外源性微卫星序列转染RER+细胞株观察肿瘤细胞遗传不稳定性的研究

目的利用ＲＥＲ（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｅｒｒｏｒ）表型的人肿瘤细胞株，在体外观察肿瘤细胞微卫星序列（ＭＳ）频发突变，研究人类肿瘤细胞基因组ＤＮＡ的遗传不稳定性。方法把含有人工合成的简单重复序列（ＣＡ）１４和ＬａｃＺ标志基因的重组质粒ｐＣＭＶ－ＣＡＲ经Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ方法转染ＲＥＲ＋或ＲＥＲ－人结肠癌细胞株。（ＣＡ）１４插入ＬａｃＺ编码序列之中，干扰了ＬａｃＺ基因的正确读码。当（ＣＡ）１４序列发生碱基缺失或插入突变，碱基数变为３的倍数时ＬａｃＺ基因读码框恢复，表达产生有生物活性的β－半乳糖苷酶。后者通过Ｘ－ｇａｌ染色检出。结果转染ｐＣＭＶ－ＣＡＲ的细胞克隆经Ｈｙｇｒｏｍｉｃｉｎ筛选并建株培养，观察到部份ＲＥＲ＋的质粒转染克隆，ＬａｃＺ能正确读码表达，经Ｘ－ｇａｌ染色试验，细胞变蓝。蓝细胞在建株培养后的传代过程中持续存在。而ＲＥＲ－细胞株，ｐＣＭＶ－ＣＡＲ转染克隆用Ｘ－ｇａｌ染色未见任何蓝色细胞。结论外源性（ＣＡ）１４序列在ＲＥＲ＋细胞转染克隆中可以发生碱基丢失或插入突变。直接反映了肿瘤细胞ＤＮＡ的不稳定性和复杂的突变状态。并提示外源性（ＣＡ）１４可为研究环境因素对人体肿瘤ＤＮＡ突变影响提供直接的观察指标     

造血生长因子促进RV介导LacZ—Neo^R基因在人骨髓造血细胞中 …

目的：本文探索了不同组合的造血生长因子ＳＣＦ、ＩＬ３及ＩＬ６对逆转录病毒（ＲＶ）介导的ＬａｃＺ－Ｎｅｏ＾Ｒ双标志基因转染人骨髓造血细胞转染效率、表达水平的影响及其相关机理。方法：采用ＲＶ转染人骨髓非粘附造血细胞（ＮＡＢＭＣ）及经ＳＣＦ、ＩＬ３及ＩＬ６不同组合预激４８ｈ后的ＮＡＢＭＣ。经荧光素二－β－Ｄ－半乳糖呋喃苷脂（ＦＤＧ）标记的半乳糖苷酶、Ｇ４１８＾ＲＣＦＵ－ＧＭ及ＰＣＲ／Ｓｏｕｒｔｈｅｒｎ－     

造血生长因子促进RV介导LacZ-NeoR基因在人骨髓造血细胞中转染的机制

目的：本文探索了不同组合的造血生长因子ＳＣＦ、ＩＬ３及ＩＬ６对逆转录病毒（ＲＶ）介导的ＬａｃＺ－ＮｅｏＲ双标志基因转染人骨髓造血细胞转染效率、表达水平的影响及其相关机理。方法：采用ＲＶ转染人骨髓非粘附造血细胞（ＮＡＢＭＣ）及经ＳＣＦ、ＩＬ３及ＩＬ６不同组合预激４８ｈ后的ＮＡＢＭＣ。经荧光素二－β－Ｄ－半乳糖呋喃苷脂（ＦＤＧ）标记的半乳糖苷酶、Ｇ４１８ＲＣＦＵ－ＧＭ及ＰＣＲ／Ｓｏｕｒｔｈｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测ＮｅｏＲ和ＬａｃＺ基因的表达。结果：早期造血生长因子（ＨＧＦｓ）的预激明显改善了ＲＶ介导的ＬａｃＺ－ＮｅｏＲ基因在人骨髓造血细胞中的转染效率与表达水平,ＳＣＦ＋ＩＬ３＋ＩＬ６＞ＳＣＦ＋ＩＬ３＞ＩＬ３＋ＩＬ６＞ＳＣＦ＋ＩＬ６。氚标记脱氧胸苷（３Ｈ－ＴｄＲ）自杀及５－溴脱氧尿苷－碘化丙啶（ＢｒｄＵ－ＰＩ）双标流式细胞仪（ＦＣＭ）检测显示,ＨＧＦｓ预激后人骨髓造血细胞及ＣＦＵ－ＧＭ的Ｓ期比例显著提高。结论：ＳＣＦ＋ＩＬ３＋ＩＬ６的联合预激可显著改善ＲＶ介导的外源基因在人骨髓造血细胞中的转染效率与表达水平,这可能与ＨＧＦｓ预激后明显提高人骨髓造血细胞及ＣＦＵ－ＧＭ的Ｓ期比例密切相关     

