增强化学发光技术的发展和在生物学与医学中的应用

增强化学发光技术的发展和在生物学与医学中的应用杨晓林，王申五，蒋中华，毕建进，马立人（北京医科大学附属人民医院中心实验室，北京１０００４４）编者按：本刊自１９９３年第二期刊登“生物和化学发光技术在生物、医学中的应用”专题以来，该技术的应用又有了许多新...     

应用增强化学发光法检测PCR扩增的人巨细胞病毒核酸

本文报道用增强化学发光法（ＥＣＬ）检测ＰＣＲ扩增的人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）核酸。该检测系统用戊二醛将辣根过氧化物酶复合物（ＨＲｐ－ＰＢＱ－ＰＥＩ＋－ＮＨ３＋）与探针结合制成酶标基因探针。探针与靶ＤＮＡ结合后ＨＲＰ可催化检测系统中的发光底物，经增强剂将光信号放大，杂交信号通过Ｘ光片显影。实验证明，用ＥＣＬ检测ＰＣＲ扩增的ＨＣＭＶＤＮＡ产物，敏感性可达０．０１ｆｇ的ＤＮＡ片段，且仅与ＨＣＭＶＤＮＡ的扩增产物杂交。临床应用表明，此方法具有快速、简便、敏感、安全的特点。     

化学发光免疫法检测前列腺特异性抗原的临床应用

目的 利用化学发光免疫法定量检测前列腺特异性抗原(PSA),分析其在临床诊断前列腺癌中的应用情况.方法 将60例前列腺癌患者设为A组,60例良性前列腺增生患者设为B组,60例健康体检者设为C组,对三组受试者血清中总前列腺特异性抗原(tPSA),游离前列腺特异性抗原(fPSA)进行化学发光免疫法检测,并分析其水平差异.结果 经检测,A组和B组的tPSA含量显著高于C组,而且A组tPSA含量显著高于B组,差异显著,存在统计学意义(P＜0.05);另外A组fPSA/tPSA比值低于B组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 对PSA进行化学发光免疫法检测,具有较高的临床诊断价值,可为前列腺癌临床诊断提供可靠的参考依据.     

丙型肝炎病毒抗体双抗原夹心法化学发光检测的应用

目的 探讨丙型肝炎病毒抗体双抗原夹心法化学发光检测的应用.方法 利用重组融合HCV抗原分别标记生物素及吖啶酯,建立起双抗原夹心法化学发光检测试剂盒,与间接法同时检测了866例阴性标本,440例阳性标本,3套BBI阳转血清盘.结果 双抗原夹心法与间接法灵敏度分别为100％、100％,特异性分别为99.9％、98.7％,特异性差别1.2％(95％可信区间:0.5％～2.1％),BBI阳转血清相对敏感性系数为-1.33.结论 双抗原夹心法特异性及早期感染检测能力优于间接法,将会成为丙型肝炎病毒抗体检测的主要方法.     

化学发光酶联免疫法检测汉坦病毒IgM抗体的研究

目的建立化学发光酶联免疫分析法（CLEIA）检测肾综合征出血热（HFRS）患者血清中IgM抗体。方法以抗人IgM-μ链抗体包被黑色不透明聚乙烯板，辣根过氧化物酶标记汉坦病毒核蛋白作为检测抗原以及luminol-H2O2作为发光底物，建立CLEIA法并对CLEIA与IgM抗体捕获酶联免疫吸附法（MacELISA）进行比较。结果CLEIA与MacELISA相关系数0．97；对于51份确诊的HFRS患者急性期血清CLEIA检测敏感度100％，MacELISA为90．2％；对48份正常人血清两种方法检测特异度均为100％；CLEIA次内变异系数范围5．02％-12．7％，次间变异系数范围0．4％～7．0％，与MacELISA相当。结论化学发光酶联免疫分析法是一种更为灵敏，准确和稳定的方法，适用于检测HFRS早期患者血清中IgM抗体。     

