Wnt/β-catenin信号通路在TNF-α诱导的心肌细胞损伤和凋亡中的作用研究

目的 建立心肌细胞炎症损伤模型,探讨Wnt/β-catenin信号通路在心肌细胞损伤和凋亡中的作用。方法 体外培养大鼠心肌细胞H9c2,用含肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的细胞培养基诱导心肌细胞,建立炎症心肌细胞损伤模型。实验包括对照组、炎症组、DDK1不同浓度阻断组共5组。各组检测细胞活力和凋亡率,检测相关基因和蛋白表达;检测细胞培养液中LDH和AST及细胞中SOD浓度。结果 TNF-α诱导H9c2心肌细胞β-catenin、TCF7L2和CyclinD1基因和蛋白表达显著上调,细胞增殖受到抑制、细胞损伤和凋亡增加(P<0.05)。而在DDK1阻断Wnt通路后,相对于炎症组,β-catenin、TCF7L2和CyclinD1基因和蛋白表达显著下调,细胞活力上升、细胞损伤减轻、凋亡率降低(P<0.05)。相关性分析显示,β-catenin基因表达与细胞活力呈负相关,与LDH、AST活性呈正相关(P<0.05)。结论 在TNF-α刺激下,心肌细胞Wnt通路被显著激活,抑制Wnt通路基因表达可减轻细胞损伤和凋亡。     

丹参素对缺氧/复氧诱导H9C2心肌细胞损伤和内质网应激的改善作用

目的观察丹参素(DLA)通过抑制内质网应激和凋亡对H9C2心肌细胞缺氧/复氧(H/R)后损伤的保护作用。方法将离体培养的H9C2心肌细胞随机分为3组:对照组、缺氧/复氧组(H/R组)、DLA+H/R组(DLA组)。H/R组先缺氧6h后复氧24h;DLA组于缺氧时给予DLA(10-6M)培养6h,再复氧24h。对照组心肌细胞正常培养至实验结束。ELISA测定细胞中乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)和丙二醛(MDA)的含量;Western blot检测细胞中内质网应激蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、Caspase-12、Bax、Bcl-2和SOD的蛋白含量。结果与对照组比较,H/R组细胞LDH、CK-MB和MDA的含量显著升高(P<0.05),GRP78、Caspase-12和Bax蛋白表达明显增加(P<0.05),而Bcl-2和SOD的蛋白含量明显降低(P<0.05);给予DLA可明显改善上述指标的变化。结论H/R可诱导H9C2心肌细胞发生凋亡、氧化应激和内质网应激,引起细胞损伤和凋亡;DLA可以通过抑制凋亡、氧化应激和内质网应激,减少细胞损伤,发挥保护细胞的作用。     

MiR-146b在白藜芦醇保护缺氧/复氧心肌细胞损伤中的作用及其机制

目的:探讨miR-146b在白藜芦醇保护缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)心肌细胞损伤中的作用及其机制。方法:将体外培养的心肌细胞分为正常组、H/R组、白藜芦醇组、白藜芦醇+antimiR-NC组和白藜芦醇+anti-miR-146b组。采用荧光定量PCR检测miR-146b的表达,ELISA法检测细胞上清液中IL-1β,TNF-α和IL-6含量,MTT法检测细胞存活率,比色法检测LDH漏出率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,蛋白质印迹法检测Bcl-2,caspase-3,NF-κB和TRAF6蛋白的表达,双荧光素酶报告基因实验检测miR-146b和TRAF6的靶向关系。结果:与正常组相比,H/R组细胞中miR-146b和Bcl-2蛋白的表达水平、细胞存活率显著降低,而细胞上清液中IL-1β,TNF-α,IL-6含量和LDH漏出率、细胞凋亡率以及caspase-3,NF-κB蛋白的表达水平显著升高(P<0.05);与H/R组相比,白藜芦醇组中miR-146b和Bcl-2蛋白的表达水平、细胞存活率显著升高,而IL-1β,TNF-α,IL-6含量和LDH漏出率、细胞凋亡率以及caspase-3,NF-κB蛋白的表达水平显著降低(P<0.05);与白藜芦醇组相比,白藜芦醇+anti-miR-146b组中miR-146b和Bcl-2蛋白的表达水平、细胞存活率显著降低,而IL-1β,TNF-α,IL-6含量和LDH漏出率,细胞凋亡率以及caspase-3,NF-κB蛋白的表达水平显著升高(P<0.05);而白藜芦醇+anti-miR-NC组与白藜芦醇组相比差异无统计学意义(P>0.05)。双荧光素酶报告基因和蛋白质印迹法证实TRAF6是miR-146b靶基因,且miR-146b可靶向调控其表达。结论:miR-146b抑制心肌细胞凋亡和炎症反应是白藜芦醇减轻H/R心肌细胞损伤的调控机制,其作用原理可能与靶向调控TRAF6有关。     