β—半乳糖苷酶基因的腺伴随病毒（AAV—2）载体的构建及其在…

以野生型２型人类腺伴随病毒（ＡＡＶ－２）全基因组载体（ｐＳＳＶ９和ｐＳＳＶ９－ｉｎｔ＾－）为基础，构建了重组ＡＡＶ载体ｐＳＳＶ９／Ｐ４０－ＬａｃＺ（＋）和ｐＳＳＶ９／Ｐ４０－ＬａｃＺ（－），制备ＡＡＶ重组病毒，感染宿主细胞后表达了β－半乳糖苷酶基因。此外，用脂质体转染法将载体导入２９３细胞和Ａ５４９细胞，进行了ＬａｃＺ基因瞬时表达研究。结果显示，重组ＡＡＶ载体（ｐＳＳＶ９／Ｐ４０－ＬａｃＺ（＋））     

E－选择素cDNA克隆和表达

从内皮细胞总ＲＮＡ中用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出Ｅ－选择素ｃＤＮＡ全长编码区，并将其克隆到ｐＵＣ１８载体中，构建了重组质粒ｐＵＣ１８／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ，对此质粒进行了酶切及ＤＮＡ序列分析鉴定。将Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎｃＤＮＡ插入到天坛株痘苗病毒载体ＳｍａＩ位点，构建了表达质粒ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ。采用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ方法，ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ转染ＴＫ－１４３细胞，用ＢｕｄＲ和ＬａｃＺ双筛选，获得带有人Ｅ－选择素ｃＤＮＡ的重组痘苗病毒。经活细胞荧光染色和ＡＰＡＭ检测，重组痘苗病毒能有效地表达人Ｅ－选择素ｃＤＮＡ。     

ER阳性和ER阴性人乳腺癌细胞株p53,mdm—2及p21^WAF1蛋白表达…

目的 研究ＥＲ阳性和ＥＲ阴性人乳腺癌细胞株ｐ５３、ｍｄｍ－２和ｐ２１＾ＷＡＦ１蛋白的表达及其与细胞生物学特性的关系。方法 应用细胞培养、基因转染和免疫组化染色ＬＳＡＢ法等技术，检测ＥＲ阳性、表达野生型ｐ５３（ｗｔｐ５３）蛋白的ＭＣＦ－７细胞和ＥＲ阴性、表达突变型ｐ５３（ｍｔｐ５３）和ＭＤＡ－ＭＢ－２３１细胞以及ＥＲ转染阳性ＭＤＡ－ＭＢ－２３１细胞中ｐ５３、ｍｎｍ－２和ｐ２１＾ＷＡＦ１蛋白的表达水平     

DNA修复蛋白MGMT基因的克隆及转导脐血CD23^＋细胞后耐药特征的研究

目的：增强脐血ＣＤ３４＾＋造血细胞对化疗药物的耐药表型,探讨逆转录病毒介导的基因转移效率和耐药基因特性,以及在脐血造血干细胞保护性基因治疗中的作用和意义。方法：应用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）从人肝细胞中获得编码六氧甲基鸟嘌呤－ＤＮＡ－甲基转移酶（Ｏ＾６－ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ－ＤＮＡ－ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ,ＭＧＭＴ）ｃＤＮＡ;利用基因重组技术,将其克隆于ｐＧＥＭ－Ｔ质粒载体并构建了逆转录病毒载体Ｇ１Ｎａ－ＭＧＭＴ;应用脂质体ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ基因转移法将后者导入ＧＰ＋Ｅ８６和ＰＡ３１７病毒包装细胞,以卡氮芥１,３－Ｂｉｓ（２－Ｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌ）－１－Ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ（ＢＣＮＵ）加压筛选后的阳性克隆上清经乒乓效应后继而感染脐血ＣＤ３４＾＋细胞。应用ＰＣＲ,Ｓｏｕｔｈ     

