利塞膦酸钠抑制大鼠骨髓内脂肪细胞分化及脂肪细胞核因子κB受体活化因子配体蛋白的表达

目的研究利塞膦酸钠（RIS）对大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化的影响及对骨髓内脂肪细胞来源的核因子κB受体活化因 子配体（RANKL）的调节作用,为阐明RIS抗骨质疏松的机制提供新的理论依据。方法大鼠骨髓间充质干细胞成脂诱导及非 成脂诱导14 d,期间以浓度梯度0、1、5、10、25 μmol/L的RIS进行药物干预,观察并计算成脂率,提取蛋白通过Western blot实验 检测RANKL蛋白表达。将24周的SD大鼠随机分成假手术组及OVX组,12周后OVX大鼠再次随机分为RIS干预组（2.4 μg/kg, 皮下注射,3次/周）及对照组。8周后行骨密度检查,并取大鼠左股骨远端骨骼标本行病理检查,观察RIS对大鼠骨髓内脂肪含 量的影响。结果体外实验发现RIS呈浓度依赖性抑制大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化,并且,随着RIS浓度的升高,骨 髓内脂肪细胞RANKL蛋白的表达逐渐降低（P<0.05）。体内实验发现RIS药物干预后,OVX大鼠骨密度显著提升的同时,骨髓 内脂肪的含量明显降低（P<0.05）。结论RIS可有效抑制大鼠骨髓间充质干细胞的成脂分化,降低骨髓内的脂肪含量,并通过下 调脂肪细胞RANKL的表达,抑制破骨细胞的生成和功能,这可能是RIS发挥抗骨质疏松作用的机制。     

atRA抑制大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化

目的探讨高浓度全反式视黄酸(all-trans retinoic acid,atRA)抑制大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrowmesenchymal stem cells,BMSCs)向脂肪细胞分化的机制。方法体外分离、培养和诱导大鼠BMSCs;在成脂诱导液中加入0.1、0.5、1.0、5.0μmol/L atRA,光学显微镜下观察细胞形态及油红O染色变化;油红O染色提取法分析不同浓度atRA对BMSCs成脂分化的影响;real-time PCR测定细胞视黄酸受体(RARα、RARγ)、CCAAT增强子结合蛋白α(CEBPα)及过氧化物酶体增殖激活受体γ2(PPARγ2)mRNA水平的变化。结果细胞形态及油红O染色观察发现,在0.1、0.5、1.0、5.0μmol/L atRA作用下大鼠BMSCs向脂肪细胞分化受到抑制,且呈浓度依赖性;油红O染色提取法半定量测定结果显示,随着atRA浓度升高,分化细胞内脂肪含量降低(P<0.01);real-time PCR检测显示与血清组(未加atRA)相比,加入atRA后,大鼠BMSCs的CEBPα和PPARγ2表达显著降低(P<0.05),RARα表达无显著差异[血清组vs 1.0μmol/L atRA组:(0.008 4±0.001 9)vs(0.009 1±0.001 3),P>0.05],但RARγ表达显著增加[血清组vs 1.0μmol/L atRA组:(0.022 6±0.001 2)vs(0.053 1±0.002 3),P<0.01]。结论 0.1、0.5、1.0、5.0μmol/L atRA可抑制大鼠BMSCs向脂肪细胞分化,其机制可能与RARγ的上调及CEBPα、PPARγ2的下调有关。     

代综方对3T3-L1脂肪细胞分化及相关基因表达的影响

目的：研究代综方（Dai Zong Fang,DZF）对3T3-L1脂肪细胞分化及分化过程中相关基因表达的影响。方法：体外培养3T3-L1前脂肪细胞,鸡尾酒式诱导脂肪细胞分化,给予不同浓度DZF干预6 d。BODIPY493/503与DAPI双荧光染色观察脂肪细胞分化情况;甘油磷酸氧化酶-过氧化物酶法测定细胞内甘油三酯（triglyceride,TG）含量;RT-PCR检测CCAAT增强子结合蛋白-α（CCAAT enhancer binding protein-α,C/EBP-α）、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（peroxisome proliferator activated re－ceptor-γ,PPAR-γ）、乙酰辅酶A 羧化酶（acetyl-CoA carboxylase,ACC）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase,FAS）的mRNA表达;Western blot法检测PPAR-γ、C/EBP-α的蛋白表达。结果：DZF抑制脂肪细胞分化,降低细胞内TG含量,并呈剂量依赖效应;与对照组比较,DZF大剂量组明显下调ACC的mRNA表达（P<0.05）,DZF小中大剂量均明显下调FAS的mRNA表达（P<0.01）;与对照组比较,DZF中、大剂量组明显下调C/EBPα、PPAR-γ的mRNA表达（P<0.01）,Western蛋白表达结果与mRNA结果一致。结论：DZF能够明显抑制3T3-L1脂肪细胞的分化程度,其机制可能与下调C/EBPα、PPAR-γ、ACC、FAS基因的表达有关。     

