酶免疫法检测丙型肝炎病毒RNA的聚合酶链反应产物

建立一灵敏，快速的检测丙型肝炎病毒逆转录－套式聚合酶链反应产物的酶免疫法。方法，对第２次ＰＣＲ所用的引物进行双标记，使扩增产物同时被修饰有生物一不和荧光素成分，再经过固相的链亲合素进行捕获，辣根过氧化酶记的抗－ｆｌｕｏｒｅｓ－ｃｅｉｎ反应后显色测定     

荧光信号引物PCR定量测定血清HCV—RNA的实验室评价

目的对Ａｍｐｌｉｓｅｎｓｏｒ荧光标记ＨＣＶ定量ＰＣＲ方法进行实验室考核。方法２８例抗ＨＣＶ（＋）、定性ＰＣＲ（＋）的血清标本，用于重复性测定；２０例健康人血清用于正常值测定；５例定性ＰＣＲ（＋）和５例定性ＰＣＲ（－）标本用于Ａｍｐｌｉｓｅｍｓｏｒ和ｂｒａｎｃｈ－ＤＮＡ两种方法的比较。结果孔间变异系数（ＣＶ）为 ２０．６％，操作者间ＣＶ为 ４３．８％，批内 ＣＶ为 ６１．９％，批间ＣＶ为８５．１％。２０例健康人血清测定值均小于最小检测浓度，即１０２拷贝／ｍｌ。用Ａｍｐｌｉｓｅｎｓｏｒ和ｂｒａｎｃｈ－ＤＮＡ两种方法对５ 例定性ＰＣＲ（－）标本测定，Ａｍｐｌｉｓｅｎｓｏｒ和ｂｒａｎｃｈ－ＤＮＡ均为阴性；对５ Ｎ定性ＰＣＲ（＋）标本测定，Ａｍｐｌｉｓｅｎｓｏｒ均为阳性，ＨＣＶ－ＲＮＡ的浓度为 ２． ５ × １０５拷贝 ／ｍｌ～ １． ７ ×１０６拷贝 ／ｍｌ， ｂｒａｎｃｈ－ＤＮＡ方法有 ２例未能检出。结论 Ａｍｐｌｉｓｅｎｓｏｒ ＨＣＶ定量 ＰＣＲ方法特异性和灵敏度均好，可用于临床疾病的研究和抗病毒药物疗效的评估。由于批内、批间变异系数较大，试验与操作均应严格规范。     

逆转录－套式PCR检测血清中丙肝病毒RNA

利用与丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）基因组５＇非编码区保守序列同源的套式引物，建立了检测血清中ＨＣＶＲＮＡ的聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，由于在引物设计中选择了最保守的区域且避开了与黄病毒属的同源序列，保证了ＰＣＲ检测的灵敏度和特异性。经逆转录和两轮ＰＣＲ扩增，可检出１×１０－３ｕｌ血清中的ＨＣＶＲＮＡ。研究了影响ＨＣＶＲＮＡＰＣＲ检测的各种因素，并对ＲＮＡ分离及ＲＴ－ＰＣＲ反应体系进行了优化，在此基础上研制了ＨＣＶ的ＰＣＲ检测试剂盒。     

荧光定量PCR与RT-PCR技术检测HCV-RNA的比较观察

目的 比较荧光定量ＰＣＲ与ＲＴ－ＰＣＲ（定性）检测不同检材中的ＨＣＶ－ＲＮＡ,评价荧光定量ＰＣＲ技术测定ＨＣＶ－ＲＮＡ水平的价值。方法 采用荧光定量ＰＣＲ及ＲＴ－ＰＣＲ（定性）技术同时检测了７１例血液透析患者的血清,血浆,淋巴细胞、尿液标本中ＨＣＶ－ＲＮＡ。结果 血清、淋巴细胞,尿液标本中ＨＣＶ－ＲＮＡ的荧光定量ＰＣＲ检出率（４６．３８％,８０．００％）,分别高于相应标本中ＨＣＶ－ＲＮＡ的ＲＴ－Ｐ     

