小鼠黑色素移植瘤血管生成拟态CD31、MMP2、MMP9、Cathepsin D的表达

目的动态观察CD31、MMP2、MMP9、Cathepsin D在黑色素移植瘤血管生成拟态形成（vasculogenesis mimicry,VM）中的表达。方法制作小鼠黑色素移植瘤动物模型,成瘤后每天随机抽取1只小鼠处死,共12天,获得肿瘤样本114例;HE染色、CD31、Cathepsin D、MMP2、MMP9免疫组化染色和PAS染色。结果在移植瘤形成的第1～8天,肿瘤组织内存在VM;第9～12天移植瘤中的VM被内皮依赖性血管替代;VM周围肿瘤细胞中CD31、MMP2阳性百分率高于远离VM区域的阳性百分率;内皮依赖性血管周围肿瘤细胞CD31阳性百分率与远离内皮依赖性血管区域的阳性百分率之间存在差别;VM周围肿瘤细胞MMP9阳性百分率高于内皮依赖性血管周围的阳性百分率;VM密度与VM周围肿瘤细胞CD31、Cathepsin D、MMP2阳性百分率之间存在相关;内皮依赖性血管密度只与内皮依赖性血管周围肿瘤细胞中CD31阳性百分率之间存在相关。结论移植瘤中VM是暂时性血液供应方式,渐被内皮依赖性血管替代;CD31、Cathepsin D、MMP2、MMP9均与黑色素移植瘤VM形成有关,其中CD31、MMP2作用尤其重要。     

蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂的表达对黑色素瘤B16细胞侵袭与转移的作用

目的探讨蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂cystatin（sv-cystatin）在黑色素瘤细胞侵袭与转移中的作用。方法构建真核表达质粒pcDNA3．1／sv-cystatin,采用脂质体法将重组质粒导人小鼠黑色素瘤B16FI细胞。G418筛选抗性克隆,Western blotting法和RT-PCR鉴定sv—cystatin在黑色素瘤细胞中的表达,四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测肿瘤细胞体外生长和黏附能力的变化,体外侵袭、运动实验和小鼠实验性肺转移模型分析sv-cystatin表达对黑色素瘤细胞体内、外侵袭力的影响。结果sv-cystatin基因稳定转染后B16F1细胞体外侵袭与运动能力明显降低,其穿膜的细胞数显著低于B16F1／pcDNA3．1空载体组和未转染细胞组（P〈0．01）;sv—cystatin的表达可抑制C57BL／6小鼠肺转移瘤灶的形成;其体外增殖及黏附能力未见明显改变。结论sv—cystatin基因转染可抑制黑色素瘤B16细胞的体内、外侵袭与转移能力。     

恶性黑色素瘤血管生成拟态的分子机制及临床意义

血管生成拟态是一种与传统内皮细胞依赖性血管不同的肿瘤微循环方式。形成血管生成拟态的瘤细胞基因表达呈胚胎样表型,而且VE 钙黏蛋白、组织因子、EPHA2信号转导通路在血管生成拟态形成中发挥重要作用,这些分子可能成为肿瘤抗血管生成治疗的新靶点。     

肿瘤血管拟态形成机制研究进展

<正>血管生成拟态(vasculogenic Mimicry,VM)是近年来提出的一个肿瘤微循环的全新概念。与经典的血管生成途径完全不同,VM是高侵袭性肿瘤为了满足自身的血液供应,通过自身表型和细胞外基质重塑而围成的一种类血管样的管道,是不依赖血管内皮细胞的一种肿瘤微循环模式,VM的发现解释了以抑制肿瘤血管生成为主要作用靶点的抗肿     

