IL-12和CpG疫苗佐剂体内对特异性CD4+T细胞免疫应答的影响

目的：观察IL-12和CpG作为疫苗佐剂在体内促进抗原特异性CD4^＋T细胞的分化和IFN-γ的产生异同.方法：自CD4^＋T细胞受体转基因（TCR-Tg）小鼠脾和淋巴结分离CD4^＋T细胞,体外利用CFSE进行标记,然后被动输给相同基因的正常小鼠.经OVA、OVA＋IL-12或OVA＋CpG免疫后,观察抗原特异性CD4^＋T细胞的组织分布,IFN-γ的表达以及与细胞分裂之间的关系.结果：未经OVA抗原免疫的小鼠,抗原特异性CD4^＋T细胞未见有增殖反应.当经OVA抗原免疫后,可见脾和肺组织中细胞增殖;IFN-γ＋细胞在脾脏、淋巴结和肺组织表达的阳性率很低,其范围为0.93%～2.17%.当经OVA＋IL-12免疫后,IL-12促进IFN-γ的表达,阳性率为4.53%～26.79%;而经OVA＋CpG免疫后,CpG只促进淋巴结中IFN-γ的表达（3.84%）.IFN-γ表达的细胞主要为分裂3～5次的细胞.结论：IL-12和CpG作为疫苗佐剂均可促进IFN-γ产生,促进细胞免疫应答.     

IL-12体外促进慢性乙型肝炎患者PBMC IFN-γ的产生

目的：探讨体外IL-12对慢性乙型病毒性肝炎患者细胞免疫功能的影响，为临床治疗慢性乙型病毒性肝炎提供理论依据。方法：慢性乙型肝炎患者PBMCs与HBsAg、HBsAg＋IL-12、HBcAg或HBcAg＋IL-12孵育后，利用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测细胞培养上清中IFN-γ的含量；用酶联免疫斑点实验（ELISPOT）在单个细胞水平上检测PBMCs中IFN-γ产生细胞的频率；用流式细胞记数仪（FACS）检测PBMCs中IFN-γ^＋的细胞亚群。结果：当乙肝患者PBMCs与HBsAg或HBcAg孵育后，只有少数病例发生反应，产生低水平的IFN-γ。当IL-12加入细胞培养后，能显著地增加HBsAg或HBcAg诱导IFN-γ的产生；分泌IFN-γ的细胞频率显著增加；IFN-γ^＋的细胞主要包括CD8^＋T细胞和非T细胞。结论：IL-12体外能增强慢性乙型肝炎患者的细胞免疫应答。     

颗粒性HBV多CTL表位基因诱导BALB/c小鼠的免疫应答研究

目的：研究含HBV多CTL表位的杂合HBc基因免疫BALB/c小鼠所诱导的免疫应答.方法：构建以HBV多CTL表位取代MIR区基因的杂合HBc基因疫苗（pHBcMep）并以肌肉注射方式免疫BALB/c小鼠,ELISA、流式细胞术、LDH释放法等分别检测血清特异性抗体与淋巴细胞分泌的IFN-γ水平、CD4^＋/CD8^＋T细胞比例变化及特异性CTLs活性等免疫应答指标.结果：颗粒性杂合HBc基因疫苗pHBcMep免疫BALB/c小鼠诱导明显抗体应答,末次免疫后2周,特异性抗preS2抗体阳性率达100%（12/12）,最高效价1∶1 000,同时诱导淋巴细胞分泌IFN-γ能力增强和刺激CTLs活化,其杀伤活性达16 IU30,CD4^＋/CD8^＋T细胞比例明显升高,且诱导明显回忆反应.结论：颗粒性HBV多CTL表位基因疫苗pHBcMep具有良好免疫原性,能迅速诱导高活性体液和细胞免疫应答及回忆反应.     