研究Cyp2j3基因对H9C2大鼠心肌细胞保护作用以及相关机制

目的探讨Cyp2j3基因通过STAT3信号通路对H9C2心肌细胞增殖凋亡的影响及机制。方法 H9C2大鼠心肌细胞分为正常对照组(对照组,常氧条件下培养)、pc DNA3.1组(转染空载体pcDNA3.1)、单纯缺氧复氧组(I/R+pcDNA3.1组,转染pc DNA3.1后,缺氧10 h后复氧2 h)和单纯缺氧复氧+pc DNA3.1-Cyp2j3组转染Cyp2j3的过表达载体后,缺氧10 h后复氧2 h)。Western bloting检测过表达Cyp2j3的效果;噻唑蓝(MTT)法检测各组细胞活力;乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测各组细胞的LDH活性;流式细胞术检测各组细胞的凋亡率;Western bloting检测增殖相关蛋白Ki67、凋亡相关蛋白含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)及信号转导与转录因子3(STAT3)信号通路STAT3和磷酸化的STAT3的蛋白表达。结果转染pc DNA3.1-Cyp2j3后的H9C2细胞Cyp2j3的蛋白表达显著升高;I/R+pc DNA3.1组和I/R+pcDNA3.1-Cyp2j3组细胞的OD值及Ki67、Bcl-2和pSTAT3的蛋白表达均显著低于pcDNA3.1组,LDH活性、细胞凋亡率及Caspase3蛋白表达均显著高于pcDNA3.1组(P0.05),而I/R+pc DNA3.1-Cyp2j3组细胞的OD值及Ki67、Bcl-2和p-STAT3的蛋白表达均显著高于I/R+pc DNA3.1组,LDH活性、细胞凋亡率及Caspase3蛋白表达均显著低于I/R+pcDNA3.1组(P0.05)。结论过表达Cyp2j3基因可通过激活STAT3信号减弱缺氧复氧引起的H9C2细胞增殖降低、LDH活性和凋亡增加,从而对心肌细胞起保护作用。     

Ⅰ型磷酸酶抑制亚基1对大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

目的 探讨Ⅰ型磷酸酶抑制亚基1(PPI1)对大鼠乳鼠心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤的保护作用及其机制.方法 用PPI1野生型和活化型突变体表达质粒分别转染乳鼠心肌细胞,并建立乳鼠心肌细胞缺氧/复氧H/R模型,测定各组心肌细胞的存活率、丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH)的含量、caspase-3活性及超氧化物歧化酶(SOD)活力,此外用流式细胞术测定各组心肌细胞凋亡率,Western blot分析PPI1对凋亡相关蛋白表达及PI3K/Akt信号通路的影响.结果 与正常组比较,模型组LDH、MDA含量、caspase-3活性及细胞凋亡率增高(P<0.05),细胞存活率和SOD活性降低(P<0.05);PPI1活化型突变体转染组细胞的LDH、MDA含量、caspase-3活性和细胞凋亡率则降低,细胞存活率和SOD活性升高,与缺氧/复氧组比较各实验指标差异均具有统计学意义(P<0.05).Western blot表明该组细胞P53、Bax 表达下调,pAkt表达上调.结论 PPI1活化型突变体对H/R造成的心肌细胞损伤具有保护作用,其机制与稳定心肌细胞膜、减轻氧自由基损伤及减少细胞凋亡有关.     

