季节性流感疫苗免疫血清与H7N9禽流感病毒交叉反应

目的分析接种季节性流感疫苗人群是否具有对新发H7N9流感病毒具有交叉保护,并反向检测了雪貂产生H7N9抗血清与H1/H3/H5不同亚型流感病毒的免疫反应。方法利用血凝抑制试验和微量中和实验检测疫苗免疫后人群转阳血清对A/Anhui/1(H7N9)病毒中和作用及雪貂H7N9抗血清与A/California/07/2009(H1N1)、A/PR/8/34(H1N1)、A/Brisbane/59/2007(H1N1)、A/Brisbane/10/2007(H3N2)、A/Shenzhen/406H/2006(H5N1)和A/Vietnam/1203/2004(H5N1)等不同亚型病毒的中和作用。结果季节性流感疫苗受众者转阳血清与H7N9病毒反应HI及中和抗体反应均为阴性,雪貂H7N9抗血清与H1/H3/H5不同亚型流感病毒反应HI及中和抗体反应均为阴性。结论季节性流感疫苗接种人群不具有对新发H7N9流感病毒交叉保护,并且反向验证了H7N9病毒抗血清与H1/H3/H5亚型流感病毒亦无交叉免疫反应。     

季节性流感疫苗免疫血清与H7N9禽流感病毒交叉反应研究

目的分析接种季节性流感疫苗人群是否具有对新发H7N9流感病毒具有交叉保护,并反向检测了雪貂产生H7N9抗血清与H1／H3／H5不同亚型流感病毒的免疫反应。方法利用血凝抑制试验和微量中和实验检测疫苗免疫后人群转阳血清对A／Anhui／1（H7N9）病毒中和作用及雪貂H7N9抗血清与A／California／07／2009（H1N1）、A／PR／8／34（H1N1）、A／Brisbane／59／2007（H1N1）、A／Brisbane／10／2007（H3N2）、A／Shenzhen／406H／2006（H5NI）和A／Vietnam／1203／2004（H5N1）等不同亚型病毒的中和作用。结果季节性流感疫苗受众者转阳血清与H7N9病毒反应HI及中和抗体反应均为阴性,雪貂H7N9抗血清与H1／H3／H5不同亚型流感病毒反应HI及中和抗体反应均为阴性。结论季节性流感疫苗接种人群不具有对新发H7N9流感病毒交叉保护,并且反向验证了H7N9病毒抗血清与H1／H3／H5亚型流感病毒亦无交叉免疫反应。     

用SPF莱亨鸡制备抗甲型流感病毒血清

目的：制备甲型流感病毒的抗血清作为流感病毒亚型鉴定之用。方法：用两株H11亚型流感病毒分别免疫成年、健康的SPF莱亨鸡，刺激其产生抗体。通过血凝抑制实验检测抗血清的抗体滴度。结果：所有免疫SPF莱亨鸡都产生了抗H11亚型流感病毒的抗体，且血清抗体滴度差异较大。结论：本实验所用方法简便，制备的抗体特异性强，产生的抗体可用于甲型流感病毒亚型鉴定。     

深圳市不同人群和鸡群感染禽流感病毒H9N2亚型状况研究

目的分析禽流感病毒H9N2亚型毒株在深圳市不同人群和鸡群中的感染状况。方法采用常规的鸡胚双腔法分离流感病毒；采用红细胞凝集抑制试验（H1）和中和试验测定流感病毒抗体。结果从深圳市农贸市场300只鸡只样本中分离到27株H9N2亚型流感病毒，其抗体阳性率为7％，但未能从人群中分离到H9N2亚型流感病毒。人群血清中其抗体阳性率与职业高度相关，与鸡只密切接触的人群明显高于非密切接触的人群。结论禽流感病毒H9N2亚型对人群和鸡群均易感，可通过近距离的密切接触传播；推测人所感染的H9N2可能主要来源于鸡只等家禽。     