不同微环境对黑色素瘤细胞侵袭能力和局部微循环模式形成的影响

目的明确不同微环境对肿瘤细胞侵袭能力和微循环模式的影响,并阐述其相关分子机制。方法将恶性黑色素瘤单细胞悬液B16分别接种至C57小鼠腹腔和后肢肌肉组织中,于接种肿瘤后第18天后处死动物,取腹腔内肿瘤组织和小鼠后肢肿瘤组织,免疫组织化学（sP法）CK18染色对后肢组和腹腔组肿瘤细胞恶性侵袭表型进行比较,并比较在不同微环境生长下肿瘤细胞缺氧诱导因子（HIF）．1仅的表达,免疫组织化学染色和RealtimePCR方法从蛋白水平和mRNA水平比较腹腔组和后肢组肿瘤细胞基质金属蛋白酶（MMP）-2和MMP-9的表达差别;并对肿瘤组织内不同微循环模式进行计数。结果免疫组织化学染色结果显示与腹腔组相比,后肢组肿瘤细胞CKl8、HIF-1仅表达明显增高（t=8．142,t=3．645,P均〈0．05）,同时也表达更高的肿瘤侵袭相关蛋白,肿瘤细胞表达MMP-2和MMP-9均明显高于腹腔组（t=4．916,t=7．782,P均〈0．05）,RealtimePCR检测结果也显示后肢组MMP-2和MMP-9mRNA表达也明显高于腹腔组（t=36．814,t=26．025,P均〈0．05）。在后肢组肿瘤组织中,血管生成拟态是肿瘤细胞获得营养的主要方式,而腹腔组肿瘤细胞获得营养供应方式主要通过内皮依赖性血管。结论不同生长微环境影响黑色素瘤细胞的恶性表型转化,致使肿瘤细胞分泌更多肿瘤侵袭转移相关蛋白,促进肿瘤细胞向周围组织浸润,肿瘤细胞侵袭能力的增高促进了肿瘤血管生成拟态的形成。     

蛇毒金属蛋白酶抑制剂基因的合成及杆状病毒表达载体的构建

研究蛇毒金属蛋白酶抑制剂（BJ46a）基因的合成及杆状病毒表达载体的构建。根据GenBank中查找的BJ46a基因序列（AF294836），将其分为20个片段，通过缓慢退火PCR法使之拼接为完整的BJ46a基因，经SacⅠ及XhoⅠ双酶切后定向克隆到载体pET-42a（＋）中，PCR扩增、酶切及测序鉴定；根据测序结果用定点突变法逐一改正错误位点。随后将该基因插入到转座载体pFastBac HT C的MCS中，转化大肠杆菌DH5 α-T1，以LB／AP平板筛选阳性重组子，PCR扩增、酶切鉴定，提取pFastBac HT C-BJ46a重组体进一步转化DH10Bac感受态细胞，48h后通过蓝白筛选，挑取单个白色菌落划线，证实所得菌落均为白斑，挑克隆PCR鉴定。结果表明成功构建杆状病毒重组转座载体、重组穿梭载体。含BJ46a基因的重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞，获得目的蛋白的表达。BJ46a基因的合成及杆状病毒表达载体的成功构建，为进一步研究其生物学功能奠定了坚实的基础。     

同型半胱氨酸对血管平滑肌细胞分泌金属蛋白酶组织抑制剂-1的影响

目的：观察同型半胱氨酸(Hcy)对血管平滑肌细胞(VSMCs)分泌金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)的影响。方法：体外培养大鼠VSMCs，加入不同浓度的Hcy培养48 h，应用Western blot技术观察Hcy对VSMCs分泌基质金属蛋白酶-1(MMP-1)和TIMP-1的影响，并通过半定量RT-PCR方法观察TIMP-1 mRNA表达的变化。结果：Hcy减少VSMCs MMP-1的分泌，上调TIMP-1 mRNA的表达，使TIMP-1分泌增加，并呈剂量依赖效应。结论：提示Hcy减少胶原降解可能是致动脉粥样硬化的发病机制之一。     

基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9在胶质瘤侵袭和转移中的作用

胶质瘤是一种中枢神经系统恶性肿瘤,病死率高。胶质瘤细胞的侵袭和转移是其致死的重要原因之一,而基质金属蛋白酶通过溶解细胞外基质实现侵袭和转移。基质金属蛋白酶(mat r i x metalloproteinase,MMP)是锌离子依赖性蛋白水解酶,广泛分布于人体各组织和器官,参与细胞外基质的降解和重塑,调节细胞粘着,在肿瘤细胞的侵袭中起着重要作用。本文就基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9在胶质瘤中的侵袭作用及其机制进行综述。     