索他洛尔调控miR-208a对H2O2诱导心肌细胞损伤的保护作用

目的 探讨索他洛尔对H2O2诱导心肌细胞损伤的影响及分子机制。方法 实验设置对照组、模型组、实验1、2、3组、miR-NC组、miR-208a组、3+miR-NC组、3+miR-208a组。流式细胞术检测细胞凋亡;蛋白质印迹(Western blot)法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 (Caspase-3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9 (Caspase-9)蛋白表达;生化比色法检测乳酸脱氢酶(LDH)和丙二醛(MDA)含量;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-208a表达水平。结果 H₂O₂可诱导心肌细胞凋亡和提高LDH、MDA水平(P<0.05)。索他洛尔可降低H₂O₂诱导心肌细胞凋亡和LDH、MDA水平(P<0.05);索他洛尔可降低miR-208a水平,过表达miR-208a可促进H₂O₂诱导的心肌细胞凋亡及LDH、MDA表达,并能逆转索他洛尔对H2O2诱导心肌细胞凋亡及LDH、MDA表达的影响。结论 索他洛尔可通过下调miR-2...     

松萝酸通过调节SphK1/S1P信号通路减轻缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤

目的 探讨松萝酸（UA）对缺氧/复氧（H/R）诱导的心肌细胞损伤的影响及其作用机制。方法 构建H9c2细胞H/R模型,使用0.5～64μmol/L UA分别预处理H9c2细胞,MTT法筛选UA浓度;H9c2细胞随机分为对照组、模型组、UA低剂量组（1μmol/L）、UA中剂量组（4μmol/L）、UA高剂量组（16μmol/L）和UA高剂量+Benzyl butyl phthalate(BBP)组（16μmol/L UA+100 nmol/L BBP）,检测各组细胞增殖活力、细胞凋亡情况,白介素（IL）-1β、IL-6、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）、鞘氨醇激酶1(SphK1)、鞘氨醇-1-磷酸受体1(S1PR1)、细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)蛋白表达水平。结果 1μmol/L以上浓度UA可以显著提高H/R H9c2细胞增殖活力。与对照组相比,模型组细胞增殖能力和ATP、SOD含量下降,细胞凋亡率和IL-1β、IL-6、MDA、SphK1、S1PR1、ERK1/2表达增加（P<0.05）;与模型组相比,UA低、中、高剂量组细胞增...     

盐酸右美托咪定调控HIF-1α对高糖诱导心肌线粒体损伤与细胞凋亡的影响

目的探讨盐酸右美托咪对高糖诱导的心肌线粒体损伤与细胞凋亡的影响及作用机制。方法用葡萄糖浓度为33 mmol/L的培养基培养H9C2细胞作为高糖组,正常培养基培养的细胞作为正常对照组;用1μmol/L的盐酸右美托咪定预处理H9C2细胞1 h后用葡萄糖浓度为33 mmol/L的培养基培养作为盐酸右美托咪定+高糖组;将con小干扰RNA(si-con)、HIF-1α小干扰RNA(si-HIF-1α)质粒分别转染至H9C2细胞中用1μmol/L的盐酸右美托咪定预处理H9C2细胞1 h后用葡萄糖浓度为33 mmol/L的培养基培养作为盐酸右美托咪定+si-con+高糖组、盐酸右美托咪定+si-HIF-1α+高糖组。四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞活力;乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测LDH活性;蛋白质印迹(Western Blot)法检测裂解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cleaved caspase-3)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、细胞色素c(Cyt-C)、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)蛋白表达水平;流式细胞术检测细胞凋亡;JC-1荧光标记法检测线粒体膜电位;2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)荧光探针法检测活性氧(ROS)荧光强度;实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测细胞HIF-1αmRNA水平。结果与正常对照组相比,高糖组心肌细胞活力显著降低,LDH活性显著升高,Cleaved caspase-3、Bax表达水平显著升高,Bcl-2表达水平显著降低,细胞凋亡率显著升高,线粒体膜电位降低的细胞比率显著升高,Cyt-C蛋白表达水平显著升高,ROS荧光强度显著升高,HIF-1αmRNA和蛋白表达显著降低(P <0. 05)。与高糖组相比,盐酸右美托咪定+高糖组心肌细胞活力显著升高,LDH活性显著降低,Cleaved caspase-3、Bax表达水平显著降低,Bcl-2表达水平显著升高,细胞凋亡率显著降低,线粒体膜电位降低的细胞比率显著降低,Cyt-C蛋白表达水平显著降低,ROS荧光强度显著降低,HIF-1αmRNA和蛋白表达显著升高(P <0. 05)。与盐酸右美托咪定+si-con+高糖组相比,盐酸右美托咪定+si-HIF-1α+高糖组可逆转上述盐酸右美托咪定对高糖诱导的心肌细胞线粒体损伤与细胞凋亡的抑制作用。结论盐酸右美托咪定可促进心肌细胞存活,抑制LDH的漏出和ROS的产生,抑制细胞凋亡,稳定线粒体膜电位,减轻高糖对线粒体和细胞凋亡的影响,其机制可能与HIF-1α有关。     

