL32，对重组蛋白进行纯化。方法：采用PCR法从钩端螺旋体DNA中获取编码LipL32的基因片段，构建重组克隆载体pGEM-T／L32和表达载体L32-pQE32，转化受体茵E.coli DH5α和E．coli M15，IPTG诱导表达重组LipL32蛋白。Ni-NTA亲和层析纯化重组LipL32蛋白。结果：扩增出约750bp的LipL32成熟蛋白基因，LipL32基因插入pQE32表达载体，表达产物6个组氨酸与LipL32蛋白的融合蛋白相对分子质量约为31000，与预期大小一致。Western印迹显示能与钩体抗血清特异结合。结论：LipL32蛋白能在大肠杆菌中表达，Ni-NTA亲和层析可有效纯化重组LipL32蛋白，重组LipL32蛋白具有结合活性。     

神经特异性转录因子DAT1绿荧光蛋白表达载体的构建及其在C8细胞中的表达定位

目的：构建神经特异性转录因子DAT1与绿荧光蛋白融合表达的表达载体，并检测其在C8星形胶质细胞中的表达。方法：采用基因重组技术将DAT1基因和绿色荧光蛋白基因融合，构建绿荧光蛋白表达载体pEGFP—C1-DAT1，测序验证序列无误后。用脂质体法将重组质粒转入C8细胞，荧光显微镜观察DAT1的表达及定位。结果：测序验证结果表明，重组质粒含有DAT1全长编码序列，转染实验表明EGFP—DAT1能在C8细胞中正确表达，且：DAT1蛋白主要定位于细胞核中。结论：DAT1全长cDNA基因绿色荧光蛋白表达载体构建成功，在C8细胞中可以正确表达，为进一步研究DAT1的功能奠定了基础。     

青霉素结合蛋白2a C-末端在大肠杆菌M15中的表达、纯化及鉴定

目的构建含目的基因mecA C末端的重组子并在大肠杆菌M15中进行蛋白表达。方法采用PCR方法扩增mecA C末端DNA，将其与表达载体pQE30连接；再通过PCR及双酶切鉴定连接产物。将含目的基因片段的阳性重组质粒转化大肠杆菌M15后，用1mmol／L的IPTG进行诱导表达。应用Ni-NTA琼脂糖进行亲和层析纯化目的蛋白，并用SDS-PAGE和Western blotting对表达产物进行鉴定。结果成功构建pQE30-mecA重组表达质粒，转化大肠杆菌M15，经IPTG诱导表达，亲和层析纯化获得分子量为39．7kDa的蛋白；Western blotting和肽指纹图谱证实该蛋白为带有多聚组氨酸标签的融合蛋白。结论在大肠杆菌内成功表达具有活性的PBP2a，为后期研究和开发抗MRSA药物奠定了基础。     

人MD-2/GST融合蛋白在大肠杆菌的表达

构建人髓样分化蛋白－2（human myeloid differentiation proterin-2,hMD-2)与谷胱甘肽巯基转移酶（glutathione-S-transferase,GST)的融合蛋白（hMD-2/GST)表达载体PGEX－4T－1／hMD-2，在大肠杆菌中融合表达hMD-2/GST。以真核表达载体PEF－BOS／hMD-2为模板，用PCR法在MD－2编码序列上下游引入酶切位点和终止密码子，将hMD-2编码序列克隆入原核表达载体PGEX－4T－1的相应酶切位点，用PCR和酶切筛选，鉴定重组质粒PGEX－4T－1/hMD-2，并对插入基因片断测序，重组质粒PGEX－4T－1／hMD-2转化大肠杆菌，经IPTG诱导后用SDS－PAGE分析表达产物。结果PCR，酶切鉴定和序列测实MD－2编码序列正向插入原核表达载体PGEX－4T－1的相应酶切位点，片断与PCR扩增产物大小相同，序列无误，阅读框架正确，SDS－PAGE证实hMD-2/GST在大肠杆菌中表达，表达量约占菌体总蛋白的30％，说明成功构建了PEGX－4T－1／hMD-2载体，hMD-2/GST融合蛋白在大肠杆菌中得到初步表达，为MD－2后续研究作了必要的准备。     

低分子量尿激酶与血纤蛋白粘附肽(12肽)融合表达及特性分析

人工合成血纤蛋白粘附肽（１２肽）ｃＤＮＡ，与低分子量单链尿激酶基因重组，获得血纤蛋白粘附肽与低分子量单链尿激酶的融合基因。将此融合基因重组入ｐＢＶ２２０表达载体并在大肠杆菌中表达，表达产物具有与天然尿激酶相同的抗原性和溶纤活性，同时兼具血纤蛋白粘附肽（１２肽）的抗血纤蛋白单体聚合的活性     