特异核酸捕获RT-PCR技术建立及在HCV RNA检测中的应用

目的 解决ＲＴ－ＰＣＲ检测ＨＣＶＲＮＡ方法的重复性较差问题,使其成为常规实验室检测方法。方法 采用亲合素生物素系统将ＨＣＶ特异的核酸片段包被在微孔板上,利用特异核酸捕获样本中的ＨＣＶＲＮＡ然后进行逆转录和ＰＣＲ扩增,从而建立了特异核酸捕获ＲＴ－ＰＣＲ检测ＨＣＶＲＮＡ方法,并与酶消化法和抽提法进行比较,评价其敏感性、特异性、重复怀及抗污染能力。结果 特异性核酸获ＲＴ－ＰＣＲ获得的电要带较为清晰,其特     

TthDNA聚合酶在丙型肝炎病毒RNA检测中的应用

用ＴｔｈＤＮＡ聚合酶行逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增丙型肝炎病毒（ＨＶＣ）５′端非编码序列，对２６２例肝炎患者血清进行ＨＣＶＲＮＡ测定，结果ＨＣＶＲＮＡ阳性者５３例，阳性率２０．２％，凡阳性者用酶联免疫吸附法测其抗ＨＣＶＩｇＧ，其中３０例测到抗ＨＣＶ，阳性重叠率５６％（３０／５３）；ＨＣＶ ＲＮＡ阳性中的１５例同时用成髓细胞瘤病毒酶行传统逆转录－套式聚合酶链反应检测对照，１４例阳性，符合率     

HCV感染基因型病毒复制程度与肝病关系的研究

采用限制性内切酶Ｓａｕ３Ａｌ和ＨａｅⅢ对５４例ＲＴ－ＰＣＲ法ＨＣＶＲＮＡ阳性的５＇ＮＣ区扩增产物进行酶切分型；ＰＣＲ滴定法半定量分析ＨＣＶＲＮＡ含量。结果显示４种酶切类型：ＨＣＶⅠ型感染３．７％（２／５４），ＨＣＶⅡ型感染７７．８％（４２／５４），ＨＣＶⅢ、Ⅳ型感染１１．１％（６／５４），ＨＣＶⅠ、Ⅱ／Ⅲ、Ⅳ型混合感染７．４％（４／５４），ＨＣＶⅡ型感染阳性率在ＡＨ、ＣＡＨ、ＬＣ三组间无显著差异（     

逆转录套式ＰＣＲ检测丙型肝炎病毒感染者ＨＣＶ ＲＮＡ

目的　探讨人血清和外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）中丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＲＮＡ与血清ＩｇＧ和ＩｇＭ抗体联合检测对丙型肝炎的诊断价值。方法对以ＥＬＩＳＡ方法检测所得的４６例ＨＣＶ—ＩｇＧ阳性的标本用逆转录套式聚合酶锭反应（ＲＴ—ＮｅｓｔｅｄＰＣＲ）检测血清和ＰＢＭＣ中ＨＣＶＲＮＡ，同时用ＥＬＩＳＡ方法检测血清中ＨＣＶ—ＩｇＭ。结果血清中有１７例ＨＣＶ　ＲＮＡ阳性和６例ＨＣＶ—ＩｇＭ阳性，而ＰＢＭＣ中有１９例ＨＣＶＲＮＡ阳性。结论血清中ＨＣＶ—ＩｇＭ可作为丙型肝炎的初筛诊断，ＨＣＶ—ＩｇＭ可作为ＨＣＶ近期感染的指标，但二者均不能准确反映病毒在体内的存在情况，而套式ＰＣＲ方法检测ＨＣＶＲＮＡ可直接反映ＨＣＶ在体内的活动情况，其中ＰＢＭＣ中检测ＨＣＶＲＮＡ的阳性率高于血清，提示ＨＣＶ可能在ＰＢＭＣ中潜伏乃至复制。     