载脂蛋白M在心肌细胞缺氧/复氧损伤中的表达差异及其作用

目的:探讨载脂蛋白M(apolipoprotein M,ApoM)在大鼠H9C2心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤中的表达差异及作用。方法:利用安宁包缺氧体系构建大鼠H9C2心肌细胞H/R损伤模型,采用CCK-8、细胞凋亡检测试剂盒、caspase-3活性检测试剂盒检测H9C2细胞H/R后细胞增殖、凋亡的差异,同时检测ApoM和1-磷酸鞘氨醇受体1(sphingosine-1-phosphate receptor1,S1PR1)在H/R条件下的表达情况。建立体外过表达ApoM(apoM overexpression,ApoM-OE)的H9C2细胞,采用CCK-8检测心肌细胞存活率,比色法检测细胞培养上清中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性,蛋白质印迹法检测心肌细胞cleaved caspase-3、caspase-3表达情况,分析ApoM在H/R诱导的心肌细胞损伤中的可能作用。结果:在H/R处理后,H9C2心肌细胞活力逐渐降低,细胞凋亡率、ca...     

没食子酸对大鼠缺血再灌注损伤后细胞凋亡的保护作用及机制研究

目的探讨没食子酸(GA)对大鼠实验性缺血/再灌住损伤的保护作用,并初步揭示其作用机制。方法 wistar大鼠32只,随机分成四组:假手术组、模型组、阳性药丹参组(DS)(100 mg.kg-1)、没食子酸组(GA)(20 mg.kg-1),每组8只;采用结扎大鼠左冠状动脉前降支法制备心肌缺血/再灌注损伤模型。测定缺血再灌注前给予GA对损伤大鼠血清中LDH、CPK、AST生成的影响,并检测对大鼠心电图ST段的影响;同时以TTC染色检测心肌梗死面积变化、TUNNEL法检测各组大鼠心肌细胞凋亡率,免疫组化法检测心肌细胞Bax、Bcl-2的蛋白表达。结果与模型组比较,GA抑制大鼠血清中LDH、CPK、AST生成(P0.01),GA及阳性药DS给药组在缺血104、0 min和再灌注101、20 minST段抬高明显降低(P0.05),心肌梗死面积明显降低(P0.05),减少损伤大鼠心肌细胞凋亡的发生(P0.05),免疫组化法检测结果显示,GA可上调Bcl-2蛋白表达、下调Bax蛋白表达(P0.05),且心肌细胞Bcl-2/Bax比值高于模型组(P0.05)。结论黄芪可以抑制大鼠缺血/再灌注损伤后凋亡率,其作用机制可能与上调Bcl-2/Bax有关。     

蛋白质非酶糖化在丙酮醛促进心肌细胞缺氧／复氧损伤敏感性增加中的作用

目的：观察蛋白质非酶糖化是否会增加心肌缺氧/复氧损伤的敏感性。方法常规培养H9C2细胞,分别给予PBS（对照组）、丙酮醛（200μmol/L）、丙酮醛（200μmol/L）＋氨基胍（100μmol/L）孵育6 d后接受缺氧/复氧处理,以MTT法测定心肌细胞存活率,微量酶活性测试法检测乳酸脱氢酶（LDH）释放变化,比色法检测丙二醛（MDA）含量,并通过免疫组织化学检测心肌细胞终末糖化晚期产物（AGEs）表达。结果缺氧/复氧降低细胞存活率,增加心肌细胞MDA含量和LDH释放;而丙酮醛处理6 d的心肌细胞的AGEs含量明显增加,并对缺氧/复氧损伤的敏感性增加,与PBS孵育细胞经缺氧/复氧处理后相比, MDA含量和LDH释放显著上升,存活率明显下降（P＜0.01）;MGO引起的上述变化可以被糖化抑制剂氨基胍部分阻断（P＜0.05）。结论蛋白质非酶糖化是糖代谢中间产物丙酮醛增加心肌细胞对缺氧/复氧损伤敏感性的重要机制。     