CpG ODN对ZP~(121-140)表位合成肽诱导的免疫应答和免疫避孕效应影响

目的:探讨CpG ODN对透明带(四)抗原表位ZP~(121-140)合成肽诱导的免疫应答和免疫避孕效应影响.方法:应用人工合成ZP2~(121-140)表位肽,与20μg CpG ODN或等量完全弗氏佐剂(CFA)混悬后左胫前肌免疫雌性BALB/c小鼠,初次免疫后2、4、6周各加强免疫一次,共免疫四次.在每次加强免疫前和末次免疫后两周断尾取血,分离血清,分析特异性lgG抗体及非特异性细胞因子IFN-γ、TNF-Ⅱ,IL-10水平;收集小鼠阴道冲洗液,离心取上清,分析特异性IgA抗体水平.免疫小鼠生育实验结束后,取卵巢组织行病理学分析.结果:CpG ODN组诱导的特异性IgG和IgA水平较CFA组有增高趋势,但无显著性差异(P＞O.05).CpG ODN组诱导的非特异性IFN-γ和TNF-水平明显高于CFA组(P＜0.05);而CpG ODN组诱导的IL-10水平显著低于CFA 组(P＜0.05).两种佐剂对小鼠的受孕率影响没有显著性差异,但CpG ODN组孕鼠每胎产仔数明显低于CFA组(P＜O.05).病理学分析显示实验小鼠卵巢组织无病理性变化.结论:CpG ODN对Zp~(121-140)合成肽诱导的免疫应答和免疫避孕效应略优于CFA,更适合用于避孕疫苗佐剂研究.     

CpG ODN激活慢性HBV感染者外周血单个核细胞和CD4+T细胞功能的研究

目的 探讨人工合成硫代修饰的含CpG基序的寡脱氧核苷酸(ODN)作为佐剂对慢性HBV感染者PBMC和CD4+T细胞产生免疫应答的影响.方法 将入选慢性HBV感染者20例分成两组,免疫耐受组和免疫清除组各10例,用CoG ODN、HBsAg、M[CpG ODN+HBsAg]分别与同一感染者的PBMC和CD4+T细胞孵育,采用酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测两种细胞IFN-γ的分泌情况,以斑点数的多少来评价细胞分泌IFN-γ的能力.结果 CpG ODN、HBsAg、MECpG ODN+HBsAg]与PBMC孵育后IFN-γ斑点数是3±8、339±429、375±496;与CD4+Tcell孵育后IFN-γ斑点数是1±4、5±16、5±12.在免疫耐受组,CpG ODN、HBsAg、M[CpG ODN+HBsAg]与PBMC孵育后IFN-γ斑点数是3±8、361±153、375±276;与CD4+ Tcell孵育后IFN-γ斑点数是0±2、2±2、4±4.在免疫清除组,CoG ODN、HBsAg、M[CoGODN+HBsAg]与PBMC孵育后IFN-γ斑点数是3±21、289±345、405±656;与CD4+ Tcell孵育后IFN-γ斑点数是2±14、8±40、7±30.PBMC与HBsAg、M孵育后IFN-γ斑点数比较统计分析P=0.720;CD4+ Tcell与HBsAg、M孵育后IFN-γ斑点数统计分析P=0.890,两种不同细胞中与M孵育后IFN-γ斑点数比较统计分析得P=0.000.结论 在免疫耐受组和免疫清除组,CpG ODN不显著增加HBsAg刺激PBMC和CD4+ T细胞分泌IFN-γ,但CpG ODN对PBMC刺激效果优于CD4+T细胞.     

CpG ODN佐剂对乙肝疫苗抗原免疫原性的影响

目的探究CpG ODN佐剂对不同抗原含量乙肝疫苗免疫效果的影响。方法在体液免疫方面不同抗原浓度的CpG ODN与Al(OH)3佐剂乙肝疫苗免疫Balb/c小鼠,于免疫后第2、4、6、8、10周收集血清,检测小鼠体内相对效力ED50和血清中的anti-HBs抗体水平;在细胞免疫方面测定诱导产生IFN-γ水平及IgG2a应答水平。结果 CpG ODN与Al(OH)3佐剂可以有效协同HBs Ag诱导机体产生的抗体滴度达49 427 mIU/ml,抗体效价随时间延长而增加。乙肝抗原减半后双佐剂乙肝疫苗诱导机体产生的特异性抗体滴度可达41 225 mIU/ml,高于无CpG ODN佐剂的铝佐剂疫苗。在诱导细胞分泌方面,对照组诱导产生IFN-γ水平及IgG2a应答水平明显低于所有双佐剂疫苗组。结论 CpG ODN对HBsAg具有良好佐剂活性,并与铝佐剂有协同作用,二者联合应用可以降低乙肝抗原用量并提高疫苗免疫原性。     

SARS-CoV S DNA疫苗诱导特异性T细胞及相关细胞因子的特性研究

目的 小鼠经皮下SARS-CoV S DNA疫苗免疫后，研究其特异性T细胞及相关细胞因子的特性。方法SARS-CoV S DNA疫苗免疫BALB／c小鼠后，获取淋巴细胞悬液。经S抗原多肽刺激后，采用ELISA检测细胞培养上清液中IFN-γ／的水平，利用流式细胞仪在单个细胞水平上检测IFN-γ和IL-2的表达及其关系。结果 当S混合多肽刺激后，DNA疫苗免疫小鼠的淋巴细胞产生大量的IFN-γ，与对照鼠相比差异有统计学意义（P〈0．01）。细胞亚群分析的结果表明，IFN-γ^＋和IL-2^＋的CD4^＋T细胞百分率明显高于CD8^＋T细胞。单独产生IL-2的细胞占大多数，其次为IFN-γ和IL-2双阳性细胞，只产生IFN-γ的细胞很少。结论 SARS-CoV S DNA疫苗免疫小鼠后可以诱导抗原特异性CD4^＋和CD8^＋T细胞的产生。     