复合前列腺特异性抗原的单克隆抗体制备及化学发光法免疫定量检测试剂研究

目的:获得特异性检测复合前列腺特异性抗原(c-PSA)的单克隆抗体配对,建立基于化学发光c-PSA 免疫定量试剂。方法:利用市购c-PSA 抗原免疫6 周龄雌性BALB/ c 小鼠,间接法ELISA 差异筛选抗c-PSA、游离前列腺特异性抗原(f-PSA)、总前列腺特异型抗原(t-PSA)的抗体,抗体配对后化学发光定量检测血清中c-PSA 蛋白。结果:获得抗体配对1A10/7D6-SAE,经c鄄PSA 标准品及临床血清样本初步筛选,该抗体配对适用于基于化学法发光的免疫反应定量检测试剂的开发;血清阳性样本与阴性样本检测结果显示具有统计学意义(P<0.000 1);阳性样本定量结果与Siemens 公司复合前列腺特异性抗原测定试剂盒(直接化学发光法)的相关系数为0.97;线性范围为0郾1 ~ 100 ng/ ml;检测灵敏度为0.005 ng/ ml。结论:成功筛选获得特异性检测c-PSA 的抗体配对,并开发c鄄PSA 化学发光免疫定量试剂,其检测能力与国际主流试剂相当。     

钩端螺旋体内毒素的实验研究 Ⅴ 钩端螺旋体脂多糖增强机体特异性抗感染能力的作用

波摩那群波摩那型56608株钩端螺旋体脂多糖(L-LPS)免疫的豚鼠能抵抗同株钩端螺旋体的攻击而免于发病和死亡,旦其心血和肾脏培养阳性率也明显下降。L-LPS免疫动物后可产生以IgM为主的群特异性抗体。该抗体当有补体存在时,能在体外裂解钩端旋螺体。此外,L-LPS尚能特异性地抑制豚鼠腹腔巨噬细胞的粘附作用。实验结果提示L-LPS为一种保护性抗原,可特异性地增强机体抗感染的能力。     

癌抗原15-3酶促化学发光免疫分析方法的建立

目的 建立癌抗原15-3(CA15-3)酶促化学发光免疫分析方法.方法 利用双抗体夹心法建立CA15-3化学发光检测体系,分别对该体系的最低检测限、线性、分析特异性、准确度和精密度进行评估,并与进口全自动化学发光检测结果进行对比.结果 本方法灵敏度为0.26 U/mL,线性范围为0～ 300 U/mL,与CEA和CA125无交叉反应,添加回收率在97.0％ ～105.6％之间,分析内与分析间CV均小于10％,与进口全自动化学发光试剂同时检测160份样本的CA15-3浓度,检测结果的线性相关系数为0.987.结论 成功建立了CA15-3酶促化学发光免疫分析方法.该方法灵敏度高、重复性好,在临床应用中可替代进口化学发光检测试剂.     

化学发光微粒子免疫法检测鳞状上皮细胞癌抗原的方法学评价

目的 对化学发光微粒子免疫法检测鳞状上皮细胞癌抗原(SCC Ag)进行方法学评价及性能验证.方法 对化学发光微粒子免疫法检测鳞状上皮细胞癌抗原的不精密度、回收率、线性分析、定量可报告低限值、特异性和灵敏度、反复冻融试验以及参考范围验证等方面进行评价.结果 化学发光微粒子免疫法检测鳞状上皮细胞癌抗原低、中、高值样本批内不精密度CV％分别为3.88％、2.80％和0.69％,批间不精密度CV％分别为3.98％、3.10％和3.17％;回收率为95.77％～102.25％,平均回收率为98.89％;线性分析R2为0.9997;定量可报告低限值为0.21ng/mL,CV％为15.06％;特异性为96％,灵敏度为94％;低、中、高值样本反复冻融试验CV％分别为7.99％、2.97％和1.36％;参考范围验证的检测结果均＜1.3ng/mL.结论 化学发光微粒子免疫法检测鳞状上皮细胞癌抗原方法符合实验室要求,检测性能良好,可广泛在实验室开展应用.     