人单核细胞超化蛋白—1（MCP—1）基因的PCR扩增,克隆…

本文报道用植物血凝素（ＰＨＡ）诱导健康人外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ，包括单核细胞和淋巴细胞），提取细胞总ＲＮＡ，反转录合成ｃＤＮＡ第一链，再以其为模板进行ＰＣＲ，得到了编码成熟单核细胞趋化蛋白－１（ＭＣＰ－１）的ｃＤＮＡ。该ｃＤＮＡ用ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ双酶切后，回收含ＭＣＰ－１基因的长约２８０ｂｐ的ＤＮＡ片段，插入到经ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ双酶切的ｐＵＣ１９载体中，进行序列分析。结果表明，ＭＣ     

山莨菪碱对蛛网膜下腔出血后基底动脉产生EDRF的作用及抗…

用山莨菪碱（６５４－２）防治蛛网膜下腔出血（ＳＡＨ）后脑血管痉挛，观察６５４－２对基底动脉中ＥＤＲＦ，ＭＤＡ，ＳＯＤ，ｃＧＭＰ，Ｃａ＾２＋，Ｎａ＾２＋的影响。结果表明，应用６５４－２后降低了基底动脉中ＭＤＡ产生及Ｃａ＾２＋Ｎａ＾＋的含量，与ＳＡＨ组比，ＥＤＲＦ释放增加，ＳＯＤ活性及ｃＧＭＰ水平提高，基底动脉内皮细胞受到保护，基底动脉收缩幅度减小。提示，６５４－２可通过保护内皮细胞，减轻氧自由基损伤     

系统性红斑狼疮患者B淋巴细胞EBV-LMP1和ZEBRA的表达研究

目的：探讨ＥＢＶ－ＬＭＰ１和ＺＥＢＲＡ在系统性红斑狼疮患者（ＳＬＥ）的表达情况。方法：间接荧光免疫标记，流式细胞仪检测。结果：ＳＬＥ患者Ｂ淋巴细胞中ＥＢＶ－ＬＭＰ１和ＺＥＢＲＡ的表达显著高于正常对照组（Ｐ＜０．０１）。活动期患者ＣＤ２３＋细胞ＥＢＶ－ＬＭＰ１和ＺＥＢＲＡ的表达率均高于ＣＤ１９＋细胞（Ｐ＜０．０１）。非活动期患者ＣＤ２３＋细胞ＥＢＶ－ＬＭＰ１表达也高于ＣＤ１９＋细胞（Ｐ＜０．０１）。但ＥＢＶ－ＺＥＢＲＡ表达在两亚群间差异没有统计学意义（Ｐ＞０．０５）。结论：朋病毒参与了ＳＬＥ的发病机制，病毒主要以潜伏期状态存在于患者中，病毒复制促进病情发展，检测Ｂ淋巴细胞ＥＢＶ－ＬＭＰ１和ＺＥＢＲＡ的表达率，有助于病情活动指标的判断。     

SLE患者AMLR与T细胞Ia抗原的改变及意义

本文以氚标胸腺嘧啶（＾３Ｈ－ＴｄＲ）掺入的淋巴细胞转化试验测定非Ｔ细胞刺激自身Ｔ细胞的增殖反应（ＡＭＬＲ）；用单克隆抗体（ＭｃＡｂ）Ｗｕ３５和Ｗｕ２２通过ＰＡＰ免疫酶标组化技术测定ＣＤ３＾＋，ＣＤ４＾＋，Ｃｄ８＾＋Ｔ细胞表面ＤＲ及ＤＱ抗原的表达。结果表明，活动期ＳＬＥ患者ＡＭＬＲ有明显减弱，Ｗｕ＾３５＋（ＨＬＡ－ＤＲ＾＋）Ｔ细胞增加为主，ＣＤ８＾＋ＤＲ＾＋及ＣＤ８＾＋ＤＱ＾＋细胞则表现为减少。提示     