PPARδ激动剂GW501516对大鼠骨髓基质干细胞分化的作用

目的：探讨过氧化物酶体增殖激活受体δ( PPAR δ)激动剂GW501516对大鼠骨髓基质干细胞( BMSCs)向成脂和成骨方向分化的作用。方法全骨髓培养法培养大鼠原代BMSCs后采用差速贴壁法纯化,流式细胞仪鉴定其细胞表面标志物,实验分为PPAR δ激动剂组和对照组,分别进行成骨和成脂方向诱导培养,荧光定量PCR检测成骨细胞分化标志物(碱性磷酸酶、骨钙素)和脂肪细胞分化标志物(脂肪酸结合蛋白2、脂连素) mRNA的表达,油红O 染色检测脂肪细胞分化,茜素红染色检测成骨细胞矿化情况。结果与对照组比较,PPAR δ激动剂促进BMSCs向成骨细胞方向分化标志物表达,抑制向脂肪细胞方向分化标志物表达。茜素红染色显示PPAR δ激动剂组细胞矿化结节较对照组增加,油红染色显示PPAR δ激动剂组脂肪小滴明显减少。结论 PPAR δ激动剂促进BMSCs向成骨方向分化,抑制其向成脂方向分化。     

Ⅰ型胶原对脂肪细胞分化的影响及其分子机制初探

目的 观察不同浓度的Ⅰ型胶原(type Ⅰ collagen,Col Ⅰ)对3T3-L1前脂肪细胞诱导分化为成熟脂肪细胞的影响,初步分析其可能的作用机制.方法 3T3-L1前脂肪细胞诱导分化过程中加入不同浓度的Ⅰ型胶原:①采用MTT法检测3T3-L1前脂肪细胞的增殖;②油红O染色法观察分化成熟脂肪细胞形态学变化;③免疫印迹法测定脂肪细胞分化转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators-activated receptorγ,PPARγ)和CCAAT增强子结合蛋白α(CCAAT/enhan-cer-binding proteinα,C/EBPα)蛋白表达水平.结果 不同浓度Ⅰ型胶原干预后,各组3T3-L1前脂肪细胞的增殖与对照组比无显著变化.随着Ⅰ型胶原浓度升高,油红O染色逐渐变浅,提示分化成熟的脂肪细胞逐渐减少.脂肪细胞分化转录因子PPARy和C/EBPα的蛋白表达水平逐渐降低,呈剂量依赖性,且浓度为10-5mol/L和10-4mol/L时与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 Ⅰ型胶原在本实验中不影响3T3-L1前脂肪细胞增殖,但呈剂量依赖性抑制其向成熟脂肪细胞分化,下调脂肪细胞分化转录因子PPARγ和C/EBPα的表达可能是其作用机制之一.     

PPARγ基因修饰对兔骨髓间充质干细胞成脂分化及ADRP、LPL表达的影响

目的观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）基因转染对免骨髓间充质干细胞（MSCs）向脂肪细胞分化的影响,探讨PPARγ在脂肪细胞早期分化中可能的调控机制。方法原代培养新西兰大白兔MSCs,应用脂质体介导法将pEGFP-N1-PPARγ表达载体转入MSCs中,G418筛选。分成不诱导组、空转染诱导组及转染诱导组以成脂诱导剂诱导分化,每日观察细胞形态学变化,镜下计数并计算脂肪细胞分化率,采用RT-PCR方法检测脂肪分化相关蛋白（ADRP）、脂蛋白脂酶（LPL）mRNA表达,Western blot检测ADRP、LPL蛋白表达。结果不诱导组细胞内没有脂滴出现,空转染诱导组和转染诱导组部分细胞成功分化为脂肪细胞,转染诱导组分化率明显高于空转染诱导组（P〈0.05）;不诱导组ADRP、LPLmRNA及蛋白均不表达,转染诱导组ADRP、LPLmR-NA及蛋白表达水平显著高于空转染诱导组（P〈0.05）。结论PPAR-γ基因转染MSCs可促进其向脂肪细胞分化,增强其分化能力,可能与促进ADRP、LPL基因和蛋白的表达有关。     