猪细小病毒单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备猪细小病毒(PPV)杂交瘤细胞株,并对其分泌的PPV单克隆抗体进行鉴定。方法按常规方法制备并获得2株杂交瘤细胞。用染色体分析对杂交瘤细胞进行鉴定,用间接ELISA、免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)和间接免疫荧光试验(IFA)对其分泌的单克隆抗体进行效价测定、亚型鉴定和特异性鉴定。结果得到2株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株2H9、1F9,染色体数目介于90～110之间。细胞上清效价均达1∶1×104,腹水效价均达1∶1×107,其亚型分别为IgG1、IgM,均为kappa链。2H9、1F9单抗与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒I型(PCV-1)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV-2)、乙脑病毒(JEV)等均无交叉反应。IPMA和IFA检测结果显示2H9、1F9单抗均能与接种于PK-15细胞的PPV发生特异性反应。结论成功制备了2株抗PPV杂交瘤细胞株,证实其产生的单克隆抗体具有良好的特异性和敏感性。     

奥司他韦在树鼩体内的药动及药效学应用研究

目的探讨奥司他韦在树鼩体内的药代动力学参数特征,以及在树鼩体内的抗流感病毒药效作用。方法树鼩经口服磷酸奥司他韦后取血浆用于药代动力学分析,并与人、雪貂、小鼠、大鼠的药代动力学参数比较;树鼩经鼻接种感染人流感病毒A/California/04/2009 H1N1和禽流感病毒H9N2突变株Y280-PB2-E627K,给予奥司他韦治疗,观察鼻腔症状,收集感染后第1,3和5天鼻灌洗液及沉淀分别行病毒TCID50检测和细胞分类计数,检测感染后21 d血清中和抗体滴度。结果奥司他韦在树鼩体内的药代动力学参数为:Cmax:1. 34μg/m L,Tmax:0. 75h,T1/2:2. 03 h,AUC0-12:1. 76 mg·h/liter。奥司他韦对感染A/California/04/2009 H1N1病毒的树鼩鼻腔排毒抑制作用不明显,但高剂量组奥司他韦可明显抑制感染H9N2 Y280-PB2-E627K病毒树鼩第1天的鼻腔排毒,减少第3天鼻灌洗液中细胞总数。感染A/California/04/2009 H1N1病毒后产生的抗体效价明显高于H9N2 Y280-PB2-E627K禽流感病毒的抗体效价,奥司他韦抗病毒治疗对感染同一病毒各组间血清抗体效价无影响。结论奥司他韦在树鼩体内的药代动力学参数不同于人或雪貂等模型动物,但其药物血浆清除半衰期和达峰时间与小鼠相近;药效学方面奥司他韦可有效抑制感染H9N2 Y280-PB2-E627K流感病毒树鼩的鼻腔病毒排毒和炎症反应。     

抗H5N1亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的制备及鉴定

目的建立稳定分泌抗H5N1亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞系,为进一步研究禽流感诊断技术奠定基础。方法以纯化的H5亚型禽流感病毒按常规方法免疫BALBc小鼠,最后一次免疫后第3天取其脾细胞与SP20细胞在聚乙二醇作用下融合,用选择性培养、有限稀释法克隆和血凝抑制试验进行筛选,对获得阳性克隆株用ELISA方法进行亚型鉴定,并用37株H5、H7、H9亚型AIV测定其特异性、覆盖性。结果最后获得了3株分泌特异性抗体的杂交瘤细胞,命名为1E5、4A4、4B1,经长期体外培养和冻存后复苏能稳定地分泌抗体。经鉴定,其亚型均为IgG1、kappa链。腹水HI效价1∶210～1∶216,细胞培养上清HI效价1∶26～1∶28。3株杂交瘤所分泌的单克隆抗体均能与本中心保存的全部20株H5亚型禽流感病毒分离株发生反应,而与15株H9亚型禽流感病毒分离株、2株H7亚型禽流感病毒分离株以及H1H4、H6H15亚型禽流感病毒标准毒株均不反应,与鸡新城疫病毒、鹅新城疫病毒、鹅腺病毒和鸡产蛋下降综合征病毒等均无交叉反应。结论所获3株单克隆抗体可用于禽流感病毒特异性诊断试剂的研制。     