抗原基因修饰的树突状细胞诱导机体产生特异性免疫应答的实？…

目的：探讨腺病毒介导的肿瘤抗原基因修饰的树突状细胞体内免疫后对抗原特异性抗肿瘤免疫反应的诱导作用。方法：以β－ｇａｌ为模拟抗原,以转染有ＬａｃＺ基因并稳定表达βｇａｌ的淋巴瘤细胞Ｅ２２为肿瘤细胞模型,用携带编码β－ｇａｌ的ＬａｃＺ基因的重组腺病毒载体转染小鼠骨髓ＤＣ,检测转染的效率及ＬａｃＺ基因修饰ＤＣ刺激Ｔ细胞增殖的能力,观察皮下免疫ＬａｃＺ基因修饰ＤＣ后小鼠引流区淋巴结细胞数量和组分的变化以及     

恶性疟原虫六个保护性抗原表位基因的化学合成及克隆

本文设计并化学合成一条含有恶性疟原虫裂殖子表面抗原（ＭＳＡ１、ＭＳＡ２）、环子孢子蛋白（ＣＳＰ）、环状体感染红细胞表面抗原（ＲＥＳＡ）等不同生活史期的４种抗原，共６个表位的复合基因（ＰｆＣＭＲ）。该基因含２个粘性未端，共分８个片段，采用“缺口填补法”接成双链ＤＮＡ，再与噬菌体Ｍ１３ｍｐ１８分别经ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ双酶切后回收、纯化、重组，并转化ＥｃｏｌｉＪｍ１０９，经ＰＣＲ和酶切鉴定，ＤＮＡ序列分析测定，证实阳性克隆子Ｍ１３ｍｐ１８－Ａ４与预设计基因顺序完全一致。     

洛沙坦对大鼠心肌梗死时心肌细胞的作用

应用Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ灌流方法,分离培养成年大鼠心肌细胞（ＭＣ）,并借助同位素标记的底物掺入法,观察在不同处理因素下,洛沙坦对大鼠梗塞ＭＣ的ＲＮＡ（＾１４Ｃ－ＵＲ）的蛋白质（＾３Ｈ－Ｌｅｕ）合成率的影响。结果发现,在相同浓度的ＡｎｇⅡ（１０＾－７ｍｏｌ／Ｌ）的作用下,心肌梗塞对照组（ＣＭＩ）的ＭＣ,其＾１４Ｃ－ＵＲ和＾３Ｈ－Ｌｅｕ掺入率均显著高于假手术（ＳＯ）组;而两干预组（ＭＩ＋Ｌｏｓ组和Ｍ     

β－半乳糖苷酶基因的腺伴随病毒（AAV－2）载体的构建及其在哺乳类细胞中的表达

以野生型２型人类腺伴随病毒（ＡＡＶ－２）全基因组载体（ｐＳＳＶ９和ｐＳＳＶ９－ｉｎｔ－）为基础，构建了重组ＡＡＶ载体ｐＳＳＶ９／Ｐ４０－ＬａｃＺ（＋）和ｐＳＳＶ９／Ｐ４０－ＬａｃＺ（－），制备ＡＡＶ重组病毒，感染宿主细胞后表达了β－半乳糖苷酶基因。此外，用脂质体转染法将载体导入２９３细胞和Ａ５４９细胞，进行了ＬａｃＺ基因瞬时表达研究。结果显示，重组ＡＡＶ载体（ＰＳＳＶ９／Ｐ４０－ＬａｃＺ（＋））ＬａｃＺ基因表达的动态变化特点是，转染后表达较早（１２～２４ｈ）出现，并迅速达到高峰值（经２４ｈ），随后较快下降（经４８～７２ｈ）并维持在较低水平。将启动子附近ｉｔｒ结构有差别的上述两载体转染宿主细胞７２ｈ后做表达水平比较，结果ｐＳＳＶ９／Ｐ４０－ＬａｃＺ（－）在２９３细胞和Ａ５４９细胞中，ＬａｃＺ表达水平均高于ｐＳＳＶ９／Ｐ４０－ＬａｃＺ（＋）（１．２倍～１．４倍），提示启动子附近ＡＡＶｉｔｒ结构的变异对表达有一定的影响。     

