人工抗原诱发的毒蕈碱样胆碱受体亚型特异抗体

人工合成ｍ１和ｍ２胆碱受体蛋白在细胞外侧的一段多肽，联接蛋白ＫＬＨ后免疫家兔，制备出抗血清，经ＥＬＩＳＡ法，免疫组化测定，该抗血清具有效价高和特异性强的特点。人工抗原制备高效价特异性ｍ受体亚型抗体对进一步了解药物与ｍ受体相互作用的分子机制以及建立新型Ｍ受体的检测方法均有重要意义。     

Mrell多克隆抗体的制备及初步鉴定

目的原核表达人Mrell蛋白,并制备出Mrell蛋白的多克隆抗体,为研究Mrell蛋白功能奠定基础。方法以人cDNA文库为模板,构建出原核表达质粒PET41a—Mrell,然后转化受体茵E-coliBL21,再经IPTG诱导表达,通过采用GST亲和纯化获得GST-融合蛋白,将该融合蛋白免疫免以制备出Mrell多抗血清,最后采用western—blot及免疫荧光等方法检测其在细胞中的特异性。结果在受体茵E-coliBI。21中成功诱导表达出了GST—Mrell融合蛋白,免疫新西兰大白兔后获得了高效价的Mrell蛋白抗血清,IP、western—blot及免疫荧光等多种方法检测证实该抗血清能够特异性识别293T和U20S细胞株中Mrell蛋白,并能够正确清楚检测293T和U20S细胞株中的Mrell表达情况,具有良好的特异性和高效性。结论成功制备出了兔抗人Mrell蛋白的多克隆抗体,为深入研究Mrell蛋白在DNA损伤中的功能奠定了基础。     

免疫耐受法制备抗感觉神经元抗体

根据免疫耐受大批量，用兔运动神经细胞蛋白组分作为耐受原，接种于新生ＳＤ大鼠并诱导产生免疫耐受现象。然后以兔感觉神经细胞蛋白组分作为制备特异性抗体的抗的，接种于已对运动神经细胞蛋白产生耐受的ＳＤ大鼠。经此方法制备特异性抗感觉神经细胞的抗血清，用免疫组织化学方法检测抗血清的特异性。结果表明，抗血清只对感觉神经细胞产一阳性反应，对运动神经细胞则表现为阴性反应。本研究说明，如果两种细胞蛋白组分中含有共同抗     

鲤鱼肠道黏附受体分离与抗血清制备及体外黏附试验

目的分离并鉴定鲤鱼肠道中与乳杆菌和其他细菌定植相关的黏附受体蛋白。方法用SDS-PAGE电泳分离鲤鱼肠道中相对分子质量为26 200的蛋白,免疫小鼠制备抗血清,免疫印迹试验检测抗血清对该蛋白结合的特异性。应用体外黏附模型,测定鲤鱼肠道黏液对乳杆菌新种L15、嗜酸乳杆菌和致病性大肠杆菌的黏附作用。结果乳杆菌L15、嗜酸乳杆菌和大肠杆菌均不同程度地表现为对鲤鱼肠道黏液的黏附,该黏附作用可被抗目的蛋白的抗血清显著抑制。结论鲤鱼肠道内相对分子质量为26 200的蛋白质与两株乳酸菌的黏附相关,也是大肠杆菌在鲤鱼肠道内定植的黏附受体。乳酸菌与大肠杆菌在鲤鱼肠道内可竞争同一受体,乳酸菌也正以此来对病原菌产生定植拮抗作用。     

nm23-M2 cDNA克隆、表达及抗体制备

为通过基因工程技术表达和纯化重组nm23-M2蛋白，进而制备高效价、高特异性的抗血清。构建在大肠杆菌中高效表达pQE30／nm23-M2表达质粒，Ni^＋-NTA亲和层析纯化；用纯化蛋白免疫兔，制备抗血清并纯化，琼脂双向扩散法测效价，免疫组织化学比较它与抗NM23-H2抗体的特异性。结果：nm23-M2 cDNA序列完全正确，表达的17KD可溶性融合蛋白占菌体总蛋白45％，纯化后纯度97％以上，抗血清效价为1：64—128，提纯后纯度在90％以上，特异性高于NM23-H2抗体。     