乳腺癌血管生成及组织蛋白酶D表达与转移的关系

目的：探讨乳腺癌组织微血管密度（ｍｉｃｒｏｖｅｓｅｌｄｅｎｓｉｔｙ，ＭＶＤ）及组织蛋白酶Ｄ（ｃａｔｈｅｐｓｉｎＤ，ＣＤ）表达与转移的关系。方法：应用免疫组织化学方法对乳腺癌组织的ＭＶＤ及ＣＤ进行定量和半定量研究。结果：乳腺癌组织ＭＶＤ及ＣＤ表达与淋巴结转移密切相关，腋下淋巴结转移组的ＭＶＤ（１３１．８±３９．８）明显高于腋下淋巴结阴性乳腺癌（ｎｏｄｅｎｅｇａｔｉｖｅｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ，ＮＮＢＣ）组的ＭＶＤ（７８．１±２７．１）（Ｐ＜０．００１）；腋下淋巴结转移组ＣＤ高表达者（３３／３６，９１．７％）明显多于ＮＮＢＣ组（１６／３６，４４．４％）（Ｐ＜０．０１）。乳腺癌组织ＭＶＤ与ＣＤ表达关系密切；远处转移及早期死亡者ＭＶＤ较高且ＣＤ表达极强。结论：乳腺癌组织ＭＶＤ的增加及ＣＤ高表达可能协同促进肿瘤转移。富于微血管及ＣＤ高表达的乳腺癌应作为远处转移及早期死亡的高危患者加以重视。     

可调控型反义基质金属蛋白酶9表达抑制人黑色素瘤细胞侵袭转移表型的研究

目的 探讨基质金属蛋白酶(MMP)-9与肿瘤转移的相关性。方法 利用基因重组技术构建反义MMP—9 cDNA四环素可调控型表达载体,用脂质体法转染反义MMP—9至转移性人黑色素瘤细胞株WM451(高表达MMP—9)。检测转染后细胞MMP—9表达水平的改变以及体外生长、侵袭、裸鼠体内成瘤及自发转移能力的变化。结果 转染反义基因后,WM451细胞MMP—9的表达及活性明显下降,同时MMP—2的表达也受到一定抑制,细胞生长速度、体外侵袭能力及棵鼠体内成瘤性及自发转移能力均受到一定程度抑制;运用四环素可以抑制四环素负调控逆转录病毒载体上的外源基因的表达。结论 反义MMP—9基因下调MMP—9的表达,可使人黑色素细胞转移能力受到一定程度的抑制,说明MMP—9在人黑色素瘤细胞转移过程中起重要作用。同时,四环素负调控逆转录病毒载体可以调控外源基因的表达。     

基质金属蛋白酶-2、金属蛋白酶组织抑制因子-2表达与滑膜肉瘤转移、肿瘤血管生成的关系及其预后意义

目的探讨滑膜肉瘤肿瘤细胞中基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和金属蛋白酶组织抑制因子-2（TIMP-2）的表达情况及其预后意义。方法采用免疫组织化学SP法检测72例滑膜肉瘤肿瘤细胞中MMP-2、TIMP-2的表达情况,收集每例临床病理学参数并统计生存率、以CD31标记检测微血管密度（MVD）并分析与生存率的关系。结果（1）MMP-2、TIMP-2的表达阳性率分别为84．7％（61／72）和83．3％（60／72）,二者表达强度呈负相关关系（r=-0．290,P=0．013）。（2）有转移病例出现MMP-2高表达和TIMP-2低表达的比例明显高于无转移病例（分别P=0．010,P=0．002）。（3）MMP-2高表达病例的MVD明显大于其低表达者（P=0．005）,TIMP-2高表达病例的MVD明显小于其低表达者（P=0．048）。（4）单因素和多因素生存分析均显示TIMP-2低表达与患者预后不良有关（分别P=0．002,P=0．016）。结论MMP-2和TIMP-2表达异常可能与滑膜肉瘤的转移及肿瘤血管生成有关,TIMP-2低表达可能提示患者预后不良。     