血清肝纤维化指标酶联免疫分析实验和增强化学发光免疫分析系统检测的评价

目的 评价增强化学发光免疫分析系统(Enhanced Chemiluminescence Immunoassay, ECLIA)与酶联免疫吸附试验(ELISA),测定血清透明质酸(HA)、层黏蛋白含量(LN)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)和Ⅲ型前胶原(PCⅢ)方法与患者肝纤维化程度的相关性.方法 以患者肝穿病理结果为金标准,分别用ECLIA和ELISA法检测253例患者的4项血清纤维化指标,并分别与病理结果进行比较.结果 两种方法的检测结果均能反映患者从肝炎到肝硬化的肝纤维化逐渐加重的趋势.但与ELISA法比较,ECLIA方法检测的结果与病理结果的相关性较好.结论 ECLIA系统检测血清肝纤维化四项指标,可以更好的反应肝硬化的发展程度.     

化学发光法和酶联免疫法作为筛选试验测定丙肝抗体的评价

目的比较化学发光法(CLIA)和酶联免疫法(EIA)测抗-HCV对诊断HCV感染的检出率,分析CLIA测定抗-HCV作为HCV感染初筛试验的重要临床意义。方法分别用CLIA、EIA方法检测所有临床标本中的抗-HCV,选取抗-HCV初筛阳性样本进行HCV RNA确认试验。结果 6461例样本中,EIA和CLIA测抗-HCV阳性率分别为2.86%和3.17%;确认试验中,CLIA法抗-HCV阳性与HCV RNA的符合率为97.1%,显著高于EIA组(91.9%)。EIA法测抗-HCV,S:CO>5.0以上,与HCV RNA检测符合率可达100%;弱阳性样本,与HCV RNA符合率为69.7%;CLIA法测抗-HCV,S:CO>2.0以上,与HCV RNA检测符合率可达100%;弱阳性样本,与HCV RNA符合率为92.9%。有31例样本CLIA法抗-HCV和HCV RNA阳性,而EIA法抗-HCV阴性;有4例样本EIA法检测为阳性,而CLIA法和PCR确认试验均为阴性。结论CLIA法测抗-HCV作为HCV感染初筛实验,与传统EIA相比,特异性和阳性预测值更高,有效降低了假阳性率,有利于临床医生对HCV感染患者的早期诊断和治疗。     

化学发光法与酶联免疫吸附分析法联合测定癌胚抗原的应用

目的通过酶联免疫吸附分析法（ELISA）与磁粒子捕获免疫发光法（ICA）联合测定血癌胚抗原（CEA）进行分析和探讨。方法预先用ELISA对检测CEA的血清标品进行分组,然后根据浓度级别分组再检测血清CEA的浓度。结果ELISA和ICA联合检测血CEA,可大大节约非常昂贵的ICA试剂,又能快速发出检验报告。结论该方法无论是医院或者病患者都带来了非常可观的经济效益。     

化学发光法检测CYP1A1基因多态性

目的　建立增强化学发光法 (enhancedchemiluminescence,ECL)检测CYP1A1基因多态性的方法。方法　实验方法同ELISA法 ,鲁米诺过氧化氢增强化学发光体系加入酶标板的每一个孔中 ,用单光子计数器检测其发光强度 ,即可鉴定样本基因型。结果　 30个标本的检测结果与ELISA相同 ,其灵敏度比琼脂糖凝胶电泳高 10 0 0倍 ,比ELISA法高 10倍 ,辣根过氧化物酶标记DIG抗体的量为0 .2mU ,比ASA ELISA法少 ,1h杂交便可以判断标本的基因型 ,最佳杂交时间为 1.5～ 2h ,杂交温度为4 0～ 5 5℃。结论　该方法是一种更加灵敏和简便 ,极具发展前景的检测基因多态性的方法。     

糖类抗原50化学发光免疫分析方法的建立及评价

目的 建立以异硫氰酸荧光素(FITC)单抗包被磁微粒、吖啶酯为发光标记物的检测糖类抗原50(CA50)的磁微粒全自动化学发光免疫分析方法.方法 根据双抗体夹心法原理,选择抗-FITC单克隆抗体偶联磁微粒,FITC标记一株抗-CA50单克隆抗体,吖啶酯标记另一株抗CA50单克隆抗体,建立CA50化学发光免疫分析方法,同时对该方法的空白限、检出限、线性范围、准确度、重复性、干扰进行了验证,并与迈瑞全自动化学发光试剂检测结果进行了比对.结果 本方法最终采用两步法的反应模式,空白限为0.03U/mL,检出限为2U/mL,线性范围为4.0～500.0U/mL,样本的回收率为99.39％,高、低两份样本变异系数分别为4.05％和2.16％,与迈瑞全自动化学发光免疫测定系统同时测定131份样本,回归方程为Y=1.0177 X-3.0827,r=0.993.同时发现样本中的荧光素钠(FITC-Na)高于2μg/mL时会对本方法造成干扰.结论 成功建立了糖类抗原50的吖啶酯全自动化学发光免疫分析方法,各项指标均满足临床检测的要求,具有一定的临床应用价值.     