粒细胞集落刺激因子基因克隆,表达及免疫检测

目的：获得纯净的抗Ｇ－ＣＳＦ蛋白的抗体，用以鉴定、检测和纯化人Ｇ－ＣＳＦ。方法：将经过改造的粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）基因重组到ＰＷＲ－４５０－１载体上得到重组质粒，转化大肠杆菌，抽提纯化ＰＷＲ－４５０－ＧＣＳＦ融合蛋白，作为抗原用以免疫兔子，获得抗血清，并对抗血清进行初步纯化，检测其效价和特异性程度。结果：用ＥＬＩＳＡ方法和ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ方法检测抗血清发现本实验所获得的抗血清和融合蛋白及ＰＷＲ－４５０－１均有专一性反应，有一定的特异性。     

小鼠子宫角注射层粘连蛋白及其抗血清对胚泡着床的影响

目的：研究层粘连蛋白及其特异性抗血清对胚泡着床的影响。方法：在小鼠子宫角内注射层粘连蛋白及其特异性抗血清，并对胚胎着床率与子宫内膜变化进行组织学观察。结果：提示外源性层粘连蛋白在小鼠体内有促进胚泡粘附、植入子宫内膜的趋势，但作用不明显；而层粘连蛋白抗血清则有显著抑制小鼠胚泡着床的效应。结论：小鼠体内的层粘连蛋白对胚胎粘附、着床起重要作用。     

抗草丁膦bar基因的原核表达与多克隆抗体的制备

T的抗血清.ELISA检测抗血清效价达到1:51 200,Western blot检测证实抗血清能与目的蛋白特异性结合.结论:以纯化的bar基因表达蛋白PAT作为抗原,制备了特异性较高的抗PAT抗体.     

HCMV pp65在原核细胞中的表达、纯化及其抗血清的制备

目的 采用原核表达系统获得HCMV pp65目的 蛋白,免疫家兔制备该蛋白特异性抗血清.方法构建表达GST-HCMV pp65融合蛋白的质粒,在大肠杆菌中诱导表达,经GST亲和层析纯化后的pp65蛋白免疫家兔,获得兔多克隆抗血清.采用ELISA、SDS-PAGE电泳及Western blot检测纯化后的蛋白,并以间接免疫荧光染色法检测鉴定该蛋白的抗原性.结果成功构建PGEX-5X-pp65重组质粒,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,获得可溶性的融合蛋白;GST亲和层析纯化后的蛋白免疫家兔获得特异性抗血清.结论 在原核细胞中成功获得了融合蛋白pp65,免疫家兔后获得具有高度特异性抗血清.为进一步揭示该蛋白的功能及作用机制奠定了重要基础.     

人神经元特异性烯醇化酶蛋白表达及抗体制备

目的克隆和表达人的神经元特异性烯醇化酶(HuNSE)基因,制备HuNSE多克隆抗体,以期用于朊病毒病及相关疾病的临床诊断。方法经RT-PCR扩增HuNSE基因和测序验证后,将其克隆于原核表达载体pQE30,在大肠杆菌M15中诱导表达HuNSE蛋白,蛋白经Ni-NTA亲和纯化后,免疫兔子,所制备的抗血清用ELISA、Westernblotting和免疫组化鉴定。结果所表达的HuNSE蛋白相对分子质量约为22000,以其为抗原制备的HuNSE特异性抗血清具有良好的免疫反应性。Westernblotting和免疫组化结果显示抗血清可识别重组和不同哺乳动物脑组织中的NSE蛋白。结论NSE基因在大肠杆菌中获得了高效表达,所制备的NSE特异性抗血清可用于朊病毒病及其他神经退行性疾病的诊断和研究。     

黄鳝IgM的分离纯化及兔抗黄鳝IgM抗血清的制备

目的分离纯化黄鳝血清免疫球蛋白,制备其兔抗血清,并检测抗血清的特异性。方法用Protein A亲和层析的方法纯化黄鳝血清免疫球蛋白,通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白的纯度,免疫大耳白兔制备抗血清,利用免疫双扩散检测抗血清的效价,通过western blotting检测抗血清的特异性。结果纯化了黄鳝血清免疫球蛋白,免疫双扩散法测定兔抗黄鳝免疫球蛋白血清效价为1∶32,western blotting结果显示抗血清具有很好的特异性。结论成功纯化了黄鳝免疫球蛋白,制备了兔抗黄鳝IgM抗血清,为建立黄鳝的血清学检测系统奠定了基础。     

