体外分离培养猪虹膜色素上皮细胞的生物学评价

目的 :培养猪的虹膜色素上皮 (IPE)细胞并进行IPE的生物学评价 ,为IPE移植治疗视网膜色素变性 (RP)打下基础。方法 :采用酶辅助的显微分离法对 5 0只猪眼进行IPE的原代和传代培养 ,免疫组化方法鉴定细胞 ,并对其生物学性状进行评价。结果 :从IPE生长曲线上看 ,细胞于接种后 2天开始进入细胞对数生长期 ,经过 3～ 4天的对数期生长后进入生长缓慢的平台期。细胞培养成功率为 85 0 %。原代细胞的贴壁率为 31 8%± 3 7% ,细胞的活力为 82 5 %± 5 1% ,传代细胞的贴壁率为 86 4 %± 4 3% ,细胞的活力为 91 2 %± 3 7%。伸展率为 83 6 %± 5 3% ,分裂时间为 2～ 7天 ,平均 3 5± 0 96天 ,总分裂次数为 6～ 10代。免疫组织化学显示 ,培养获得的IPE细胞的细胞角蛋白 (AE1/AE3)和S 10 0抗原染色均为阳性。结论 :对IPE细胞的生物学评价 ,不仅证实了IPE细胞高效纯化培养的实现 ,而且系列完整的数据为IPE移植治疗RP的相关实验提供了必要的基础保证     

视网膜脱离状态下色素上皮细胞的凋亡变异

目的探讨视网膜脱离(RD)后色素上皮(RPE)细胞的凋亡.方法制造有色眼家兔的RD模型,以流式细胞仪(FCM)技术分析RD后28天内RPE细胞的凋亡变化.结果RD后8hRPE细胞凋亡显著增加,第7天达顶峰,凋亡细胞平均数由正常的131.67±35.67上升至1196.2±238,凋亡率由正常的0.70%±0.21%上升至5.98%±1.21%,然后缓慢下降,第28天仍显著高于正常.结论RD可导致RPE细胞的凋亡.RD后28天内,随时间延长,RPE凋亡增加.     

兔眼视网膜脱离后视网膜谷氨酸含量与视网膜色素上皮细胞增殖的关系

目的研究兔眼孔源性视网膜脱离(retinal detachment,RD)后不同时程视网膜内谷氨酸(glutamate,Glu)含量变化及视网膜色素上皮(vetinal pigment epithelial,RPE)细胞增殖状况及其2者之间的关系.方法42只有色家兔,按时间随机分为6组8h,1、4、7、14及28d.任选1眼制备RD模型,另1眼为对照眼.各组采用高压液相色谱仪(HPLC)及流式细胞仪(FCM)分别对视网膜内Glu浓度及RPE细胞DNA进行定量检测,并寻找2者之间的相互关系.结果RD后8h,视网膜内Glu含量明显升高(4.68±1.22)μmol·g-1,与对照眼(1.87±0.81)μmol·g-1相比具有显著性差异(P＜0.001);但随着脱离时间的推移,至14d,视网膜内Glu含量明显回降(3.78±0.88)μmol·g-1,与对照眼(1.57±0.66)μmol·g-1相比无显著性差异(P＞0.05).RPE细胞的增殖指数(PI)在RD后8h明显增加(18.41%±0.22%),与对照眼(16.62%±0.69%)相比差异有显著性(P＜005);但28d组实验眼(16.70%±0.88%)与对照眼(15.41%±2.44%)的差异则无显著性意义(P＜0.05).且视网膜内Glu含量变化与RPE细胞的PI值呈显著正相关关系(r=0.436,P＜0.01).结论视网膜脱离后RPE细胞发生增殖与视网膜内Glu浓度异常增高有密切关系.     

机械牵拉对培养人视网膜色素上皮细胞增生和移行的影响

目的视网膜脱离和眼内增生性病变形成时,视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞层可能会受到牵拉力的作用。本实验旨在观察培养人RPE细胞在受机械牵拉力时增生和移行的变化。方法将胶原包被的磁珠悬液加入培养人RPE细胞后孵育,附着磁珠的细胞放置在恒定磁场中,分别于不同时间点用MTT比色实验和3H-TdR掺入试验检测细胞的增生情况,用融合单层培养RPE细胞部分缺失模型观察细胞移行变化。此外,观察去炎松对机械牵拉条件下RPE细胞增生和移行的影响。结果机械牵拉在急性期促进了RPE细胞的增生和移行。去炎松呈剂量依赖性抑制这一作用。在机械牵拉作用下15min和30min时的增生促进率分别为15.72%±0.46%(P=0.037)、24.80%±0.23%(P=0.003)。机械牵拉作用下30min时,移行促进率为23.67%±2.53%(P:0.031)。结论机械牵拉能促进RPE细胞的增生和移行,这一过程可能参与视网膜脱离或眼内增生性疾病的发生。     

