同种异体骨髓间充质干细胞穴位移植:急性心肌梗死后血管新生及相关细胞因子的变化

背景:骨髓间充质干细胞移植途径主要包括外周静脉注射移植、冠状动脉移植以及心肌内注射移植,但存在迁移缺少靶向性,价格高昂等局限性.目的:观察同种异体骨髓间充质干细胞穴位移植兔急性心肌梗死后梗死区血管新生及相关细胞因子的变化.方法:提取兔骨髓进行骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化、扩增、鉴定,并标记.将55只兔随机分为正常组与手术组.手术组急性心肌梗死后1周,再随机分为3组:穴位注射干细胞组、模型对照组、穴位注射生理盐水组.5周后,取心肌组织进行免疫组织化学BrdU染色、心肌特异性肌钙蛋白T免疫组织化学染色检测;免疫组织化学法检测梗死心肌组织血小板内皮细胞黏附因子1水平;免疫组织化学法,夹心酶联免疫法、RT-PCR法、Western-Blot法检测血管内皮细胞生长因子及免疫组织化学法榆测碱性成纤维细胞生长因子.结果与结论:穴位注射的骨髓间充质干细胞可迁移至梗死区,并可以在梗死区分化为心肌样细胞.与模型对照组及穴位注射生理盐水组比较,穴位注射骨髓间充质干细胞可使梗死区及周围组织血小板内皮细胞黏附因子1表达上调,诱导梗死区及周围组织血管新生,其机制是刺激心肌组织中碱性成纤维细胞生长因子表达上调.穴位注射骨髓间充质干细胞组梗死心肌组织中和血清中血管内皮细胞生长因子表达均无上调趋势,因此推测,血管新生由碱性成纤维细胞生长因子及未知因素诱导.     

同种异体骨髓间充质干细胞穴位移植对梗死心肌及周围区细胞凋亡及相关蛋白的影响

背景:骨髓间充质干细胞移植途径主要包括外周静脉注射移植、冠状动脉移植以及心肌内注射移植,但存在迁移缺少靶向性,价格高昂等局限性。目的:观察兔骨髓间充质干细胞穴位注射对梗死区心肌细胞凋亡及凋亡调控蛋白Fas,FasL,Bcl-2表达的影响。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-06/08在辽宁中医药大学针灸系电生理实验室完成。材料:抽取健康日本大耳白兔骨髓,分离培养骨髓间充质干细胞并传代;结扎日本大耳白兔左室支建立急性心肌梗死模型。干预:将造模成功的日本大耳白兔30只随机分为3组,模型对照组不干预;穴位注射干细胞组于急性心肌梗死形成后1周,取心俞(双侧)、至阳、膻中4穴,穴位注射干细胞混悬液,1×l06细胞/穴;穴位注射生理盐水组在相同部位穴位注射等量生理盐水。以10只未造模兔为正常对照组。主要观察指标:干预后第5周取心脏,TUNEL染色观察梗死区心肌细胞凋亡;免疫组化观察心肌Fas,FasL及Bcl-2蛋白的表达。结果:模型对照组和穴位注射生理盐水组梗死区心肌细胞凋亡高于正常对照组和穴位注射干细胞组(P<0.001,0.05)。穴位注射干细胞组Fas和FasL蛋白的表达明显低于模型对照组(P<0.001),模型对照组则高于正常对照组(P<0.05,0.001)。穴位注射干细胞组及正常对照组Bcl-2蛋白表达明显高于模型对照组和穴位注射生理盐水组(P<0.001)。结论:穴位移植骨髓间充质干细胞可使梗死及周围区心肌细胞凋亡数减少,其机制可能是通过Fas、FasL蛋白的减少、Bcl-2蛋白的增多来调节的。     