Myosin-Vc特异性片段的原核表达及其抗血清的制备

目的 原核表达Myosin-Vc(Myo5c)蛋白并纯化,制备小鼠、家兔多克隆抗体,为探索MyoSc在病毒感染中的作用提供研究工具.方法 采用RT-PCR方法从人胃粘膜组织中克隆编码Myo5c特异性蛋白的基因片段,构建该片段与6×His标签的融合蛋白表达质粒pQE-31/Myo5c,原核表达与蛋白纯化后,分别免疫BALB/c小鼠和新西兰兔,制备Myo5c抗血清.采用ELISA检测抗体效价,Western blot和间接免疫荧光染色检验抗体特异性.结果 获得Myo5c特异性片段约42×103的纯化蛋白.ELISA检测小鼠和家兔抗血清效价分别为1:12 800、1:6 400.Western blot和间接免疫荧光染色显示所制备的抗体能特异性识别Myo5c.结论 获得Myo5c特异性蛋白,并成功地制备了Myo5c特异性的小鼠和家兔抗血清.     

小鼠BPI_(36-259)抗菌蛋白在原核细胞中的表达及其抗血清的制备

目的采用原核表达系统获得小鼠BPI36-259目的抗菌蛋白,免疫家兔制备目的蛋白特异性抗血清。方法利用生物信息学方法预测小鼠BPI功能片段,构建pUC57-muBPI1-281质粒;PCR扩增获得mu BPI36-259基因片段,构建pET28a-mu BPI36-259重组质粒;用IPTG诱导重组质粒转化的E.coli BL21(DE3)感受态细胞,获得以包涵体形式表达为主的mu BPI36-259目的蛋白;用变性目的蛋白免疫家兔获得兔抗鼠BPI36-259蛋白特异性抗血清;用间接ELISA法检测血清抗体特异性及其效价。结果成功构建了pET28a-mu BPI36-259重组质粒,转化E.coli BL21(DE3)获得以包涵体表达形式为主的目的蛋白;用变性目的蛋白免疫家兔获得小鼠BPI36-259蛋白特异性抗血清(效价1∶10000)。结论在原核细胞中成功获得了以包涵体表达形式为主的抗菌蛋白,免疫家兔获得的特异性抗血清可用于小鼠BPI36-259目的抗菌蛋白的检测。     

人PINK1抗血清的制备及其免疫活性物质在大鼠脑组织中的表达

目的制备帕金森病相关蛋白PINK1抗血清并检测其在大鼠脑组织中的表达特征。方法制备人PINK1基因重组蛋白,免疫新西兰大耳白兔获得抗PINK1抗血清;通过盐析法初步纯化、Western blotting法鉴定抗血清的敏感性和特异性、免疫组化法检测PINK1在大鼠脑中的分布。结果人PINK1基因重组蛋白以包涵体形式在大肠杆菌中高效表达;纯化蛋白制备兔抗血清经盐析纯化后,兔抗人PINK1抗血清特异性识别人PINK1基因重组蛋白及大鼠脑匀浆中40000和66000的蛋白质,与预期结果一致;免疫组化染色显示PINK1广泛分布在嗅球、皮质、海马、纹状体、小脑、黑质和红核。结论制备了一种兔抗人PINK1多克隆抗血清;PINK1广泛分布于大鼠中枢神经系统;为以后深入研究PINK1表达的组织分布、细胞内定位及其生物学功能提供了有效地实验工具。     

GST融合蛋白制备表皮生长因子受体抗体

目的：探讨制备大量表皮生长因子受体(EGFR)特异性抗体的方法。方法：将编码EGFR的N端肽段的cDNA克隆入表达载体pGEX-4T-3中,转化大肠杆菌BL-21,经IPTG诱导表达后,经亲和层析柱纯化,用该GST融合蛋白免疫BALB／C小鼠,获得免疫血清,以ELISA和Western Blot检测抗体滴度。结果：获得GST—PTB融合蛋白纯度大于95％;经免疫小鼠抗血清滴度1：38827～1：190602,得到大量高滴度的EGFR特异性抗体。结论：用原核系统表达GST融合蛋白直接免疫小鼠可以快速、大量地制备EGFR特异性抗体。     

人胎盘运铁蛋白受体的提纯、鉴定及其抗血清的制备

以人胎盘绒毛膜为原料提纯运铁蛋白受体,是用1％Triton X-100增溶所得可溶性绒毛膜蛋白,经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离,再经蛋白质硝酸纤维纸转移电泳后,以免疫酶标染色法及同位素碘标放射自显影法检测出运铁蛋白受体蛋白的区带。切取此区带,用生理盐水浸出,超滤浓缩后得到电泳纯的运铁蛋白受体。每个新鲜人胎盘可提取运铁蛋白受体蛋白约200μg,用SDS-PAGE测定其分子量(MW)为90,000。用卵清蛋白、人血清a_1-酸性蛋白、人IgG竞争抑制试验证明此受体与运铁蛋白特异性结合。用提纯的运铁蛋白受体免疫家兔,得到抗人运铁蛋白受体抗血清。采用间接免疫酶标法检测人宫颈癌培养细胞株(HeLa)及人肝癌培养细胞株(SMMC-7721),证明其细胞膜上运铁蛋白受体含量均增高。     