兔眼虹膜色素上皮细胞体外生物学特性研究

目的观察体外培养兔眼虹膜色素上皮(irispigmentepithelium,IPE)细胞的生物学特性,为IPE移植治疗老年性黄斑变性等疾病打下基础。方法应用扫描电镜、透射电镜对所培养IPE细胞的超微结构进行观察,并通过细胞的贴壁率、伸展率、倍增时间、总分裂次数的测定以及生长曲线的绘制对其在体外生长的生物学特性进行研究。结果体外培养的IPE细胞呈多角形,细胞内有色素颗粒和丰富的细胞器,细胞表面有长短粗细不等的微绒毛,生长成为具有尖基底极性的细胞单层。IPE细胞伸展率为81.5%±3.7%;原代IPE细胞的贴壁率为32.18%±3.18%;传代培养的IPE细胞的贴壁率为86.20%±2.84%;细胞倍增时间为2～7d,平均为(3.46±2.10)d;细胞总分裂次数为6～10代。结论体外培养IPE细胞与体内生长IPE细胞有着相似的生物学特性,通过对IPE细胞体外生物学特性的研究,为进一步探索其功能和自体移植提供了必要的实验基础。     

生长激素释放多肽对高糖诱导视网膜色素上皮细胞的保护作用

目的：探讨生长激素释放多肽(Ghrelin)对高糖环境下人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞氧化应激的影响。

方法：将体外培养的RPE细胞分为阴性对照组、高糖组、Ghrelin低浓度组、Ghrelin高浓度组。通过CCK-8法检测细胞存活率,氧敏感荧光探针H₂DCFDA染色法观察细胞氧化损伤程度,流式细胞技术检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的变化,分光光度计比色法检测细胞内超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量。

结果：CCK-8结果显示,分别用10^-9mol/L、10^-6mol/L Ghrelin预处理后,RPE细胞存活率分别为54.79%±3.43%和79.16%±3.29%,与高糖组(41.65%±3.42%)比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。H₂DCFDA荧光探针染色结果显示,Ghrelin预处理后RPE细胞内ROS生成量下降,氧化损伤细胞减少。分光光度计比色法结果显示,与高糖组相比,Ghrelin组细胞SOD活力增加,MDA含量下降。

结论：Ghrelin可以抑制高糖诱导的人RPE细胞氧化损伤,其在糖尿病视网膜病变的发生发展过程中可能具有一定的细胞保护作用。     

Cyclosporine玻璃体腔内注射对异种视网膜色素上皮移植的排异抑制作用

目的 观察兔眼视网膜下腔植入人胚眼视网膜色素上皮（retinal pigment epithe-lium,RPE）后不同时期的眼底和组织学改变。研究环胞菌素A（Cyclosporines,CsA）玻璃体腔内注射能否抑制人胚眼RPE在兔眼视网膜下腔中诱导的异种移植排异反应。方法 人胚眼色素上皮片和浓缩色素上皮细胞悬液植入36只兔眼的视网膜下腔,其中16眼为对照组,用于观察排异的自然转规。分别7d(8眼）和30d(8眼）后获取组织标本。另20眼为实验组。RPE移植后,每周一次玻璃体腔内注射CsA 1mg(12眼）或CsA0.1mg(8眼）。视网膜和视神经的毒性反应使用ERG进行检查。结果 人胚眼RPE片和浓缩的RPE细胞均能在视网膜下腔短期存活。移植的RPE与视细胞结合良好并显示吞噬功能。排异反应发生时间约在术后10～30d。对照组中7d的排异发生率为0/8;30d排异发生率为7/8。排异发生后荧光造影中移植区为高荧光区,组织切片中显示有大量的组织细胞积聚。CsA1mg组30d排异发生率为0/12,0.1mg组为5/8。ERG波幅的下降与CsA剂量和注射次数呈正相关。结论 异种RPE视网膜下腔移植在无免疫抑制剂的条件下,只能短期存活。CsA玻璃体腔中注射能抑制异种RPE移植的排异反应但易引起明显的视网膜毒性反应。     

多巴胺D2受体和腺苷A2A受体在人视网膜色素上皮细胞表达的研究

目的探讨正常人眼视网膜色素上皮（RPE）细胞多巴胺D2受体和腺苷A2A受体表达情况。方法采用已建立的RPE细胞的分离和培养方法建立细胞株。取传3—4代生长良好的细胞,应用逆转录聚合酶链式反应（RT—PCR）、细胞免疫组化方法检测培养的RPE细胞中多巴胺D2受体和腺苷A2A受体的表达情况。结果培养的RPE细胞呈多边形,平均分裂时间为2—3d,细胞内含有棕黄色色素颗粒,随着细胞分裂,细胞内的色素颗粒稀释和变少。RT—PCR和细胞免疫组化检测,显示体外培养的人RPE细胞两种受体均有表达。结论人RPE细胞有多巴胺D2受体和腺苷A2A受体的分布。     