广西医科大学2007年新生H3N2亚型流感病毒抗体调查

目的：调查广西医科大学2007年新生H3N2亚型流感病毒抗体,了解健康青年人群血清中H3N2亚型流感病毒抗体的水平,从而预测广西H3N2流感病毒引起的流感流行的趋势。方法：抽取广西医科大学2007年新生血清168份,通过血凝抑制实验进行抗体检测。结果：以血凝抑制抗体滴度≥1：10为H3N2亚型流感病毒抗体阳性,H3N2亚型流感病毒抗体阳性率为26．19％,抗体滴度≥1：40的占阳性的22．73％。结论：H3N2亚型流感病毒引起的流感在广西有流行,但流行强度不高,抗体滴度水平对人群的保护能力较低。     

H7N9病毒诱导宿主HA抗体产生的特异性及交叉反应

目的揭示人感染H7N9宿主血清HA抗体的产生及与其他HA亚型的交叉反应特性。方法生物公司合成各亚型HA蛋白胞外域核苷酸序列,并克隆到改造过的p CDNA3.1载体上构建表达质粒。采用哺乳动物细胞表达体系表达C端带标签的H1、H3、H5和H7重组HA蛋白。用抗标签的抗体捕获293T细胞转染上清中的HA蛋白。用建立的ELISA法检测22例H7N9感染者血清抗体与蛋白H1、H3、H5、H7(2013)和H7(2017)的结合反应,同时设H1N1感染组及健康对照组。结果成功构建H1、H3、H5和H7重组HA蛋白表达质粒,表达蛋白大小约72 000~100 000Mr。在检测的22例34份H7N9感染血清,对2013年及2017年分离的H7N9病毒株的HA蛋白均有显著结合[OD值=(1.85±0.27)、(1.54±0.27)],与健康对照组及H1N1组比较,差异均有统计学意义(P0.05)。同时H7N9血清组与组1的H1、H5有交叉反应,OD值分别为(1.53±0.49)和(0.92±0.53),与健康对照组比较差异有统计学意义(P0.05),与组2的H3有交叉反应[OD值=(2.09±0.22)],与健康对照组比较差异有统计学意义(P0.05)。而健康对照组与H1、H3有一定的结合反应,与H5、H7几乎不结合。结论人感染H7N9病毒诱导的宿主血清HA抗体不仅与H7N9结合且与其他亚型HA蛋白有高度交叉反应,为广谱中和抗体的筛选及疫苗的研发提供了依据。     

流感病毒样颗粒疫苗研究进展

 疫苗接种是预防各种类型流行性感冒的理想方式,但流感病毒血清亚型多,变异性强,给流感疫苗的研发带来一定的挑战。病毒样颗粒(VLP) 是含有某种病毒一个或多个结构蛋白的空心颗粒,形态结构上类似完整病毒,具有与完整病毒相似的免疫原性,并通过激活抗原提呈细胞,诱导免疫应答。VLP不含有病毒核酸,不能自主复制,因此无致病性,在疫苗研发中具有广泛的应用前景。现已有H1N1、H3N2、H5N1、H7N1、H5N3及H9N2型流感VLP合成的报道,动物实验证明这些VLP可诱导产生保护性免疫应答?数种二价(多价)混合流感VLP也被合成并证实在不同亚型流感病毒间具有交叉保护作用。佐剂的使用能够增强流感VLP疫苗的免疫原性。目前的研究表明流感VLP疫苗具有高免疫效价、能有效诱导交叉免疫应答和安全性高等特点,但现有研究大多是动物实验和临床前实验。流感VLP疫苗的安全性、效价及免疫途径等方面还有待进一步的研究及临床实验的验证。本文就近年来流感病毒样颗粒疫苗的研究进展,从流感VLP的合成和释放、免疫机制、已合成的流感VLP、佐剂的使用等方面进行综述。     