减毒鼠伤寒沙门氏菌运送CD8+T细胞表位的细胞免疫应答

目的： 探索减毒沙门氏菌运送CD8＋ T 细胞表位诱导机体产生特异性细胞免疫应答的规律性.方法： 通过构建融合表达OVA 257～264aa和LCMV NP 118～132aa CD8＋ T 细胞表位的原核表达质粒ptG2F, 以电穿孔法转化减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207, 筛选重组菌SL7207（ptG2F）.采用静脉注射免疫C57BL/6和BALB/c小鼠, 间隔2 wk, 分别于第2次和第3次免疫后, 取免疫小鼠脾细胞, 用ELISPOT法检测特异性IFN-γ分泌细胞和IL- 4分泌细胞.结果： 携带CD8＋ T细胞表位的重组菌SL7207（ptG2F）能诱导产生细胞免疫应答.在提呈OVA CD8＋ T细胞表位时, 2次免疫后, 诱导产生的细胞免疫应答趋向于Th1; 而在3次免疫后, 呈现Th1/Th2的平衡转换.在提呈LCMV NP CD8＋ T细胞表位过程中, Th2免疫应答水平高于Th1, 且有增强趋势.结论： 减毒沙门氏菌可以有效运送CD8＋ T细胞表位并诱导产生特异细胞免疫应答, 这为减毒细菌作为运送载体的研究提供了参考依据.     

Ag85A DNA疫苗加强免疫显著提高卡介苗初免小鼠的抗结核T细胞免疫应答

目的 构建表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)免疫优势抗原Ag85A的DNA疫苗,分析其加强免疫后提高卡介苗(BCG)初免小鼠的抗结核T细胞免疫应答.方法 以Mtb毒株H37Rv基因组DNA为模板,PCR扩增Ag85A抗原编码的结构基因并克隆至真核表达载体pVAX1中构建其DNA疫苗;接着,将纯化后的该DNA疫苗加强免疫BCG初免小鼠2针,以BCG和DNA单独免疫小鼠为对照,免疫8周后无菌分离脾淋巴细胞,分别应用IFN-γ ELISPOT和多因子胞内流式细胞术(intracellular staining)分析免疫小鼠的Mtb抗原特异性效应细胞免疫水平与分泌IFN-γ/TNF-α/IL-2的多功能CD4+T细胞频率及其强度以及CD8+T细胞免疫应答.结果 与BCG免疫及DNA单独免疫组相比,Ag85A DNA加强免疫不仅能显著提高小鼠IFN-γ+TNF-α+IL-2+多功能T细胞,IFN-γ+IL-2+、IL-2+TNF-α+双功能T细胞与IL-2+单功能T细胞的频率以及IL-2的分泌能力,还能显著诱导小鼠产生更多分泌IFN-γ和IL-2的CD8+T细胞.结论 本研究成功构建了表达Mtb免疫优势抗原Ag85A的DNA疫苗并分析了其免疫原性,证实了BCG初免-DNA加强的免疫策略可同时显著增强实验小鼠的Mtb抗原特异性CD4+T和CD8+T细胞应答水平,有利于提高BCG的免疫原性,为增强BCG逐渐下降的抗结核保护效果提供新思路.     

HIV gag DNA疫苗诱导小鼠特异性细胞免疫应答的研究

目的 研究小鼠注射HIV gag DNA疫苗后的抗原特异性细胞免疫应答.方法 C57BL/6小鼠以初免/加强的策略经肌肉注射HIV gag DNA疫苗,一周后获取其脾与肺的单个细胞,体外经Gag抗原多肽刺激后,采用ELISA法检测细胞培养上清中IFN-γ的水平,ELISPOT法检测IFN-γ分泌细胞的频率,流式细胞仪分析特异性T细胞的亚群.结果 经Gag多肽刺激后,加强免疫组IFN-γ产生的总体水平和分泌细胞频率均高于对照组及初次免疫组.HIV gag DNA疫苗可同时诱导产生Gag-特异性CD4 和CD8 T细胞.结论 HIV gagDNA疫苗免疫小鼠后可诱导抗原特异性效应性T细胞应答.