自体骨髓间充质干细胞心肌移植后的分化及存活

背景:骨髓间充质干细胞移植入急性心肌梗死组织后是否能迁移、分化及存活,目前尚不清楚.目的:观察兔骨髓间充质干细胞移植入急性心肌梗死组织后,在体内的迁移、分化及其存活.方法:分离培养兔骨髓间充质干细胞,体外DAPI标记细胞.结扎兔左前降支制作急性心肌梗死模型,造模成功后30只新西兰大耳兔抽签法分为骨髓间充质干细胞组和对照组,每组15只.骨髓间充质干细胞组于冠状动脉结扎后1 h在梗死周边区用微量注射器分4点注射自体骨髓间充质干细胞.对照组于相同部位注射等量生理盐水.每点注射体积30 μL.分别于移植后10 min,3 d,4周时各组各处死5只动物.取心脏行冰冻切片,荧光显微镜观察DAPI标记骨髓间充质干细胞的分布情况;免疫荧光法检测标记细胞是否表达心肌特异性肌钙蛋白Ⅰ和α-肌动蛋白.结果与结论:DAPI标记的骨髓间充质干细胞在兔急性心肌梗死模型心脏微环境中,蓝色细胞核分布广泛,呈椭圆形,似心肌细胞核,其排列方向与宿主心肌纤维方向一致,间接免疫荧光法检测胞浆心肌特异性蛋白肌钙蛋白Ⅰ、α-肌动蛋白均为阳性.说明缺血心肌内移植入骨髓间充质干细胞,可在局部微环境的刺激下向心肌细胞定向分化.     

骨髓间充质干细胞在心肌梗死犬心肌内分化及对心肌细胞凋亡的影响

背景：体内移植骨髓间充质干细胞对实验动物的心肌梗死和心力衰竭有较好的改善作用，但具体机制尚不清楚。目的：观察骨髓间充质干细胞在心肌梗死犬梗死区的分化以及对心肌细胞凋亡的影响。设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2005—03／2007—12在美国Texas Heart Institute干细胞研究室进行骨髓间充质干细胞移植，在第三军医大学完成免疫组织化学染色。材料：成年杂种犬，平均体质量25～35k。方法：采用密度梯度离心法提取犬骨髓间充质干细胞，移植前以BrdU标记骨髓间充质干细胞。采用外科手术于近端冠状动脉左前降支植入布洛芬缩肌装置并结扎相连分支的方法制作犬心肌梗死模型。造模后分为实验组与对照组，实验组于损伤缺血部位注射同种异体骨髓间充质干细胞。对照组注射等量生理盐水。主要观察指标：对移植BrdU标记的骨髓间充质干细胞的心肌梗死犬心肌梗死区组织细胞进行免疫组织化学染色，同时采用DeadEnd^TM Colorimetric TUNEL System对心梗标本进行凋亡细胞的染色观察。结果：注射骨髓间充质干细胞的心脏组织切片BrdU免疫组织化学染色可见大量细胞核呈现深褐色或黑色的阳性反应，在心脏组织的不同区域表现出不同的形态特征，其中大多数植入心肌细胞间的骨髓间充质干细胞，形态上与心肌细胞无异，而其他区域的骨髓间充质干细胞则与间质细胞较相似，无特定的形状。骨髓间充质干细胞移植组心肌梗死区凋亡的心肌细胞数少于未移植组。结论：骨髓间充质干细胞心肌内移植后可在心肌梗死区分化成心肌细胞，并减轻犬心肌梗死后的细胞凋亡。     

超声心动图评价骨髓细胞移植对兔梗死心肌局部收缩功能的影响和微血管新生效应

目的检测骨髓间质干细胞移植到梗死心肌后局部心肌运动特征和新生微血管的活体灌注状况。方法21只兔随机分成正常对照组、心肌梗死组和细胞移植组。结扎后2组兔冠状动脉左前降支,复制心肌梗死模型。梗死组心内注射培养基,移植组进行骨髓细胞移植。移植后4周检测抗Brdu、抗心肌特异性肌钙蛋白T(TroponinT)和抗因子染色结果,比较毛细血管密度。分别于结扎前、心肌梗死后和移植后运用组织多普勒技术测量3组兔左室前壁心肌运动速度。行心肌声学造影检查,观察局部心肌血流灌注状况。结果移植组心肌内可检测到大量Brdu阳性标记的细胞,抗TroponinT染色和抗因子染色阳性,毛细血管密度较梗死组显著增高。移植组左室前壁心肌Vs和VE较心梗组显著增高(P<0.05)。心肌梗死后左室前间壁造影剂充盈缺损,移植后该处心肌内可见少量造影剂回声,造影剂声学强度明显高于心肌梗死组(P<0.01)。结论骨髓间质干细胞移植可增强局部心肌收缩功能,改善心肌血流灌注。     