热休克蛋白70在TTT小鼠视网膜中的表达

目的　研究热休克蛋白 70 (heatshockprotein 70 ,HSP 70 )在经瞳孔温热疗法(transpupillarythermotherapy ,TTT)小鼠视网膜中的表达。方法　首先对10只C57BL/ 6J小鼠进行TTT照射,激光功率5 0mW ,光斑直径1.2mm ,曝光4 0s,然后分别于激光后2h ,1d、3d ,1周、2周取材,采用免疫组化方法检测视网膜内核层HSP 70的表达情况,计算其阳性率及强阳性率。结果　HSP 70蛋白存在于正常C57BL/ 6J小鼠除视杆、锥细胞外节的视网膜各层细胞,TTT后小鼠视网膜内核层细胞HSP 70表达有一动态变化,2h时阳性表达细胞(阳性率和强阳性率分别为6 6 .85 %±4 .83% ,4 .91%±3.19% )即较正常视网膜明显增加,1d时达到高峰(78.12 %±8.0 9% ,8.15 %±3.4 5 % ) ,然后逐步下降,2周时(3.74 %±1.73% ,0 .5 5 %±0 .2 7% )已基本接近正常水平(2 .91%±0 73% ,0 )。结论　TTT引起的视网膜温度轻微升高可以诱导小鼠视网膜内核层细胞HSP 70的过度表达,从而提高其耐热能力,发挥内源性保护作用,减小TTT靶组织邻近部位的损伤     

蓝光致人视网膜色素上皮细胞凋亡与线粒体膜电位和细胞色素C的关系

目的探讨蓝光光照对体外培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞凋亡及对线粒体膜通透性转运功能的影响。方法用蓝光光照体外培养的人RPE细胞。实验分为三部分。第一部分:不同光照度,分为3组,第1组光照度(500±100)lx,第2组光照度(2000±500)lx,第3组光照度(3000±500)lx;光照RPE细胞时间6h,光照结束后24h终止培养。第二部分:同一光照度、不同光照时间,检测RPE细胞亚型时分为3组,第1组光照时间6h,第2组光照时间12h,第3组光照时间24h,光照度均为(2000±500)lx;检测线粒体膜电位时也分为3组,第1组光照时间3h,第2组光照时间6h,第3组光照时间12h,光照度均为(2000±500)lx。第三部分:同一光照度和光照时间,光照度(2000±500)lx,光照RPE细胞时间6h;不同细胞培养终止时间分为4组,第1组终止细胞培养时间为光照后6h,第2组为光照后12h,第3组为光照后24h,第4组为光照后36h。利用末端脱氧核糖核酸转移酶介导的原位缺口末端标记(TUNEL)染色、荧光素标记的AnnexinV-FITC和PI双染流式细胞检测、透射电镜等手段观察RPE细胞凋亡情况。罗丹明123荧光染料孵育人RPE细胞,流式细胞仪检测线粒体膜电位,酶联免疫法测定细胞色素C活性,比色测定法测定Caspase-3的活性。结果第二部分第1组TUNEL染色阳性细胞的体积缩小变圆,胞核浓缩,边聚成新月形或帽状,细胞核碎裂成数个,细胞膜出胞。透射电镜观察发现细胞内线粒体肿胀,线粒体内膜嵴消失,粗面内质网扩张,溶酶体增加。第一部分(500±100)lx光照未引起明显的RPE细胞损伤,但线粒体膜电位明显下降;随着光照度增加,RPE细胞出现凋亡、凋亡继发性坏死及坏死,同时线粒体膜电位逐渐下降。第二部分光照6和12h,凋亡细胞百分比增加,荧光强度明显下降;光照24h凋亡继发性坏死细胞、坏死细胞百分比增加。第三部分光照后6和12h,RPE细胞凋亡百分比逐渐增加;光照后24、36h凋亡继发性坏死细胞和坏死细胞百分比明显增加,光照后各时间点RPE细胞荧光强度明显下降。以光照度(2000±500)lx照射6和12h,可见光照后24和36h两组的细胞色素C浓度明显升高,未检测到Caspase-3活性变化。结论蓝光照射可导致体外培养的人RPE细胞凋亡、凋亡继发性坏死及坏死,其损伤程度与光照度和时间相关;蓝光照射导致培养的人RPE细胞损伤过程与线粒体膜电位降低、细胞色素C释放有关;线粒体膜电位可作为检测蓝光致人RPE细胞凋亡的早期指标。