前胡丙素对缺氧再灌注损伤心肌细胞的保护作用

目的研究前胡丙素对培养心肌细胞缺氧再灌注损伤的保护作用。方法采用SD大鼠乳鼠进行心肌细胞培养,建立模拟缺氧再灌注模型。实验分4组:正常组(contro1):细胞正常培养;缺氧预适应组(HP):预先缺氧2 h,复氧1 h,再缺氧12 h后,复氧2 h;前胡丙素预处理组(PP):先予前胡丙素单体终浓度为100 mol/L作用1 h,再行缺氧12 h,后复氧2 h;模拟缺氧再灌注组(HR):缺氧12 h,后复氧2 h。观察心肌细胞搏动频率及细胞形态;细胞上清检测乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸磷酸激酶(CK)值。结果①细胞博动率:前胡丙素能增加缺氧再灌注损伤心肌细胞搏动频率;②细胞形态:心肌细胞H/R培养后皱缩、变圆,伪足减少,PP组心肌细胞形态变化小于对照组;③LDH和CK值:与正常培养组比较,模拟缺氧再灌注组细胞上清中LDH、CK值明显升高(P0.01);与模拟缺氧再灌注组比较,HP组、PP组细胞上清中LDH、CK值明显降低(P0.01);但前胡丙素预处理组与缺氧预适应组之间无明显差异(P0.05)。结论前胡丙素能保护缺氧再灌注损伤心肌细胞,减轻损伤程度。     

异丙酚对高糖诱导心肌细胞凋亡时STAT3活性的影响

目的探讨高糖诱导心肌细胞凋亡中STAT3表达的变化及异丙酚对其活性的影响。方法将培养的H9c2心肌细胞随机分为:1对照组(C组);2高糖组(HG组);3异丙酚组(P组);4异丙酚+STAT3-siRNA(SP)组;5STAT3-siRNA对照组。应用原位末端转移酶标记法(TUNEL)检测各组心肌细胞凋亡,分光光度法检测心肌细胞内caspase-3活性的变化。用DHE检测法检测细胞内活性氧(ROS)的产生。用试剂盒检测细胞培养上清液中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量。用Western blot分别检测心肌细胞中STAT3及p-STAT3蛋白表达。结果与对照组比较,高糖组心肌细胞凋亡明显增加,caspase-3活性显著升高,p-STAT3表达显著降低,SOD显著下降,ROS和MDA含量明显增高;与高糖组比较,异丙酚组心肌细胞凋亡数量明显减少,caspase-3活性明显降低,而p-STAT3表达显著增高,SOD显著上升,ROS和MDA含量明显下降(均P0.05);给予STAT3-siRNA后异丙酚的保护作用减弱(均P0.05)。结论 50μmol/L浓度的异丙酚对高糖诱导的心肌细胞凋亡有显著的抑制作用,而沉默STAT3后其作用明显减弱。STAT3的活化可能参与了异丙酚抑制心肌细胞凋亡的作用。     

Dexmedetomidine protects cardiomyocytes against hypoxia/reoxygenation injury via multiple mechanisms

BackgroundMyocardial infarction (MI) is a serious cardiovascular disease associated with myocardial ischemia/reperfusion (I/R) injury. Dexmedetomidine (Dex), an α2‐adrenoceptor agonist, has been reported to protect against I/R injury. We examined the cardioprotective effects of Dex on cardiomyocytes under hypoxia/reoxygenation (H/R) conditions and explored the underlying mechanisms.Materials and methodsA H/R model was established to mimic the MI injury. The CCK‐8 assay was performed to measure cell viability. Cellular apoptosis was measured using the Annexin V fluorescein isothiocyanate (FITC)‐propidium iodide (PI) staining. The levels of interleukin (IL)‐1α and tumor necrosis factor (TNF)‐α, and the activity of lactate dehydrogenase (LDH) were measured using a commercial enzyme‐linked immunosorbent assay (ELISA) kit. Reactive oxygen species (ROS) were measured using the 2''‐7’ dichlorofluorescein diacetate (DCFH‐DA) staining assay. In addition, the levels of malondialdehyde (MDA) and the activity of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), and caspase‐3 were measured using a commercial kit. siRNA was used to silence Bcl‐2, catalase, or STAT3. Western blotting was used to measure the change in the levels of proteins.ResultsDex improved the cell viability and inhibited the inflammatory response in H9c2 cells exposed to H/R treatment. In addition, Dex inhibited apoptosis and alleviated the endoplasmic reticulum (ER) stress and oxidative stress in H9c2 cells under the H/R treatment. Mechanism investigation showed that Dex inhibited the intrinsic pathway of apoptosis. Moreover, Dex enhanced the activation of the JAK2/STAT3 signaling pathway in H/R‐treated H9c2 cells.ConclusionAltogether, our findings suggested Dex as a promising therapeutic agent for myocardial I/R.     