幽门螺杆菌热休克蛋白A基因的克隆及高效分泌表达

目的：从幽门螺杆菌（Ｈｐ）分离热休克蛋白Ａ基因，并实现在大肠杆菌中的融合分泌表达，方法：提取Ｈｐ染色体ＤＮＡ，用ＰＣＲ方法扩增ｈｓｐＡ基因。经克隆、测序后，构建融合分泌表达载体ｐＭＡＬ－ＨｓｐＡ，转化大肠杆菌，ＩＰＴＧ诱导表达。结果：分离得到了高度保守的３５４ｂｐ的ｈｓｐＡ基因片段，并在大肠杆菌中实现了该基因的融合分泌表达。在３７℃诱导表达３ｈ后，基融合分泌表达蛋白可占细菌周质总蛋白的６６．６％。     

低分子量尿激酶与血纤蛋白粘附肽（12肽）融合表达及特性…

人工合成血纤蛋白粘附肽（１２肽）ｃＤＮＡ，与低分子量单链尿激酶基因重，获得血纤蛋白粘附肽与低分子量单链尿酶的融合基因。将此融合基因重组入ｐＢＶ２２０表达载体并在大肠杆菌中表达，表达产物具有与天然尿激酶相同的抗原性和溶性活性，同时人血纤蛋白附肽（１２肽），的抗血纤收白单体聚合的活性。     

恙虫病东方体Karp株主要外膜蛋白基因的克隆与表达

目的：表达恙虫病东方体(Orientia tsutsugomushi)Karp株56000表面蛋白，探索其作为诊断抗原的可能性。方法：采用PCR方法，从Ot．Karp株菌种基因组DNA中扩增出56000成熟蛋白基因片段，将该片段克隆于原核表达载体pQE30，构建重组质粒pQE30／56，转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达、SDS-PAGE电泳和免疫印迹检测目的蛋白的表达。结果：(1)获得长约l500bp的Ot．Karp株56000外膜蛋白基因；(2)SDS-PAGE电泳和免疫印迹显示该重组质粒转化的大肠杆菌有一相对分子质量约为56000的独特蛋白带；(3)表达后菌体超声破碎后，目的蛋白主要以包涵体形式存在；(4)重组表达质粒序列分析结果显示，pQE30／56中插入的基因片段的序列与已报道的Ot．Karp株56000外膜蛋白基因序列基本一致。结论：获得了Ot．Karp56000蛋白基因，并在大肠杆菌中实现了表达，表达的重组蛋白具有免疫反应性。     

HER-2/neu配体结合区蛋白的表达、纯化及复性研究

目的：将HER-2/neu配体结合区(RLD)基因重组，并在大肠杆菌中表达，对以包涵体形式表达的融合蛋白进行变性和复性的研究。方法：采用PCR技术将皿R-2／neuRLD的两段基因分别扩增，并利用基因片段末端的共同酶切位点将两段基因相连接，连接产物插入原核表达载体，在大肠杆菌中实现融合蛋白的表达。表达产物经SDS-PAGE和Westem印迹检测后，进行蛋白质的变性、纯化和复性等处理。结果与结论：在大肠杆菌中实现了融合蛋白的高效表达，表达产物可被特异性抗体识别。经SDS-PAGE分析，表达产物以包涵体形式存在，通过变性、纯化和复性等处理，获得了含两个RID的融合蛋白，从而为HER-2／neu肿瘤疫苗的研究打下了基础。     

游泳对不同蛋白质负荷大鼠蛋白质代谢的影响

实验观察了３种蛋白质负荷水平（７％、１７％、２７％）的Ｗｉｓｔａｒ雄性大鼠，游泳后蛋白质代谢情况，结果表明，游泳可降低氮平衡值和骨骼肌氮含量，而血清尿素和氨基酸水平以及肝脏氮含量均增高，表明蛋白质分解代谢增强。游泳对不同蛋白质负荷水平大鼠的影响程度不同，１７％组大鼠更有利于抵御高强度游泳引起的蛋白质分解作用，并具有较强的运动耐力。     

利用INTERNET进行蛋白质结构的检索,图像显示和模型构建

越来越多的蛋白质结构数据库和软件资源可以通过ＩＮＴＥＲＮＥＴ的ＷＷＷ Ｍｏｓａｉｃ和Ｎｅｔｓｃａｐｅ程序存取。     

丙型肝炎病毒F蛋白结合蛋白1基因的克隆化与序列分析

目的 对命名为F蛋白结合蛋白1(FBP1)的未知基因,克隆其全长基因并进行生物信息学分析.方法 应用酵母双杂交技术得到FBP1,应用分子生物学技术克隆FBP1的基因编码序列.结果 经酶切和测序鉴定,结果完全正确,成功克隆了FBP1的基因编码序.结论 FBP1通过与F蛋白结合,在病毒蛋白与宿主细胞蛋白相互作用过程中发挥重要作用.     

