人甲状腺刺激激素受体cDNA的克隆及真核表达载体的构建

目的克隆人甲状腺刺激激素受体(hTSHR)基因cDNA并构建其真核表达载体。方法以人甲状腺组织cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增hTSHR基因编码区的全部序列,克隆入pGEM-T载体中,经限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,并进行双酶切鉴定。结果PCR扩增的特异性片段长度为2 337 bp,以此构建的pGEM-T-hTSHR克隆载体,经限制性内切酶酶切及DNA序列分析证实载体中带有hTSHR基因编码区的目的片段,重组质粒pcDNA3.1-hTSHR经KpnⅠ和XbaⅠ双酶切后显示5 1000 bp和2 300 bp左右的2个条带,DNA序列分析显示与GenBank中的hTSHR基因cDNA序列一致,证明hTSHR基因已成功克隆入真核细胞表达载体pcDNA3.1中。结论成功构建了野生型pcDNA3.1-hTSHR重组真核表达载体。     

重组人骨形成蛋白2基因在大肠杆菌中的克隆

目的：在大肠杆菌中克隆人骨形成蛋白2基因,方法：由人成骨细胞中提取细胞总RNA,利用逆转录PCR方法扩增获得人骨形成蛋白2基因cDNA;将获得基因片段重组到pCI质粒中,转化到大肠杆菌Top10后挑选克隆,利用限制性酶切和核苷酸序列分析鉴定重组质粒。结果：质粒DNA酶切分析及核酸序列分析证实,获得的基因片段为人BMP2全编码序列,结论：克隆获得人骨形成蛋白2基因,为表达骨形成蛋白2奠定了基础。     

新基因s-lap编码区的克隆及其重组表达质粒PHB/s-lap的构建

目的：克隆新基因s-lap编码区序列并构建其重组表达质粒。 方法：利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法,以可见光损伤早期的培养的猪视网膜色素上皮（RPE）细胞ds cDNA为模板,扩增新基因s-lap编码区序列;利用基因重组技术构建PHB/s-lap重组表达质粒。 结果：经测序证实获得了正确的新基因s-lap编码区序列,酶切鉴定及DNA序列分析表明已经将s-lap基因编码区序列克隆到PHB表达载体, 成功地构建了PHB/s-lap重组表达质粒。结论：成功地克隆了新基因s-lap编码区序列,并构建了其重组表达质粒PHB/s-lap。     

小鼠B淋巴瘤A20细胞株mCD99L2基因表达检测及真核表达载体构建

目的 检测及克隆小鼠B淋巴瘤A20细胞株mCD99L2基因,构建真核表达载体。方法 设计寡核苷酸探针。应用原位分子杂交方法检测A20细胞中mCD99L2基因的mRNA表达,RT-PCR法从A20细胞总RNA中获取mCD99L2基因含编码区全长cDNA,克隆入T载体,筛选阳性克隆、酶切鉴定并经序列测定;设计含酶切位点的PCR引物,PCR获取含mCD99L2基因编码区片段,用限制性内切酶EcoRI和Xho I双酶切取所需目的片段．利用分子克隆技术与pcDNA3．1／MycHisC（＋）质粒重组,对产生的重组子进行PCR、双酶切鉴定,并经过测序证实。结果 原位杂交方法检测A20细胞中mCD99L2基因mRNA呈阳性表达;RT-PCR法成功获得mCD99L2基因编码区全长cDNA序列,DNA序列测序结果与GenBank提供的已知序列（NM—138309）比较,结果完全一致;重组质粒pcDNA3．1．mCD99L2中的插入片段经DNA测序后与GenBank中mD99L2基因相应序列比较,100％同源。结论 小鼠B淋巴瘤A20细胞株存在mCD99L2基因,采用RT-PCR和T．A技术克隆了A20细胞的mCD99L2基因,成功构建了pcDNA3．1．mCD99L2真核表达载体,为下一步探索mCD99L2基因在小鼠B淋巴瘤A20细胞株中的功能奠定了实验基础。     

人存活素基因编码区的克隆和序列分析

目的：克隆人存活素(survivin)基因编码区cDNA并进行序列分析。方法：以人骨肉瘤细胞系MG63的mRNA为模板，采用RT-PCR方法得到人存活素的编码区cDNA，克隆至载体pUC19中，酶切鉴定后进行序列分析。结果：获得人存活素编码区基因和重组质粒pUC19-SURVIVIN，DNA序列分析证实所获得的存活素基因编码区cDNA序列和文献报道一致。结论：采用基因克隆的方法获得人存活素基因，为进一步研究其结构和功能奠定了基础。     