人白细胞介素4在大肠杆菌中的优化表达

目的：通过优化设计利用大肠杆菌表达人白细胞介素４（ＩＬ４） 并提高其表达量。方法：根据原核翻译起始序列的局部二级结构自由能,设计了ＡＵＧ 上下游序列,并在人ＩＬ４ 基因下游插入部分大肠杆菌ＬａｃＺ 序列以提高ｍＲＮＡ 的稳定性。结果：成功地构建了人ＩＬ４ 的高效表达克隆,命名为ｐＬＣＭ１８２ｈＩＬ４ 。ＳＤＳＰＡＧＥ 分析显示所表达的重组ＩＬ４ 蛋白质占细菌总蛋白的３０ ％ 。目的基因下游没有插入ＬａｃＺ序列所构建的表达克隆ｐＣＺＨｈＩＬ４ 在大肠杆菌中的表达量则占细菌总蛋白的２０ ％ 左右。结论：所设计的优化表达方法对人ＩＬ４ 基因的表达是成功的,在细胞因子的工程化表达中,优化设计对基因的表达量至关重要。     

玉竹提取物B对肿瘤的抑制作用

目的：玉竹提取物Ｂ（Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｂ ｏｆ ｐｏｌｙ－ｇｏｎａｔｕｍ ｏｄｏｒａｔｕｍ,ＥＢ－ＰＡＯＡ）对肿瘤的抑制作用。方法：检测肿瘤细胞株ＣＥＭ增殖和表面分子表达以及观察对小鼠Ｓ－１８０移植瘤的抑制作用。结果：玉竹提取物Ｂ１０＾－３ｍｌ＾－１（Ｖ／Ｖ,以下同）浓度对ＣＥＭ的增殖有显著的抑制作用,并捉进ＣＥＭ表面分子ＨＬＡ－Ｉ分子、ＣＤ２和ＣＤ３的表达,尤其对ＣＤ２分子的表达作用更为显著     

人核糖体磷酸蛋白P2基因的克隆及鉴定

利用聚合酶链式反应技术（ＰＣＲ），从人肺巨细胞癌ＰＬＡ－８０１母系细胞系统克隆化高转移细胞株Ｄ中特异性扩增Ｐ２ ｃＤＮＡ（Ｈｕｍａｎ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｐ２ ｇｅｎｅ ｃＤＮＡ），并将扩增产物克隆入ｐＧＥＭ－３Ｚ载体，获得了重组质粒ｐＭＰ２，对其中两个克隆ｐＭＰ２－１、ｐＭＰ２－２的Ｐ２ ｃＤＮＡ进行了序列分析。结果表明：ｐＭＰ２－１的Ｐ２ｃＤＮＡ序列与文献报道基本     

中性粘多糖对脑缺血再灌注沙土鼠红细胞β—内啡肽和免疫？…

目的 观察中性粘多糖（ｎｅｕｔｒａｌ ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ＮＭ）对缺血再灌注沙土鼠红细胞β－内啡肽（β－ｅｎｄｏｒｐｈｉｎβ－ＥＰ）和免疫粘附功能（ｒｅｄ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｅ ａｄｈｅｒｅｎｃｅ，ＲＣＩＡ）的影响，进一步探讨ＮＭ对防治缺血再灌注脑组织损伤的机理。方法 采用蒙古种沙土鼠缺血再灌注模型分别测定红细胞β－ＥＰ（ＲＢＣ－β－ＥＰ）以及ＲＣＩＡ，观察两者相互关系。结果     

人补体膜辅助调节蛋白MCP的基因克隆及共真核表达的研究

目的 克隆获得编码人补体膜辅助调节蛋白（ＭＣＰ）的ｃＤＮＡ，并对其在真核细胞的表达及功能进行研究。方法 应用ＲＴ－ＰＣＲ 方法，从Ｕ９３７细胞总ＲＮＡ中扩增编码人ＭＣＰ分子的ｃＤＮＡ片段，快速克隆于ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ载体，测定共序列。将该片段重组于ｐＬＸＳＮ载体，电穿孔转染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，经ＦＡＣＳ检测筛选表达ＭＣＰ的阳性细胞克隆，用补体容破试验鉴定其抑制人补体溶破的功能。结果 ＲＴ－ＰＣＲ