核酸扩增产物的量化酶免疫通用型检测方法

目的以丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＲＮＡ（ＲＮＡ）核酸扩增产物的量化酶免疫（ＥＩＡ）通用型检测方法及试剂,以准确评价疗效,指导治疗。方法选择合适的扩增循环数使聚合酶链反应（ＰＣＲ）在“平台期效应”出现前即停止;同时将第２次ＰＣＲ所用的引物进行生物素标记,使扩增产物带有生物素标记成分,再通过固相包被的链霉亲合素进行捕获、氢氧化钠解链变性、荧光素标记的ＨＣＶ特异性探针杂交以及辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记的抗荧光素酶标抗体反应后,ＴＭＢ显色测定,通过显色反应颜色的深浅,反映样品中ＨＣＶＲＮＡ模板的情况。结果ＨＣＶＲＮＡ扩增产物的ＥＩＡ检测结果表明：所建立的方法操作简便、重复性好、特异性强、敏感度高、结果判断客观准确,而且可以反映样品中病原体核酸模板量的多少;干扰素治疗期间,ＨＣＶ感染的慢性丙型肝炎患者不同时间系列血的动态检测结果提示,在临床监测治疗、评价疗效上,本方法具有较大的指导意义。结论所建立的方法可以成为一种通用型检测技术,用于量化分析病毒、细菌等致病因子及人类某些基因（如ＨＬＡＢ２７）的核酸扩增产物的研究,具有广阔的应用前景。     

逆转录套式聚合酶链反应检测庚型肝炎病毒

目的建立敏感、特异的逆转录套式聚合酶链反应（ＲＴ－ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ）方法，以检测中国人庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）感染。方法根据中国人感染ＨＧＶ者ＮＳ５区部分核苷酸序列分析结果，设计套式ＰＣＲ引物，用于ＨＧＶＲＮＡ的检测，并与用国外报道引物所作的一次ＰＣＲ和套式ＰＣＲ检测结果进行比较。结果共检测标本１３３份。以国外报道引物作一次ＰＣＲ和套式ＰＣＲ检出率分别为８．３％和１１．３％，作者建立的套式ＰＣＲ检出率为１８．０％，对部分ＰＣＲ产物进行序列分析证实为ＨＧＶ特异性基因。结论建立的方法可在中国人群中显著提高ＨＧＶＲＮＡ检出率。     

应用NASBA技术对献血者血浆/血清进行HCVRNA检测

目的　探讨对献血者混合血浆标本检测HCVRNA的必要性和可行性。方法　每 5 0份血浆混合为一组 ,用NucliSensExtractor提取核酸 ,以NASBA技术扩增HCVRNA和用ECL检测扩增产物。标本贮存 ,核酸提取、扩增、检测过程设立系统对照和阳性对照。结果　在抗 HCVELISA阴性的献血者 10 0 0 0人中发现 2例HCVRNA阳性。结论　用NASBA技术对混合血浆进行HCVRNA检测可有效控制输血后丙型肝炎的发生。     

丙型肝炎病毒核酸扩增及微流芯片检测方法的建立

目的建立稳定、可靠的核酸扩增和微流芯片分析法,用于血液中丙型肝炎病毒的检测。方法分别选取经2种酶联免疫吸附试验验证的丙型肝炎阴性（60份）和阳性（200份）血液标本;提取核酸后采用巢式PCR法进行扩增,最后用微流芯片法分析扩增产物。结果经过核酸扩增的丙型肝炎阳性血液经分析后皆出现预期大小片段的特异性条带,而阴性血液缺少相应的条带。结论本次建立的特异性巢式PCR扩增和微流芯片法检测结果可靠,可用于血液筛查。     

一种竞争性RT-PCR测定HCV RNA方法的建立及其应用

目的　建立检测丙型肝炎病人血清HCVRNA水平的竞争性逆转录 聚合酶链式反应定量方法。方法　采用含HCV 5 非编码区 ( 5 NCR)缺失突变的重组质粒 5T1d ,将其目的基因亚克隆到体外转录载体pCDNAⅠ多克隆位点上 ,获得转录重组体 5T1d 。将其线性化后用SP6RNA聚合酶体外转录竞争性缺失突变模板RNA ,该模板定量后与血清HCVRNA一起作逆转录 聚合酶链式反应 (RT PCR) ,建立检测血清HCVRNA水平的竞争性定量方法。结果　检测 15例丙肝病人 2 0份血清 ,滴度为 6.6× 10 2 ～ 6.6× 10 6copies/ml。 结论　各类丙型肝炎患者血清病毒滴度均较高 ,经干扰素治疗后病毒水平下降 1～ 5个Log ,年龄小于 2 0岁者干扰素治疗效果较好。     