COA: siRNA靶向PPARγ基因重组腺病毒穿梭载体对激素诱导兔骨髓间充质干细胞成脂分化的抑制作用

背景：激素是诱发股骨头坏死（osteonecrosis of the femoral head,ONFH)的重要原因之一,可导致骨细胞内脂肪沉积而变性坏死从而抑制成骨分化及骨的形成。过氧化物酶体增殖子活化受体-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ,PPARγ)是一种成脂转录因子,ONFH的发生与PPARγ在骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）的高表达有密切关系。BMSCs具有分化为成骨细胞与脂肪细胞的潜能,BMSCs内PPARγ高表达,则BMSCs分化为脂肪细胞。因此,通过RNA干扰（RNA interference,RNAi）调控PPARγ的表达可抑制BMSCs的脂肪分化,保持MSCs的成骨分化特性。 方法：取新西兰大白兔骨髓,制备兔BMSCs,并随机分6组。S1、S2、S3：干扰1、2、3组,Con：感染无关siRNA组,M：模型组,N：正常组。10-7mol/L地塞米松诱导和siRNA病毒载体感染细胞,倒置显微镜观察BMSCs的形态及生长情况,在第1d、3d、5d、7d时,检测各组BMSCs内PPARγ、osteocalcin和Runx2 mRNA及蛋白的表达。14d时,检测细胞内甘油三酯( triglyceride,TG )含量、细胞培养液中骨钙素(osteocalcin,OC)分泌量和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性。21d,苏丹Ⅲ染色BMSCs,并在显微镜下作脂肪细胞计数。 结果：M组和Con组中PPARγ mRNA及其蛋白表达、TG含量和脂肪细胞计数均明显高于N组(P <0.05),而Osteocalcin和Runx2 mRNA及其蛋白表达、培养液中OC含量和细胞内ALP活性明显低于N组(P <0.05)。S1、S2、S3组中PPARγ mRNA及其蛋白表达显著低于M组和Con组(P <0.05),接近N组 (P>0.05),其中S2组的干扰作用最强。 结论：siRNA靶向PPARγ基因腺病毒穿梭载体能够有效抑制激素诱导的BMSCs成脂分化,维持BMSCs成骨分化。     

蛋白酪氨酸磷酸酶1B在3T3-L1前脂肪细胞分化过程中表达的变化

目的:观察在3T3-L1前脂肪细胞分化过程中蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)mRNA表达及其蛋白水平的变化,探讨PTP1B与脂肪细胞分化的关系.方法:体外培养3T3-L1前脂肪细胞,在3T3-L1前脂肪细胞分化成熟过程中(第1～10日),采用油红O染色及RT-PCR法检测过氧化物酶体增殖物活化受体γ2(PPARγ2)基因表达评价脂肪细胞分化成熟情况,RT-PCR法及Western印迹法检测脂肪细胞分化过程中PTP1B mRNA表达及其蛋白水平的变化.结果:随着脂肪细胞诱导分化逐步深入,油红O染色显示其中脂滴形成逐渐增多,至占全视野90%以上;同时PPARγ2基因表达逐步增多,均提示脂肪细胞分化逐步成熟,至最终分化为成熟脂肪细胞.PTP1B mRNA和蛋白水平在前脂肪细胞中表达较高,随着脂肪细胞的逐步成熟,其表达逐渐降低,至分化成熟时表达水平降至最低.结论:在3T3-L1前脂肪细胞分化成熟过程中,PTP1B mRNA及其蛋白表达水平逐渐减低,PTP1B可能参与了脂肪细胞分化.     