核磁共振测定蛋白质构象

核磁共振(NMR)已成为与X射线晶体衍射相补充的研究蛋白质构象的方法,而且其应用日益深入。本文综述了NMR测定蛋白质构象的基本原理、主要步骤、现状及前景,并对NMR的应用和成就与晶体衍射法进行了简要的比较讨论。     

C反应蛋白真核表达载体的构建与表达

目的构建人C反应蛋白(CRP)真核表达载体,并观察其在NIH3T3细胞中的表达定位情况。方法利用带HA反向互补序列碱基的特异性引物,从p91023/CRP载体上将编码人CRP的基因序列亚克隆到真核表达载体pcDNA3上;对阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定,利用脂质体转染方法转染NIH3T3细胞;并使用Westernblot和细胞免疫化学技术对重组质粒pcDNA3/HA-CRP在NIH3T3细胞中的表达及其蛋白定位进行分析。结果PCR、双酶切和测序鉴定表明,pcDNA3/HA-CRP真核表达质粒构建正确;转染实验发现,该质粒能够在NIH3T3细胞中表达,表达产物主要定位在细胞膜和核周边内质网的区域。结论成功构建了带HA标签的人CRP真核表达载体,该载体能够在哺乳动物细胞NIH3T3中表达,为进一步研究CRP的细胞内生物学功能提供了一个重要的工具。     

贝氏考克斯体毒力与毒力相关蛋白芯片的研制

目的:构建贝氏考克斯体毒力与毒力相关蛋白芯片.方法:根据贝氏考克斯体全基因组序列,筛选出约160个编码毒力及毒力相关蛋白的基因,采用PCR扩增基因片段,将获得的基因片段与pET32a表达载体连接,然后将该重组质粒转化大肠杆菌并使目的基因表达,采用Ni-NTA亲和层析柱纯化表达的目的重组蛋白.将纯化的重组蛋白点在醛基化玻片上制备蛋白芯片.结果:由贝氏考克斯体104个重组蛋白构建毒力与毒力相关蛋白芯片,通过荧光扫描仪分析蛋白芯片与贝氏考克斯体感染的小鼠血清反应,发现10个重组蛋白与该血清反应为强阳性.结论:所制备的毒力与毒力相关蛋白芯片具有贝氏考克斯体特异性,可用于贝氏考克斯体感染患者血清的检测.     

蛋白质多肽药物聚乙二醇定点修饰的研究进展

聚乙二醇修饰可以很好地解决蛋白多肽药物难溶性、稳定性差、半衰期短、毒性大、免疫原性等问题,其中的聚乙二醇定点修饰方式更具优势.本文着重介绍聚乙二醇在蛋白多肽药物中的N端氨基、巯基、羧基和糖类残基及N端氧化后的定点修饰方式的研究进展.     

蛋白质芯片在功能蛋白组学研究中的应用

蛋白质芯片技术的应用使得对数以千计的蛋白质进行高通量、平行分析成为可能。蛋白质芯片是一种固定了保持天然活性的蛋白质微阵列，广义上，将能与蛋白质特异性结合的DNA和RNA、糖类、合成多肽，其他能够从复杂的混合物中特异性地捕获目的蛋白的小分子物质的微阵列也称为蛋白质芯片。蛋白质芯片可以检测感染性疾病、自身免疫性疾病及肿瘤等患者体内的疾病标志分子，还能研究蛋白质的功能、与其他蛋白质之间的相互作用、蛋白表达谱等蛋白质组学研究所涵盖的内容。本文将重点阐述蛋白质芯片在功能蛋白质组学研究中的应用进展。     

肿瘤多药耐药蛋白抑制剂

肿瘤细胞产生多药耐药性是肿瘤化疗失败的主要原因之一,肿瘤多药耐药性（ｍｕｌｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓａｎｃｅ,ＭＤＲ）的产生主要与肿瘤细胞的膜蛋白,Ｐ－糖蛋白（ＰＧ－１７０）多药耐药蛋白（ＭＲＰ－１９０）和肺耐药蛋白（ＬＲＰ）的过多表达有关。在发现维拉帕米,奎尼丁和环孢菌素等药物具有逆转ＭＤＲ作用的基础上,发展了一些新的能够逆转ＭＤＲ现象的多药耐药蛋白抑制剂,如环孢菌素的类似物ＳＤＺＰＳＣ８３３和奎民丁     

非经典分泌蛋白研究进展

在哺乳动物中,绝大多数细胞外蛋白的分泌是通过内质网/高尔基体依赖的分泌途径,也称作经典分泌途径来实现的.但是越来越多的细胞外蛋白被发现不依赖内质网/高尔基体分泌途径却可以分泌到细胞外.这些非经典分泌蛋白是生命过程中的重要分子,对分析和解决生物医学问题具有重要意义.