纳米金比色芯片同步目视化检测HBV和HCV

目的 建立一种简单、快速的比色芯片可同时目视化检测HBVDNA和HCVRNA。方法 利用多重PCR方法扩增HBsAg阳性合并抗HCV阳性的患者血清中提取的HBVDNA和HCVcDNA。制备Au纳米颗粒基因探针，检测探针与固定在尼龙膜上的捕捉探针构成双探针，用斑点杂交法检测HBVDNA、HCVcDNA的多重PCR产物，加入银离子（Ag^＋）-对苯二酚液染色观察结果。结果 多重PCR可同时扩增HBVDNA和HCVcDNA，出现预期的431bp和323bp特异性条带。纳米金比色芯片可以同步目视化检出乙型、丙型肝炎合并感染患者血清中HBVDNA和HCVRNA的PCR产物。结论 目视化HBV、HCV纳米金比色芯片诊断方法操作简单、特异性好、成本低廉、结果 判定指标客观，此类基因芯片在病毒基因检测领域将会有广泛用途。     

两种荧光定量法检测HCV RNA结果的比较

目的建立双探针荧光定量HCV RNA检测方法，分析其定量检测HCV RNA的灵敏度和特异性以及HCV RNA含量与患者病情的相关性。方法选取100例抗HCV抗体阳性患者，包括慢性肝炎患者45例、肝硬化患者30例、肝癌患者25例的样本，用双探针荧光定量法和两种商品荧光定量试剂方法进行HCV RNA检测，另观察近期196例抗HCV抗体阳性和48例抗HCV抗体阴性样本荧光定量PCR HCV RNA含量与肝功能的相关关系。结果荧光定量双探针法阳性率为93％（93／100）；两种商品荧光定量试剂方法阳性率分别为84％（84／100）和79％（79／100），经卡方检验差异有统计学意义（P〈0．05）。196例中抗HCV与HCV RNA阳性一致率为57．1％（116／196），其中伴肝功能改变49．0％（96／196）。HCV RNA含量与AST和ALT异常程度无显著相关性（P〉0．05），相关系数分别为0．4293及0．3899。HCV RNA高拷贝数患者肝功能异常率为85．2％（69／81），低拷贝数者肝功能异常率为40．9％（47／115），经卡方检验，X^2=38．63，差异有统计学意义（P〈0．001）。结论双探针荧光定量提高了HCV RNA检测的灵敏度和特异性，HCV RNA含量与患者肝功能损伤程度无明显相关性。     

Screening of blood donors for hepatitis C virus RNA with the MagNA Pure-COBAS AmpliScreen method

BACKGROUND: This report describes the validation results and the performance characteristics of a new, semiautomated minipool nucleic acid amplification method for testing of blood products to reduce the transmission of hepatitis C virus (HCV) by transfusions. STUDY DESIGN AND METHODS: Minipools of 96 donations were prepared with the Tecan Genesis pipettors. Nucleic acids were isolated from plasma samples with the MagNA Pure LC instrument (Roche Diagnostics GmbH) and amplified and detected with the COBAS AmpliScreen second-generation HCV assay (Roche Molecular Systems, Inc.). Sensitivity of the method was determined with the WHO International Standard for HCV RNA (NIBSC 96/790) as a reference. The risk of cross-contamination during the nucleic acid extraction and postelution steps was studied with a highly viremic sample. RESULTS: Detection limit of the assay (95% hit rate) was calculated to be 11.7 IU per mL. Altogether 2,423 minipools (232,600 donations) were screened with the following performance characteristics: initially false-reactive results (0%), failure of run control detection (0.45%), and failure of internal control detection (0.90%). Two cross-contamination cases caused by a highly viremic sample were found during the validation phase but not in the routine screening period, although nine HCV RNA-positive minipool samples were observed. CONCLUSION: This combination of HCV RNA screening methods showed the detection limit that is well below the sensitivity requirements of the regulatory bodies. Robustness of the validated HCV RNA screening method has proved to be acceptable for routine screening of blood donors on a large scale.