不同方法移植骨髓间充质干细胞在体内重要器官的分布及分化

背景:大量实验显示心肌损伤后,趋化或直接心肌内注射的骨髓干细胞可以在体内分化为心肌细胞、血管内皮细胞或血管平滑肌细胞.目的:观察不同方法移植的骨髓间充质干细胞体内重要器官的分布、生长和分化情况.方法:选用3月龄日本大耳白兔39只,均制作急性心肌梗死动物模型并随机分为4组,3个组为实验组分别以心肌内直接注射、经冠脉注射、经静脉注射3种不同移植经BrdU标记的自体骨髓间充质干细胞.对照组分为3个亚组,分别经冠脉、静脉和心肌内直接注射等量的生理盐水.4周后处死动物,取心、肺、肝、肾制作组织切片并观察BrdU阳性细胞和BrdU及α-横文肌肌动蛋白双阳性细胞.结果与结论:①骨髓间充质干细胞移植各实验组在梗死区及其周边均可见到BrdU阳性细胞和BrdU及α-横文肌肌动蛋白双阳性细胞.BrdU阳性细胞间及与宿主心肌细胞间有细胞突起相连,并可见明显的横纹和肌小节.②各实验组新生毛细血管密度较对照组都有增加(P < 0.05),其效果顺序由好到差依次为冠脉注射组、心肌注射组和静脉注射组.③经冠脉和静脉移植组非目的器官肺、肝、肾的标本切片内均发现BrdU阳性细胞表达,且静脉移植组肺内BrdU阳性细胞数多于肝、肾,但均未见有分化趋势和恶性细胞表达.结果提示骨髓间充质干细胞经3种方法移植均能使心肌梗死区及其周边区心肌细胞和毛细血管再生,除心肌注射组外非目的器官都有BrdU阳性细胞表达,但仍以目的器官表达为主.     

骨髓间充质干细胞移植对心肌梗死后正常心肌细胞凋亡的影响

背景:目前的研究显示,骨髓间充质干细胞移植在治疗缺血性心血管疾病中起到了重要的作用,但干细胞移植后改善缺血心肌功能的详细机制尚不明确.目的:观察骨髓间充质干细胞移植对急性心肌梗死后大鼠正常心肌细胞凋亡的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2008-02/08在福建省高血压研究所完成.材料:密度梯度离心法和贴壁筛选法获得SD大鼠骨髓间充质干细胞.2周龄雄性清洁级SD大鼠16只,体质量200～250g,用于制备心肌梗死模型.方法;16只SD大鼠随机区组法分为2组,对照组:结扎冠状动脉前降支,未进行干细胞移植,只在梗死心肌周围注入等量(200 μL)的生理盐水;实验组:在心肌梗死1 h后,向梗死心肌的周围分4点(200 μL)注入同种异体骨髓间充质干细胞1×1011L-1;每组8只.于移植4周后处死动物,取梗死边缘正常心肌组织,TUNEL法检测心肌细胞凋亡形态,并计算心肌细胞凋亡率.主要观察指标:①凋亡心肌细胞的形态变化.②实验组和对照组心肌细胞的凋亡率.结果:①造模后4周,TUNEL检测显示捌亡的心肌细胞核呈深浅不一的深褐色.细胞轮廓清楚,而正常增殖的心肌细胞不被染色.②经显微镜结合计算机显微图像分析系统检测对照组、实验组心肌细胞凋亡率分别是(1.12±0.06)%,(0.81±0.02)%,两者相比差异有显著性意义(P＜0.05).结论:骨髓间充质干细胞移植在一定程度上可以抑制急性心肌梗死后正常心肌细胞凋亡的发生.     

糖尿病与正常大鼠骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死的比较

背景：目前国内外在干细胞移植治疗心肌梗死的研究中,大多采用正常或者年轻的骨髓间充质干细胞作为移植细胞来源。目的：比较糖尿病和正常大鼠骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死的疗效差别。方法：无菌条件下获取正常大鼠及糖尿病大鼠的骨髓间充质干细胞,建立大鼠心肌梗死模型并随机分为3组,分别于心肌梗死病灶区注射100μL 含有105-106个 F2代正常大鼠或糖尿病大鼠来源骨髓间充质干细胞的细胞混悬液,空白对照组注射100μL 含体积分数20%胎牛血清的 DMEM。移植后1个月行苏木精-伊红染色检测各组梗死区域心肌组织形态的变化;通过免疫组化方法检测 Bcl-2的表达。结果与结论：通过对细胞形态观察及流式细胞术鉴定,大鼠股骨骨髓贴壁培养可获取纯度较高的骨髓间充质干细胞,绘制细胞生长曲线结果显示正常大鼠骨髓间充质干细胞较糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞生长快。移植后1个月,正常大鼠干细胞移植组梗死区域心肌组织形态较糖尿病大鼠干细胞移植组及空白对照组明显改善,梗死区域心肌组织 Bcl-2的表达也高于其他2组。证实正常大鼠来源骨髓间充质干细胞较糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞生长明显加快,且糖尿病使骨髓干细胞移植治疗心肌梗死的疗效降低。     