季节性流感疫苗对小鼠感染H7N9禽流感病毒的保护效力

目的 评价季节性流感裂解疫苗对流感病毒H7N9的免疫保护效力。方法 用我国2012～2013年度季节性流感裂解疫苗,以腹腔注射方式免疫BALB/c小鼠,并设PBS免疫模型组,末次免疫14 d后以5 LD₅₀ A/Anhui/1（H7N9）进行攻试验。感染后观察记录小鼠临床表现,体重变化,并分别于第2天和第4天每组处死3只小鼠,取肺组织和鼻甲骨测病毒滴度和载量。结果 感染后疫苗与模型组小鼠体重下降明显,疫苗组存活率为10%,模型组全部死亡。感染后第4天疫苗组鼻甲骨滴度显著低于模型组。血凝抑制试验及中和实验表明免疫小鼠血清无中和H7N9病毒抗体。结论 季节性流感疫苗在小鼠中对于H7N9流感病毒感染无明显保护作用。     

检测甲型H1N1流感病毒富集方法的初步探索

目的探索甲型H1N1流感病毒的富集方法,提高流感病毒核酸检测的灵敏度。方法分别用ProteinA/G及H1N1特异性血清处理流感病毒样品,根据国家流感中心设计的H1N1亚型检测通用引物,采用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法,扩增产物为527bp,来评价病毒的富集效果。结果两种富集方法均能提高检测灵敏度,用ProteinA/G富集处理后检测灵敏度可达10-6,用H1N1特异性血清沉淀富集处理后灵敏度为10-5。结论初步建立的富集甲型H1N1流感病毒方法,有效提高了流感病毒RT-PCR检测的灵敏度,可用于甲型H1N1流感病毒的检测。     

Generation and characterization of a cold-adapted attenuated live H3N2 subtype influenza virus vaccine candidate

Background H3N2 subtype influenza A viruses have been identified in humans worldwide, raising concerns about their pandemic potential and prompting the development of candidate vaccines to protect humans against this subtype of influenza A virus. The aim of this study was to establish a system for rescuing of a cold-adapted high-yielding H3N2 subtype human influenza virus by reverse genetics, Methods In order to generate better and safer vaccine candidate viruses, a cold-adapted high yielding reassortant H3N2 influenza A virus was genetically constructed by reverse genetics and was designated as rgAA-H3N2. The rgAA-H3N2 virus contained HA and NA genes from an epidemic strain A/Wisconsin/67/2005 （H3N2） in a background of internal genes derived from the master donor viruses （MDV）, cold-adapted （ca）, temperature sensitive （ts）, live attenuated influenza virus strain A/Ann Arbor/6/60 （MDV-A）. Results In this presentation, the virus HA titer of rgAA-H3N2 in the allantoic fluid from infected embryonated eggs was as high as 1：1024. A fluorescent focus assay （FFU） was performed 24-36 hours post-infection using a specific antibody and bright staining was used for determining the virus titer. The allantoic fluid containing the recovered influenza virus was analyzed in a hemagglutination inhibition （HI） test and the specific inhibition was found. Conclusion The results mentioned above demonstrated that cold-adapted, attenuated reassortant H3N2 subtype influenza A virus was successfully generated, which laid a good foundation for the further related research.     

新疆部分地区一般人群流行性感冒抗体水平监测分析

目的了解新疆南、北疆两地区不同人群的流行性感冒（流感）流行状况，为预防和控制疫情提供依据。方法2006年10月在南疆地区喀什市及北疆地区伊宁市共采集一般人群血清430份，应用新疆2005～2007年度流感监测所分离病毒作为抗原，以微量半致敏血凝抑制方法进行抗体检测。结果人群对H1N1及H3N2亚型毒株的抗体阳性率明显高于B（Yamagata）及B（Victoria），其中H1N1抗体阳性率为82．79％，H3N2抗体阳性率为86．74％，B（Yamagata）为55．81％，B（Victoria）为57．91％。且H1N1、H3N2、B（Yamagata）、B（Victoria）抗体阳性率及保护率在各年龄纽及地区间均有显著性差异。结论加强流感病毒抗原变异株和人群流感抗体水平的监测。     

2009年新型甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶基因进化分析

目的:探讨2009年新型甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)基因的进化及NA基因编码蛋白抗原性、酶活性位点、糖基化位点变异情况。方法:从NCBI基因库检索获得43株不同年代不同地域甲型流感病毒NA基因序列,用Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 4.0（MEGA 4.0）软件进行基因进化分析和氨基酸序列分析。结果:2009年新型甲型H1N1流感病毒与禽H5N1流感病毒NA基因的同源性达到85％,潜在抗原位点氨基酸分布相同;所有毒株的酶活性中心位点高度保守,但糖基化位点有变异。结论:2009年新型甲型H1N1流感病毒的NA基因可能来源于禽H5N1流感病毒;神经氨酸酶抑制剂治疗有效。     