红花多糖对荷瘤小鼠肿瘤组织基质金属蛋白酶-9、组织金属蛋白酶抑制剂-1mRNA表达影响的研究

目的 探讨红花多糖(safflower polysaccharide,SPS)对荷瘤小鼠肿瘤组织中基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)-9、组织金属蛋白酶抑制剂1(tissue inhibitors of metalloproteinase,TIMP-1)mRNA表达的影响.方法 BABL/c小鼠腋下接种S180肉瘤,腹腔注射SPS连续10 d,给药结束24 h后取肿瘤组织Real time-PCR法测MMP-9、TIMP-1 mRNA表达水平.结果 SPS低剂量组、中剂量组和高剂量组肿瘤组织中MMP-9的表达量分别是模型对照组的0.452、0.204、0.026倍,TIMP-1的表达量分别是模型对照组的3.4、5.2、10.0倍.结论 SPS能够抑制肿瘤组织中MMP-9基因的表达,促进TIMP-1基因的表达,具有抑制肿瘤及其转移的作用.     

血管内皮生长因子、Eph受体酪氨酸激酶A2、基质金属蛋白酶-2和-9在卵巢癌血管生成拟态中的作用

目的 探讨血管内皮生长因子(VEGF)、Eph受体酪氨酸激酶A2 (EphA2)、基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9在卵巢癌血管生成拟态中的作用.方法 收集临床和预后资料完整的卵巢癌组织标本84例,切片经明确诊断后进行CD31和过碘酸-雪夫 (PAS) 双重染色,证实肿瘤组织中存在血管生成拟态,行VEGF、EphA2、MMP-2和MMP-9 免疫组织化学染色,根据染色指数统计免疫组织化学染色结果.结果 有血管生成拟态组(36/84)和无血管生成拟态组卵巢癌组织(48/84)的VEGF、EphA2、MMP-9表达差异有统计学意义,有血管生成拟态组的卵巢癌细胞VEGF、EphA2、MMP-9表达明显高于无血管生成拟态组.但有血管生成拟态组和无血管生成拟态组患者的MMP-2表达差异无统计学意义.结论 在卵巢癌中血管生成拟态和内皮依赖性血管并存,VEGF、EphA2和MMP-9等参与了卵巢癌血管生成拟态的形成.检测VEGF、EphA2和MMP-9可作为预测卵巢癌预后的间接指标.     

铁对三阴性乳腺癌细胞体外血管生成拟态的影响

目的研究铁对三阴性乳腺癌细胞体外血管生成拟态(VM)的影响及其机制。方法将细胞分为6组:对照组、30和300μmol/L含羞草氨酸组、500μmol/L去铁胺组及50和500μmol/L乳酸亚铁组。用MTT法检测细胞增殖活力,三维培养和PAS染色鉴定细胞形成VM的能力,免疫荧光染色法检测ROS变化,Western blot检测p-ERK1/2表达。结果去铁胺、含羞草氨酸均可显著抑制血管样结构形成(P0.05),乳酸亚铁可促进其形成(P0.05),并且血管样结构表现为PAS染色阳性。细胞血管样结构形成能力与胞内ROS及p-ERK1/2表达水平变化相一致。加入PD98059可以显著抑制其形成(P0.05)。结论铁诱导生成ROS促进VM的形成,ERK1/2的异常激活可能是主要调节机制。     

XAV939抑制人肝癌HepG2细胞血管生成拟态的形成

目的初步研究XAV939对人肝癌Hep G2细胞血管生成拟态形成的影响及其可能的机制。方法实验分为对照组和实验组(0.5和1μmol/L XAV939分别处理Hep G2细胞48 h);体外成管实验检测各组细胞形成血管拟态的能力,RT-PCR检测ZEB1及MMP-7 mRNA的表达,Western blot检测β-catenin、ZEB1和MMP-7蛋白的表达。结果对照组与实验组形成管状结构数目分别为9.67±0.70,5.67±0.64(0.5μmol/L)和2.27±0.81(1μmol/L),体外形成管道结构的数目减少(P0.01);实验组ZEB1及MMP-7 mRNA表达和ZEB1、MMP-7及β-catenin蛋白表达均较对照组减少(P0.05)。结论 XAV939能有效抑制人肝癌Hep G2细胞血管生成拟态的形成。     