大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞诱导分化的研究

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离纯化和定向成脂诱导。方法采用密度梯度离心法分离纯化骨髓间充质干细胞,免疫组织细胞化学法检测BMSCs表面抗原。脂肪诱导剂诱导BMSCs分化为脂肪细胞,利用油红O染色进行检测。结果免疫组织细胞化学检测结果显示,BMSCs表达CD29、CD44、CD90、CD106,不表达CD34、CD45。BMSCs经脂肪诱导剂诱导后,油红O染色阳性。随着诱导时间的延长,油红O阳性细胞比例增加。结论体外培养的BMSCs在一定诱导条件下能够向脂肪细胞分化,并且随着诱导时间的延长,脂肪细胞比例不断增加。     

BMP-7诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化的初步研究

目的 探讨骨形态发生蛋白7(BMP-7)体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经元细胞分化的作用.方法 以全骨髓贴壁法分离、培养大鼠BMSCs;流式细胞仪检测细胞表型CD29、CD44及成脂诱导以鉴定大鼠BMSCs; MTT法检测浓度分别为25、50、75、100 ng/ml的BMP-7对大鼠BMSCs增殖的影响;第3代细胞贴壁后随机分为三组:阴性对照组、阳性对照组(β-巯基乙醇)、BMP-7诱导组;倒置相差显微镜下观察各组细胞形态学变化;诱导2 h后进行免疫细胞化学实验,检测各组细胞神经元标志物神经丝蛋白-200(NF-200)及神经突触素-1(SYN-1)的表达情况.结果 体外培养的第3代大鼠BMSCs形态呈长梭形,"鱼尾纹"状聚集生长;CD29、CD44阳性表达,阳性率分别为99.44％、 99. 17％;成脂诱导28 d后油红0染色阳性;不同浓度的 BMP-7均具有促进大鼠BMSCs增殖的作用,以75 ng/ml最为显著;75 ng/ml BMP-7诱导大鼠BMSCs 2 h后可见形态典型的神经元细胞,NF-200及SYN-1为阳性.结论 BMP-7体外具有诱导大鼠BMSCs向神经元细胞分化的作用.     

兔骨髓间充质干细胞定向诱导分化为脂肪细胞的研究

目的：探讨兔骨髓间充质干细胞(bone mesenchyrnal stem cells，BMSCs)体外分离培养、诱导分化为脂肪细胞的方法，并研究其生物学特性的变化．方法：采用体外细胞培养技术自兔股骨、胫骨及肱骨中分离BMSCs进行纯化、培养．用地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、胰岛素、吲哚美辛定向诱导BMSCs分化为脂肪细胞，改良MTT法测定其生长曲线，油红O染色，光镜下观察橙红色脂滴沉着的细胞比例．结果：成脂诱导72h后，细胞内有脂滴出现，随着诱导时间的延长，脂滴逐渐增加并融合为脂泡；细胞由梭形转变为类圆形或多角形；第3周油红O染色显示80％以上的细胞转变为脂肪细胞．结论：兔BMSCs经体外分离、诱导培养可以定向分化为脂肪细胞。     

Sdccag3通过Wnt通路对高脂血症大鼠种植体骨结合的影响

目的 探讨Sdccag3在高脂环境中通过Wnt信号通路影响骨髓间充质干细胞(BMSCs)成脂成骨分化以及高脂血症大鼠种植体周围骨结合的能力。 方法 构建高脂血症大鼠模型以及高脂环境培养BMSCs并进行成骨诱导,慢病毒载体过表达/沉默结肠癌抗原3(Sdccag3)的表达,采用RT-PCR、Western blotting、Micro-CT以及硬组织切片HE染色、油红O染色、免疫荧光染色等方法检测高脂环境中Sdccag3对大鼠骨代谢以及BMSCs分化平衡的影响。 结果 高脂成骨诱导BMSCs后过表达Sdccag3,下调成脂分化指标脂肪酸结合蛋白4(FABP4)、过氧化物酶体增殖剂激活受体γ(PPAR-γ),并上调Wnt信号通路标志基因低密度脂蛋白受体相关蛋白 5(LRP5)、LRP6、β-catenin及Wnt5a、Wnt5b,上调成骨分化指标碱性磷酸酶(ALP)、 Runt相关的转录因子2(Runx2);在高脂血症大鼠种植体周围骨组织中,过表达Sdccag3可上调Wnt信号通路标志基因并抑制周围脂形成,沉默LRP5会下调Sdccag3、成骨分化指标,上调成脂分化指标,与沉默Sdccag3表达一致。 结论 高脂血症促进种植体周围脂肪形成并抑制Sdccag3表达;过表达Sdccag3抑制BMSCs成脂分化并降低高脂血症大鼠种植体周围的成脂,促进成骨,促进Wnt信号通路标志基因表达。     