双重荧光实时RT-PCR技术鉴定H9N2亚型禽流感病毒

采用双重荧光实时RT-PCR技术,建立一种简便易行的H9N2亚型禽流感病毒的快速鉴定方法。通过比对GenBank甲型禽流感病毒H9N2亚型的HA和NA基因序列,设计特异性针对HA和NA的引物,分别选用FAM和JOE两种不同荧光标记探针,构建双重实时荧光PCR一步法反应体系,同时检测样本中的HA和NA基因。结果显示:扩增曲线和特异性实验结果显示,该体系具有很好的扩增效率,且仅特异性识别H9N2亚型AIV的HA、NA基因,与相关病毒或其他亚型无交叉反应。采用重组质粒pMD19-T构建HA、NA阳性质粒,10倍梯度稀释液为模板,进行荧光定量PCR。结果证实,本研究所建立的双重荧光定量RT-PCR体系敏感性能达到10个RNA拷贝数。采用本方法检测60份感染动物样品及60份环境样品,与传统PCR方法相比,检测敏感性提高了100倍;与病毒分离鉴定方法比较,二者的鉴定结果完全吻合。该方法具有特异性强、灵敏度高、快速易操作等优点,是H9N2亚型禽流感病毒鉴定的有效方法。     

假病毒技术在抗H5N1禽流感病毒中药筛选中的应用及评价

目的：建立基于假病毒技术的抗H5N1禽流感病毒中药筛选方法,利用血清药理学的方法系统评价攻下方、解毒方、凉血方和扶正方4类中药复方体外对H5N1禽流感病毒活性的影响及其机制。方法：构建整合H5N1禽流感病毒血凝素（hemagglutinin,HA）蛋白的假病毒,雄性Wistar大鼠25只灌胃不同中药制备复方中药血清。采用犬肾（Madin-Darby canine kidney,MDCK）细胞和人胚肾细胞293T为研究对象,将不同浓度药物血清分别与假病毒或靶细胞体外培养后,观察药物血清对假病毒活性的直接抑制作用,通过流式细胞术检测药物血清对H5N1禽流感病毒HA蛋白表达的影响。结果：HA蛋白特异性中和抗体2B4在50μL（抗体总量500μg）、25μL（抗体总量250μg）及12.5μL（抗体总量125μg）的剂量条件下均可以有效抑制假病毒的感染活性,从而证实利用假病毒技术筛选药物的方法的可行性。与对照血清相比,4种复方中药含药血清体外对假病毒均无明显抑制作用（P〉0.05）,也不能有效预防假病毒感染（P〉0.05）,不能抑制H5N1流感病毒HA蛋白的表达。结论：假病毒技术是一种安全、高效、精确的筛选抗H5N1禽流感病毒中药的方法;4类复方中药含药血清并不含有作用于H5N1假病毒HA蛋白及唾液酸α-2,3半乳糖苷受体的有效成分或单体。     

H7N9禽流感病毒小鼠感染动物模型的建立

目的 建立H7N9小鼠感染动物模型。方法 1?08,1?07或1?06 TCID50H7N9禽流感病毒原液（A/Anhui/1/2013）滴鼻感染BALB/c小鼠。主要观测指标：临床症状、死亡率、病理变化、病毒载量和血清抗体检测。结果 被感染的小鼠表现为竖毛、弓背、体重下降;病理表现为间质性肺炎,感染后第2天开始在呼吸道脱落细胞中检测到病毒;免疫组化或病毒分离方法在肺、肾、脑、肠、脾等组织检测到病毒;感染后14d在小鼠血清中血凝抑制试验特异性抗体效价达到160;淋巴细胞减少,单核细胞增多。结论 H7N9感染BALB/c小鼠模型与人类禽流感感染疾病的基本特征相似,为研究该病的发病机制及药物疫苗的研发提供了工作基础。