小鼠Lin28基因的克隆及原核表达

目的 探讨获取小鼠Lin28蛋白的方法.方法 提取8.5 d ICR小鼠胚胎mRNA后反转录为cDNA序列,用一对两端引入特定酶切位点(Nco Ⅰ及Xho Ⅰ)引物,从该cDNA中扩增出Lin28基因编码区序列;将获得的Lin28基因编码区序列克隆到pMD18-T载体上.对质粒双酶切回收其中Lin28基因片段,与pET-30a(+)载体相连接并转化Rosetta( DE3)型大肠杆菌,用IPTG诱导表达,最后采用SDS-PAGE对表达结果进行分析.结果 对所克隆的Lin28蛋白编码区的DNA序列分析表明,Lin28 CDS区包括终止密码子在内为630 bp,与参照DNA( NM_145833)相比同源性为99.37％,与参照氨基酸序列相比同源性为100％;在IPTG诱导下pET-30a(+)-Lin28重组质粒可表达与预期相符的约为27.5×103的蛋白质.结论 利用克隆的小鼠Lin28基因,采用原核表达方法,成功获得小鼠Lin28蛋白,为进一步开展以重组蛋白诱导体细胞重编程研究奠定基础.     

人AADC基因的克隆

为克隆表达人芳香族左旋氨基酸脱羧酶的基因 ,以了解此基因在多巴胺代谢过程中的作用 ,从人类胎儿黑质组织中提取总RNA ,以RT PCR方法扩增 1 4 4 2bp的cDNA片段 ,将此片段克隆于 pGEM T载体中 ,经过特异性限制性内切酶酶切分析片段正确后 ,进行全序列分析。结果表明克隆的cDNA与GenBank上的序列相比完全一致 ,得到了编码正确的人AADC的cDNA全序列。     

NT4 TAT 6×His VHLβ结构域肾癌抑制融合肽cDNA克隆的构建

目的构建VHL蛋白(von Hippel Lindau protein, pVHL)β结构域肾癌抑制融合肽cDNA,并将其应用于肾癌的微基因治疗。方法分别设计合成pVHLβ结构域104 123短肽cDNA的正向和反向引物以及编码TAT 6×His cDNA的正、反向引物,使用互为引物模板PCR方法,扩增获得具有NaeI/Eco72I酶识别位点的TAT 6×His cDNA片段和具有Eco72I/BamH I酶识别位点的VHLβ抑制肽cDNA片段,将两个片段分别克隆到pGEM T easy中,使用双脱氧终止法测序,通过DNASIS软件分析同数据库资料一致性和编码的氨基酸序列。用Nae I和BamH I双酶切获取的TAT 6×His VHLβcDNA片段插入到具有NT4信号肽的pBV220载体中,构建了pBV220 NT4 TAT 6×His VHLβ质粒。结果经DNA测序证实,获得了编码TAT 6×His cDNA片段和编码VHLβ抑制肽的cDNA片段,分析证实核酸序列和推导的氨基酸同数据库资料一致。重组质粒pBV220 NT4 TAT 6×His VHLβ酶切图谱证实已将NT4 TAT 6×His VHLβ融合肽cDNA克隆到pBV220原核表达载体中。结论成功扩增了编码TAT膜渗透肽和6×His标签肽以及VHL抑癌基因β结构域肾癌抑制肽的cDNA片段,构建了具有NT4信号肽的TAT 6×His VHLβ融合肽cDNA。     

人Gfil基因克隆及重组Gfil慢病毒表达载体的构建

目的 克隆人Gill基因的全长cDNA,构建用于真核细胞表达的含有Gfil基因ORF区的重组慢病毒表达载体pLOX-Gfil,为研究Gfil基因的功能打下基础.方法 应用RT-PCR从人K562细胞系中扩增出Gfil cDNA片段·经回收纯化与pGEM-T载体连接并转化感受态菌DH5a,通过蓝白筛选酶切鉴定出阳性菌落,质粒提取,BamH I限制性内切酶酶切获得目的 基因,插入慢病毒载体pLOX中并转化感受态细菌DH5a.质粒提取后进行酶切及PCR鉴定,对阳性克隆进行DNA序列分析.结果 RT-PCR扩增获得含有约1.2 kb的DNA片段,酶切及PCR鉴定证实pLOX-Gfil含有大小正确的正向Gfil cDNA,DNA序列分析的结果 与发表于GenBank上的序列(NM005263)完全一致.结论 成功克隆人Gfil基因并构建用于真核细胞表达的重组慢病毒载体pLOX-Gfil.     