RNAi targeting ryanodine receptor 2 protects rat cardiomyocytes from injury caused by simulated ischemia-reperfusion

The effects of a small interfering RNA targeting ryanodine receptor 2 (si-Ryr2) on cardiomyocytes injury following a simulated ischemia-reperfusion (I/R) were investigated. Pretreated with si-Ryr2 or ryanodine, primary cultures of neonatal rat cardiomyocytes were subjected to a protocol of simulated I/R. Compared with control, the cytosolic Ca²⁺ concentration ([Ca²⁺]_i) and the generation of reactive oxygen species (ROS) was significantly augmented after I/R. Concomitant with these, cell injury assessed by Annexin V/PI staing, mitochondria membrane potential (ΔΨm) and the leakage of lactic dehydrogenase (LDH) and creatine phosphokinase (CPK) were aggravated. Si-Ryr2 treatment reduced [Ca²⁺]_i and ROS generation and protected the cardiomyocytes from subsequent I/R injury, as evidenced by stable ΔΨm and decreased Annexin V⁺ PI^- staing and enzymes release. Moreover, si-Ryr2 exerted more effective protection on I/R injury compared to ryanodine. The present study demonstrated for the first time that in neonatal cardiomyocytes, si-Ryr2 reduces cell death associated with attenuating [Ca²⁺]_i and ROS production. Furthermore, we attempt to speculate that si-Ryr2 excel ryanodine in Ryr2 function research of cardioprotection.     

利拉鲁肽对缺氧/复氧诱导的乳鼠心肌细胞损伤的影响

[目的]观察新型降糖药物利拉鲁肽对缺氧/复氧(H/R)诱导的乳鼠心肌细胞损伤的影响.[方法]将体外培养Wistar大鼠乳鼠心肌细胞进行分组:单纯H/R组(A组)、利拉鲁肽组+H/R组(B组)、正常对照组(C组),将A,B两组细胞同时进行H/R损伤,复氧后分别检测3组的乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛含量(MDA)、超氧化酶歧化酶(SOD)活性及各组心肌细胞凋亡率.[结果]A组与C组比较,其细胞培养液中LDH、MDA含量、细胞凋亡率均增加,SOD活性降低,且差异有显著性(P＜0.01).与A组相比,B组LDH、MDA含量、细胞凋亡率则明显降低(P＜0.01),但仍高于C组,且差异有显著性(P＜0.01);SOD活性较A组增高,差异亦有显著性(P＜0.01).[结论]H/R可以造成心肌细胞的损伤,增加细胞的凋亡;利拉鲁肽作为胰高血糖素样肽-1类似物,其直接作用于心肌细胞,可减轻H/R造成的心肌细胞损伤,抑制心肌细胞的凋亡,具有潜在的心脏保护作用.     

Protective role of retinoid X receptor in H9c2 cardiomyocytes from hypoxia/reoxygenation injury in rats

BACKGROUND:

Retinoid X receptor (RXR) plays a central role in the regulation of intracellular receptor signaling pathways. The activation of RXR has protective effect on H₂O₂-induced apoptosis of H9c2 ventricular cells in rats. But the protective effect and mechanism of activating RXR in cardiomyocytes against hypoxia/reoxygenation (H/R)-induced oxidative iniury are still unclear.

METHODS:

The model of H/R injury was established through hypoxia for 2 hours and reoxygenation for 4 hours in H9c2 cardiomyocytes of rats. 9-cis-retinoic acid (9-cis RA) was obtained as an RXR agonist, and HX531 as an RXR antagonist. Cultured cardiomyocytes were randomly divided into four groups: sham group, H/R group, H/R+9-cis RA -pretreated group (100 nmol/L 9-cis RA), and H/R+9-cis RA+HX531-pretreated group (2.5 μmol/L HX531). The cell viability was measured by MTT, apoptosis rate of cardiomyocytes by flow cytometry analysis, and mitochondrial membrane potential (ΔΨm) by JC-1 fluorescent probe, and protein expressions of Bcl-2, Bax and cleaved caspase-9 with Western blotting. All measurement data were expressed as mean±standard deviation, and analyzed using one-way ANOVA and the Dunnett test. Differences were considered significant when P was <0.05.