弗林蛋白酶抑制剂对乳腺癌细胞MCF-7迁移的影响

 目的：探讨乳腺癌转移的机制,为深入研究乳腺癌发生、发展机制提供理论基础。方法：不同浓度的弗林蛋白酶(furin)抑制剂处理人乳腺癌细胞MCF-7 48 h。细胞划痕实验（wound healing assay）和细胞趋化实验（Transwell assay）检测MCF-7细胞迁移和侵袭能力。Western blotting 检测细胞迁移相关蛋白膜型基质金属蛋白酶1（MT1-MMP）、血管内皮生长因子（VEGF）-C和VEGF-D水平。酶联免疫吸附法（ELISA）检测细胞培养液中基质金属蛋白酶(MMP)2和9水平。结果：与对照组相比,200 nmol/L的furin抑制剂α1-PDX即对细胞迁移及侵袭起显著抑制作用（均P<0.05）;细胞迁移相关的MT1-MMP、VEGF-C和VEGF-D表达水平均显著降低（P<0.05）;MCF-7细胞上清液中MMP2 和 MMP9的表达均显著降低（P<0.05）。结论：Furin抑制剂通过下调乳腺癌细胞MCF-7的MMPs及VEGFs表达抑制其迁移。     

APRIL调节基质金属蛋白酶的表达对结直肠癌细胞转移侵袭能力的影响

目的 研究增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligand,APRIL)对结直肠癌(colorectal cancer,CRC)细胞转移侵袭能力和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)表达的影响,以进一步明确APRIL在CRC转移中的作用.方法 APRIL基因的小干扰RNA质粒载体(siRNAAPRIL)转染人CRC细胞SW480,APRIL重组蛋白(rhAPRIL)刺激CRC细胞HCT-116,Transwell小室转移及侵袭试验分析APRIL对CRC细胞转移及侵袭能力的影响;RT-PCR、ELISA检测MMPs的表达变化.结果 siRNA-APRIL转染的SW480细胞Transwell小室试验转移及侵袭细胞数显著减少(P＜0.05),rhAPRIL刺激的HCT-116细胞Transwell小室试验转移及侵袭细胞数显著增多(P＜0.05);MMP-2、MMP-9及TIMP-1 mRNA,分泌型的MMP-2、MMP-9蛋白表达在转染或刺激前后差别均有统计学意义(P＜0.05);MMP的抑制剂GM6001处理后,SW480对照组和rhAPRIL刺激后的HCT-116细胞Transwell小室侵袭细胞数显著减少(P＜0.05).结论 APRIL通过调节MMPs的表达促进结直肠癌的侵袭和转移,可为结直肠癌转移的干预及治疗提供新的靶点.     

基质金属蛋白酶及其抑制剂对肝纤维化的影响

肝纤维化(liver fibrosis)是各种病因(病毒性、酒精性、化学性等)引起的细胞外基质(extracelluIar matrix,ECM)合成超过降解,而导致的细胞外基质在肝脏过度沉积的一类疾病,肝纤维化继续发展可以导致肝硬化而严重威胁人类健康.     

维药买朱尼对骨关节炎大鼠模型关节软骨中基质金属蛋白酶1和基质金属蛋白酶抑制剂1的影响

背景：骨关节炎患者关节软骨的损害与基质金属蛋白酶1和基质金属蛋白酶抑制剂失平衡有关。 目的：观察基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶抑制剂1在关节软骨中的表达及维药买朱尼对其影响。 方法：将20只SD大鼠采用改良Hulth造模法建立大鼠膝骨关节炎模型,按随机数字表法随机等分为买朱尼组和模型组,建模第2周开始分别灌胃维药买朱尼和生理盐水,连续4周。 结果与结论：相比于模型组,买朱尼组大鼠膝关节软骨退变程度减轻,软骨大体评分及Mankin评分降低(P < 0.05),且膝关节软骨细胞中基质金属蛋白酶1的表达降低,基质金属蛋白酶抑制剂1的表达增加(P < 0.05)。说明维药买朱尼可以通过下调基质金属蛋白酶1的表达水平、上调抑制剂的表达水平,对软骨产生保护作用。