神经营养素4前导序列介导Exendin-4表达质粒的构建及鉴定

目的：构建神经营养素4前导序列介导的可分泌表达Exendin-4的重组腺伴病毒载体,为探究Exendin-4用于2型糖尿病临床治疗提供实验基础。方法：使用互补引物/模板法及Ｔ载体克隆法扩增Exendin-4的cDNA克隆,连接于NT4前导肽序列的3′端,融合基因NT4- Exendin-4亚克隆于穿梭质粒pSSHG,转染HEK-293细胞,包装病毒,斑点杂交方法测定重组病毒滴度。结果：经酶切、测序证实克隆出Exendin-4 cDNA,成功构建同一开放读码框ORF的NT4前导肽-Exendin-4cDNA克隆,得到高滴度（2.5×10⁹ pfu·L^-1） 的重组腺相关病毒。结论：通过分子克隆技术成功制备了Exendin-4的重组腺伴病毒载体pSSHG /NT4- Exendin-4并成功包装了较高浓度的重组病毒,为进一步研究Exendin-4功能及应用于临床打下基础。     

6His—hVEGF165融合基因真核表达载体的构建和鉴定

目的：本实验拟构建hVEGF165基因的真核表达载体,为其应用于治疗大鼠缺血皮瓣的研究奠定基础。方法：设计引物P1和P2,在每一个引物的两端分别添加BamHI、XhoI酶切位点。从人外周血中提取总RNA,用RT—PCR方法得到hVEGF165的cDNA。随后再将得到的cDNA连人中间载体pMD19-T,得到pMD19-T—hVEGF165,双酶切鉴定并测定序列。将hVEGF165的cDNA亚克隆到真核表达载体pcDNA6／HisA中,构建hVEGF165真核表达载体pcDNA6-hVEGF165。结果：对pMD19-T-hVEGF165的测序结果表明,本研究成功地从人外周血中扩增到hVEGF165的cDNA。将hVEGF165定向克隆人真核表达载体pcDNA6／HisA,经双酶切及PCR鉴定,将阳性克隆测序,经测序证实序列正确。结论：本研究成功地构建了VEGF165真核表达载体pcDNA6-hVEGF165,并且目的基因上游融合有His标签。     

人骨髓间质干细胞ING4基因的克隆及其慢病毒表达载体构建

目的:克隆人骨髓间质干细胞ING4(inhibitor of growth famility,member4)基因,构建其慢病毒表达载体PNL-ING4.方法:提取人骨髓间质干细胞(hMSCs)总RNA,经RT-PCR扩增出ING4cDNA,克隆至PMD19-T载体,选择阳性克隆进行酶切鉴定和测序,构建慢病毒表达载体PNL-ING4,用双酶切、基因测序进行鉴定.结果:RT-PCR产物为750 bp的条带,双酶切和基因测序正确.结论:成功从hMSCs克隆了ING4基因并成功构建其慢病毒表达载体PNL-ING4,为进一步研究ING4基因的作用与抗肿瘤机制奠定了基础.     

丙型肝炎病毒core-Ant融合表达

目的：探讨丙型肝炎病毒（HCV）core对肝细胞的转分化作用,构建可以表达HCV core—Ant融合蛋白的原核表达载体．方法：已经构建的HCV core cDNA克隆质粒为模板,用PCR技术删除终止子,通过T载体克隆法构建pGEM—T-HCVcorecDNA克隆质粒．经筛选阳性克隆、酶切鉴定并测序后,通过常规分子生物学亚克隆方法,利用已有的pGEMT-Ant载体,连接Ant和HCV core cDNA在同一ORF,插入到pTE28表达载体,建立了表达HCV core和果蝇穿膜肽Ant的融合蛋白表达克隆．使用IPTG诱导方法,从表达菌中提取包涵体蛋白,复性后使用ELISA方法检测表达蛋白的抗原性．使用HRP标记的抗HCV核心抗体免疫组织化学一步法检测HCV core和HCV core—Ant融合蛋白对N1H3T3细胞的转导能力．结果：pGEM—T—HCV core—Ant cDNA克隆的酶切物理图谱及测序证实结果证实建立了果蝇穿膜肽Ant cDNA克隆和删除了终止子的HCV core cDNA克隆．亚克隆后建立的重组质粒pTE28HCVcoreAnt经限制性内切酶后,琼脂糖凝胶电泳,结果显示酶切片段大小和设计预计值一致．序列测定结果表明HCV core cDNA和穿膜肽AntcDNA处于同一ORF．通过转化BL21 DE3表达菌,IPTG诱导后,PAGE电泳成功表达了HCV core—Ant蛋白．复性后包被酶标板,间接ELISA方法检测抗HCV抗体阳性血清和正常人血清证实表达蛋白具有敏感和特异的抗原性．目标蛋白能转导进入NIH 3T3细胞显示了大量的阳性着色细胞．这些阳性着色细胞的着色颗粒主要存在细胞质中．表明构建表达HCV core—Ant融合蛋白的pET28原核表达载体成功．结论：通过分子克隆体外重组技术成功建立了表达HCV core—Ant的pTE28原核表达载体,为研究HCV core对细胞的转分化作用和HCV的致癌机制奠定了基础．     