RESULTS:

Pretreatment with RXR agonist enhanced cell viability, reduced apoptosis ratio, and stabled ΔΨm. Dot blotting experiments showed that under H/R stress conditions, Bcl-2 protein level decreased, while Bax and cleaved caspase-9 were increased. 9-cis RA administration before H/R stress prevented these effects, but the protective effects of activating RXR on cardiomyocytes against H/R induced oxidative injury were abolished when pretreated with RXR pan-antagonist HX531.

CONCLUSION:

The activation of RXR has protective effects against H/R injury in H9c2 cardiomyocytes of rats through attenuating signaling pathway of mitochondria apoptosis.KEY WORDS: Retinoid X receptor, Cardiomyocytes, Apoptosis, Mitochondria, Hypoxia reoxygenation     

麝香通心滴丸对心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

目的探讨麝香通心滴丸（STDP）对心肌细胞缺氧/复氧的保护作用。 方法建立心肌缺氧/复氧模型。将H9c2细胞分为5组：对照组（细胞正常培养,不做任何处理）、模型组、STDP组（在复氧前40 min给予STDP 50 mg / L）、3-甲基腺嘌呤（3-MA）组（在复氧前40 min给予3-MA 5 mmol / L）及STDP + 3-MA组（在复氧前40 min分别给予STDP 50 mg / L及3-MA 5 mmol / L）。采用细胞计数试剂盒8（CCK-8）法检测各组细胞存活率,并测定各组细胞乳酸脱氢酶（LDH）、丙二醛及肌酸激酶水平。采用流式细胞仪检测各组细胞的细胞凋亡率,实时荧光定量PCR检测信使RNA（mRNA）自噬相关基因Beclin-1、Atg5的表达水平,并通过Western-blotting检测各组细胞自噬相关蛋白LC3Ⅱ / LC3Ⅰ、低氧诱导因子1α（HIF-1α）、Bcl-2 /腺病毒E1B 19 kDa相互作用蛋白3（BNIP3）、Beclin-1、Atg5的表达水平。 结果各组细胞存活率比较,差异有统计学意义（F = 85.893,P = 0.028）,且STDP组细胞存活率较模型组、3-MA组及STDP + 3-MA组细胞存活率均显著升高[（90 ± 7）%、（63 ± 5）%、（80 ± 5）%、（81 ± 6）%,P均< 0.05]。各组细胞LDH、丙二醛、肌酸激酶水平,细胞凋亡率,Beclin-1 mRNA、Atg5 mRNA以及LC3Ⅱ / LC3Ⅰ、HIF-1α、BNIP3、Beclin-1、Atg5蛋白表达水平的比较,差异均有统计学意义（F = 78.381、23.519、48.376、22.726、6.315、5.294、75.219、116.546、21.125、39.724、65.247,P均< 0.05）。进一步两两比较发现,在STDP组细胞中,LDH[（92 ± 6）、（194 ± 13）、（195 ± 11）、（192 ± 10）μmol / L,P均< 0.05]、丙二醛[（12.5 ± 0.7）、（17.2 ± 1.2）、（18.5 ± 1.6）、（17.9 ± 1.0）μmol / L,P均< 0.05]、肌酸激酶[（19.9 ± 1.0）、（34.3 ± 2.2）、（35.3 ± 2.2）、（34.8 ± 2.5）μmol / L,P均< 0.05]水平,细胞凋亡率[（5.8 ± 0.8）%、（8.8 ± 0.9）%、（7.6 ± 0.7）%、（7.3 ± 0.5）%,P均< 0.05]较模型组、3-MA组及STDP + 3-MA组均明显降低;Beclin-1 mRNA、Atg5 mRNA、LC3Ⅱ / LC3Ⅰ、BNIP3、Beclin-1、Atg5蛋白表达水平较模型组均明显降低,而较3-MA组及STDP + 3-MA组均显著升高（P均< 0.05）;HIF-1α蛋白表达水平较模型组、3-MA组及STDP + 3-MA组均明显升高（P均< 0.05）。 结论STDP可通过调控HIF-1α / BNIP3信号通路发挥对心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用。