IGF-1对SD大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂方向分化的影响

目的:观察胰岛素样生长因子-1(IGF-1)作用于骨髓间充质干细胞后核心结合因子α1(CBFα1)和过氧化物酶增殖物激活受体γ2(PPARγ2)基因表达情况,探讨其对骨髓间充质干细胞成脂方向分化的影响。方法:用贴壁法筛选分离纯化SD大鼠骨髓基质干细胞并传代培养,取第4代SD大鼠骨髓间充质干细胞作为实验样本,随机分为空白对照组、低剂量IGF-1(10μg/L)组与高剂量IGF-1(20μg/L)组进行干预培养12 h,采用RT-PCR法检测各组CBFα1和PPARγ2 mRNA的表达。结果:IGF-1高剂量组及低剂量组均可以提高大鼠骨髓间充质干细胞CBFα1的mRNA以及下调PPARγ2的mRNA表达,高、低剂量组与空白对照组差异均有统计学意义(P均<0.05),但是这种剂量-效应在IGF-1干预浓度介于10~20μg/L的情况下并不明显。结论:IGF-1使骨髓间充质干细胞PPARγ2基因表达水平降低,阻碍骨髓间充质干细胞向成脂方向分化;使CBFα1基因表达水平增高,促进BMSCs成骨方向分化。IGF-1可能参与骨髓间充质干细胞成骨成脂方向分化的调节,并有利于成骨方向分化。     

碱性成纤维细胞生长因子对羊骨髓间充质干细胞体外增殖和分化的影响

目的：探讨碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对羊骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外增殖与分化的影响。方法：体外分离培养的羊原代BMSCs分为实验组和对照组,实验组添加bFGF(2 μg•L^-1)于L-DMED培养液中,对照组使用L-DMED常规培养液。分别测定2组BMSCs生长曲线以及碱性磷酸酶（ALP）活性。应用诱导剂对2组细胞进行成骨、成脂肪诱导,分别在显微镜下观察其分化潜能。 结果：单个核细胞接种大约1周成纤维细胞样集落开始出现,2周后形成的集落数量增加,每个集落的体积变大。当第1代BMSCs细胞生长到汇合期时,实验组细胞数是对照组的2.5倍。于第16天实验组ALP活性比对照组明显降低（P＜0.05）。2组BMSCs经成骨诱导培养3周后,经Von Kossa染色,已经成骨的细胞内均可见钙盐沉积;已经成骨的细胞内油红-“O”染色显示,成脂肪诱导培养2周后,2组BMSCs均能分化形成脂肪细胞,2组每高倍视野下脂肪细胞计数差异无显著性（P>0.05）。 结论：bFGF能提高羊BMSCs集落形成数量及扩增效率,并抑制其ALP活性,同时保持了BMSCs向成骨细胞、脂肪细胞的分化潜能。     

ATRA对人骨髓间充质干细胞成脂肪细胞分化及瘦素生成的影响

目的探讨全反式维甲酸（ATRA）对人骨髓间充质干细胞（BMSC）成脂肪细胞分化及瘦素（Lp）生成的影响。方法体外分离、培养和鉴定BMSC。在诱导培养液中加入不同浓度的ATRA进行成脂肪分化诱导,光学显微镜下油红O染色观察BMSC分化情况;RT—PCR和Westernblotting测定细胞过氧化物酶体增殖激活性受体γ（PPARγ）和脂肪酸结合蛋白4（FABP4）基因及相应蛋白表达;RT—PCR和ELISA法检测分化过程中细胞Lp基因表达及蛋白分泌水平的变化。结果ATRA（0．1～1．0umol／L）作用后,BMSC向脂肪细胞分化呈现浓度依赖性抑制,PPARγ、FABP4mRNA和蛋白表达均呈现一致性下降;诱导后细胞LpmRNA表达和蛋白分泌显著减少。结论0．1～1．0umol／LATRA可抑制BMSC向脂肪细胞分化及其Lp生成,其机制可能与下调PPARγ和FABP4表达有关。