Bcl-2shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的:应用分子克隆技术,针对人bcl-2目的基因设计3个siRNA靶点和一个阴性对照序列,构建4对shRNA重组慢病毒表达载体,并进行测序验证鉴定。方法:以设计的有效靶序列进行引物合成,将单链引物退火成双链oligo序列,连接入经Age I和EcoR I双酶切线性化的慢病毒RNA干扰载体中,经转化DH5α感受态细胞并筛选出阳性转化子,采用PCR扩增和DNA测序分别鉴定阳性克隆。结果:PCR扩增产物经凝胶电泳后阳性克隆得到335bp条带,阴性克隆得到298 bp条带,DNA测序结果证实其含有设计合成序列。结论:成功构建4对bcl-2shRNA重组慢病毒表达载体,为研究靶向bcl-2 siRNA对肿瘤细胞增殖抑制与诱导凋亡作用及基因治疗研究奠定了实验基础。     

PCR靶向克隆法构建携带人类神经生长因子β基因的含有EGFP的重组腺病毒穿梭质粒

目的:在靶向克隆酶的作用下,利用PCR靶向克隆构建携带人神经生长因子的重组腺病毒穿梭质粒pShuttle-hNGFβ-EGFP。方法:按PCR引物设计原则设计两条引物,分别在上下游引物的5′端加上12个碱基与线性化载体切口两端同源载体序列,引物合成后PCR反应扩增目的基因hNGF-β,提纯后与EcoRⅤ酶切的穿梭质粒pShuttle-IRES-hrEGFP在靶向克隆酶(LPReccoenzyme)的作用下37℃孵育15min,转化感受态大肠杆菌,碱裂解法制备及纯化质粒DNA。结果:EcoRⅤ酶切鉴定证实pShuttle-hNGFβ-EGFP构建成功。结论:在不需要限制性内切酶的情况下用靶向克隆酶连接可快速、准确得到穿梭质粒pShuttle-hNGFβ-EGFP。     

酵母质粒PCR扩增及酶切在酵母双杂交中的运用

目的:减少对初步筛选获得的阳性克隆进一步鉴定的工作量,防止阳性克隆的丢失.方法:提取酵母双杂交筛选cDNA表达文库获得的阳性克隆酵母细胞质粒,以文库载体插入片段两端特异序列为引物,PCR扩增插入片段,限制性核酸内切酶酶切扩增产物,琼脂糖凝胶电泳,根据带型对阳性克隆进行分类.结果:将初步获得的107株阳性克隆,分为24类,在PCR扩增过程中发现个别克隆含有两种以上的文库质粒.结论:酵母质粒PCR扩增,酶切分类的方法,不仅可以大大减轻阳性克隆进一步鉴定的工作量,避免不必要的浪费,而且还可以避免阳性克隆的丢失.     

大鼠SLC7a8基因的克隆及真核表达载体的构建

目的：克隆大鼠左旋氨基酸转运体（SLC7a8）基因cDNA的读码框（CDS）,构建携带SLC7a8基因的重组真核表达载体,为进一步研究其在自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats,SHR）中的功能作准备。方法：从非高血压大鼠（wistar-kyoto,WKY）肾脏组织提取总RNA,通过RT-PCR得到总cDNA,PCR法扩增,产物连接pGEM-T Easy载体测序分析正确后,再以PCR方法扩增,将其连接入真核表达质粒pcDNA3.1（＋）。以PCR、双酶切和测序鉴定正确后,将重组载体pcDNA3.1（＋）-SLC7a8用脂质体包裹转染大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）,RT-PCR法及Western blotting法分别检测转染后SLC7a8 mRNA及蛋白表达水平。结果：成功克隆了大鼠SLC7a8基因cDNA,重组真核表达载体pcDNA3.1（＋）-SLC7a8构建成功,且证实转染后肾小管上皮细胞的SLC7a8 mRNA及蛋白表达均明显高于空白对照组（P〈0.05）及空质粒组（P〈0.05）。结论：成功克隆了SLC7a8基因,并构建了真核表达载体pcDNA3.1（＋）-SLC7a8,能够在NRK-52E细胞中获得有效过表达,这为进一步探讨SLC7a8基因的生物学功能奠定了基础。