腺病毒介导血管内皮生长因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞移植梗死心肌的血管再生

背景：骨髓间充质干细胞的存活率与良好的血液供应关系密切，在移植早期其自身所分泌产生的促血管生长因子不足以刺激血管新生而容易导致移植的细胞死亡。目的：观察骨髓间充质干细胞移植联合血管内皮生长因子基因转染对大鼠梗死心肌组织修复重建、血管再生的影响。设计、时间及地点：随机分组设计的细胞基因工程实验，于2006-01／2007-12在中山大学第二附属医院医学研究中心完成。材料：选取具有相同遗传背景的雄性SD大鼠40只建立急性心肌梗死模型，6~8周龄．体质量250～300g。方法：体外分离、培养、纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞，以BrdU标记骨髓间充质干细胞。腺病毒介导血管内皮生长因子基因转染骨髓间充质干细胞。将造模后大鼠随机分为4组．每组10只：基因转染骨髓间充质干细胞组，梗死心肌内注射体外转染腺病毒介导血管内皮生长因子的骨髓间充质干细胞；骨髓间充质干细胞组，梗死心肌内注射骨髓间充质干细胞；基因转染组，注射腺病毒介导的血管内皮生长因子；对照组，注射无血清IMDN培养液。主要观察指标：移植4周后观察移植细胞分化和新生血管的形成，并通过超声多普勒检测心功能变化。结果：细胞移植4周后，基因转染骨髓间充质干细胞组、骨髓间充质干细胞组移植区移植细胞表现为心肌肌钙蛋白T染色阳性，细胞呈肌样细胞形态，并且两组心功能都较移植前有明显改善，基因转染骨髓间充质干细胞组改善程度优于骨髓间充质干细胞组。部分BrdU染色阳性的细胞可以分化成为内皮细胞，参与构成了梗死区域新生毛细血管，相对于单纯细胞移植与细胞因子移植，细胞移植结合血管内皮生长因子基因转染促进毛细血管新生更明显。结论：骨髓间充质干细胞移植联合血管内皮生长因子基因转染可以通过促进心肌再生和新生血管的形成来重建缺血心肌，明显改善心功能。     

同种异体骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死的实验研究

目的 观察同种异体骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)移植对急性心肌梗死(acute myocardial infarefion AMI)后心肌修复和心功能的影响.方法 结扎大鼠的左冠状动脉前降支制做急性心肌梗死模型,共90只大白鼠随机分为相同数量的细胞移植组和对照组,细胞移植组45只分别为:注射后2周组、4周组及12周组,对照组再次分组同细胞移植组.细胞移植组大白鼠以前壁部分心肌颜色变暗,心电图前壁ST段抬高为制模成功.用离心的方法分离出大鼠的股骨骨髓,淋巴细胞分离液分离单个核细胞,经冲洗后,培养、传代,得到第三代骨髓间充质干细胞,用4,6二乙酰基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole DAPI)标记.一周后将动物模型再次开胸,把干细胞悬液以点注射的方式局部注射入梗死灶的周边区,对照组注射培养基.术前、移植后2周、移植后4周及移植后12周行超声检测心功能,HE常规染色观察心肌切片,免疫荧光检查干细胞向心肌细胞的分化.数据用SPSS 10.0统计软件统计分析(成组t检验和γ2检验).以P<0.05表示差异具有统计学意义.结果 标记的骨髓干细胞在梗死心肌内存留并且分化为心肌样细胞.MSCs移植后12周超声检查发现左窒内径为(0.58±0.09)mm(P<0.05),梗死区心肌厚度为(0.25±0.01)mm(P<0.05),射血分数为(67.52±0.61)(P<0.05),左室短轴缩短率为(39.86±3.00)(P<0.05).细胞移植组梗死区心肌组织标本中均可见DAPI标记的蓝色荧光供体细胞核,心肌细胞胞浆呈绿色荧光.HE常规染色显示细胞移植组瘢痕组织较少,出现核浆比例较大、类似胎心或新生心窒细胞的细胞.结论 同种异体骨髓间充质干细胞移植可修复梗死心肌并改善梗死后心脏功能.