一个新的人信号识别微粒受体基因APMCF1的克隆、表达和抗体制备

目的：克隆人类新基因APMCF1，原核表达并制备其特异性多克隆抗体．方法：运用5’末端快速扩增方法，结合Genbank数据库进行电子拼接，完善APMCF1的5’端序列；利用RT-PCR方法，扩增出APMCF1的蛋白编码cDNA序列，克隆入pGEX-KG中，构建APMCF1的原核表达载体，在大肠杆菌中诱导表达后获得了GST-APMCF1融合蛋白，以此融合蛋白为免疫原制备兔抗血清，用Western blot鉴定抗体特异性．结果：通过RACE及电子拼接，完善了APMCF1的5’端序列，其cDNA长度为1745bp，与鼠信号识别微粒受体β亚基序列同源性较高，染色体定位于3q22．2；克隆了APMC2F1 816bp的开放读框序列并表达了GST-APMCF1融合蛋白．制备了特异性兔抗GST-APMCF1多克隆抗体．结论：APMCF1可能是编码人类信号识别微粒受体β亚基的基因．该分子多克隆抗体的初步制备，为进一步研究APMCF1的功能提供了必要工具。     

血吸虫极低密度脂连结蛋白的表达及免疫原性鉴定

目的：在大肠杆菌中表达日本血吸虫特异性极低密度脂连结蛋白(SVLBP)，纯化并鉴定其免疫活性。方法：SVLBP基因克隆菌在IPTG诱导下大肠杆菌中以6个组氨酸融合蛋白形式大量表达；非变性条件下制备克隆菌裂解液，离心后上演液经凝胶亲和层析纯化重组蛋白，已纯化的重组SSVLBP免疫家兔制备特异性抗血清，用SDS—PAGE和Western blot鉴定其免疫活性。结果：克隆菌在IPIG诱导下能大量表达重组蛋白SVLBP；重组SSVLBP蛋白能诱导家兔产生单特异抗体，琼脂双扩散法测抗体滴度＞1：16；表达产物能与血吸虫病人血清反应；单特异抗血清能识别天然成虫可溶性膜抗原的单一蛋白。结论：SVLBP能在克隆菌中大量表达并且具有较好的免疫原性。     

利用DNA免疫技术制备抗登革2型病毒NS2B蛋白多克隆抗体

目的构建登革2型病毒(dengue virus serotype2,DV2)非结构蛋白NS2B的真核表达质粒pCAGGS-P7/NS2B,进行DNA免疫,制备小鼠抗NS2B特异性多克隆抗体。方法PCR扩增DV2-NS2B基因片段,构建真核表达载体pCAGGS-P7/NS2B,采用脂质体介导的方法转染Vero细胞,检测目标蛋白的表达。用该表达质粒免疫BALB/c小鼠,制备抗NS2B抗血清。结果成功构建真核表达重组质粒pCAGGS-P7/NS2B,该重组质粒具有良好的免疫原性,免疫小鼠后所获的抗血清,抗体效价达1∶3200,Western blot和间接免疫荧光证实抗血清能特异性地识别DV2-NS2B蛋白。结论通过DNA免疫所制备小鼠抗DV2-NS2B抗血清能特异性地识别DV2-NS2B蛋白。     

Wa细胞膜上与乙型肝炎病毒的preS1特异性结合的受体样蛋白

本文对与乙型肝炎病毒外周蛋白ｐｒｅＳ１特异结合的Ｂ细胞来源的Ｗａ细胞膜受体样蛋白进行了研究，用麦芽糖结合蛋白－ｐｒｅＳ１－直链淀粉树脂亲和层析柱分离得到了与ｐｒｅＳ１特异性结合的Ｗａ细胞膜受体样蛋白质，抗麦芽糖结合蛋白－ｐｒｅＳ１的单克隆抗体Ｆ３５．２５结合Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实确系膜蛋白与ｐｒｅＳ１的特异性结合，十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示，Ｗａ细胞膜上存在有三种不同的受体样蛋白，分子量分别为６００００，５６０００和４８０００．这表明在非肝细胞膜中也可能存在乙型肝炎病毒的特异性受体和直接感染途径。