化学发光法测定脑组织中一氧化氮合酶的活性

在NADPH等辅助因子的参与下，一氧化氛合酶（NOS）能催化L-精氨酸生成一氧化氮（NO）。NO与过氧化氢反应生成过氧亚硝酸，过氧亚硝酸能与鲁米诺产生化学发光反应，当NO浓度为100fmol／L～Inmol／L时，发光强度与NO量成正比．根据这一原理、利用化学发光分析建立了一种新的NOS活性测定方法。用该方法测量10只大鼠脑组织中的NOS活性，其NOS活性为28．3±6．9pmolNO／mg蛋白／min。     

对IMMULITE Ⅰ型化学发光酶免疫技术中检测原理及相关内容的初评

美国德普(DPC)公司开发成功的IMMULITE Ⅰ型酶放大化学发光自动化分析仪及其配套的各项检测试剂盒是在IMMULITE系统条件下发展完善的.它以聚苯乙烯塑料珠为固相载体, 碱性磷酸酶(APase)标记抗体(或抗原),并作用于发光底物AMPPD[3-(2'-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″磷酰氧基)苯基-1,2二氧乙烷].该仪器可完成单项、联合多项, 甚至十几项的常规项目物质浓度测定.每项检测原理及其反应模式不同.根据待测抗原的性质, 分子量大小, 各项试剂盒性能要求, 具体为每项检测内容设计了更为合理完美,结果准确的检测原理及其反应模式.信号数据处理也由自动化分析仪上电脑预先编制的软件完成, 备有多种标准曲线拟合方程, 以供不同免疫反应模式选择, 满足每项检测项目.本文在实践中了解和观察到32项常规项目的检测原理及相关内容, 用表格形式分析与初评如下.     

总PSA光激化学发光免疫分析法的建立

为了采用光激化学发光免疫分析技术建立快速定量检测总前列腺特异性抗原(tPSA)的方法。用两株配对的tPSA单克隆抗体,一株tPSA单克隆抗体包被受体微球,另一株tPSA单克隆抗体用生物素标记,与链霉亲合素的供体微球共同组成检测试剂。结果:自制tPSA试剂分析灵敏度为0.006ng/ml,线性测量范围为0.006～150ng/ml,分析内和分析间的精密度分别为3.90%～6.67%、4.71%～6.90%,与AFP、CA125、CA19-9和人白蛋白无明显交叉反应,136份临床血清样本用本试剂与罗氏化学发光试剂检测,其相关系数为0.979。提示:自制tPSA光激化学发光免疫分析试剂各项指标均能达到临床要求,有望替代国外同类产品。     

全自动酶放大化学发光免疫分析法与RIA法定量AFP的对比

近年来非放射标记免疫分析技术已逐渐推广应用.本文选用美国德普公司IMMULITE Ⅰ型酶放大化学发光分析法(以下简称发光法)与RIA进行了对比分析,并对患者血清样品若干批次的AFP进行了检测,结果报道如下.     

人外周血淋巴细胞化学发光测定的最佳实验条件探讨

本文采用正交设计对人外周血淋巴细胞(PBL)化学发光(CL)测定系统中的PBL、Luminol及ConA浓度进行分析比较,并探讨了新生牛血清(NCS)、牛血清白蛋白(BSA)、细胞保存温度与时间等对淋巴细胞化学发光(Ly-CL)的影响。结果表明,Ly-CL测定的最优实验条件为:(1)测定系统含1.0ml PBL悬液(1.4×10°/ml)、0.2ml Lumionl溶液(7×10~(-4)M)及0.2ml ConA溶液(700μg/ml);(2)分离的PBL悬于0.1％BSA-无酚红Hanks液中,4℃冰浴保存,2小时内完成测定。