禽多杀性巴氏杆菌OmpA DNA疫苗免疫效果的研究

目的:研究禽多杀性巴氏杆菌OmpA DNA疫苗在鸡体内诱导的免疫保护效果。方法:PCR扩增禽多杀性巴氏杆菌的ompa基因片段,克隆入pcDNA3.1(+)上,构建重组质粒pOMPA,体外转染SP2/0细胞,RT-PCR和免疫荧光试验检测目的基因的转录及表达情况。动物免疫共分四组:pOMPA组、弱毒疫苗组、pCDNA3.1(+)空载体组和PBS对照组,每组15只4周龄鸡,除弱毒疫苗组外其他三组均肌注免疫三次,每次间隔两周,弱毒疫苗组仅首免时肌注1羽份/每只鸡。间接ELISA检测免疫后血清特异性抗体水平,MTT法检测免疫鸡外周血淋巴细胞增殖情况,双抗夹心ELISA检测IFN~γ分泌情况,强毒攻击,计算免疫鸡存活数目及保护率。结果:体外转染检测结果表明pOMPA可在体外培养的细胞中表达目的蛋白。动物免疫后,DNA疫苗组和弱毒疫苗组血清抗体水平持续上升,与两对照组相比差异极显著(P<0.01),且弱毒疫苗组血清抗体水平明显高于DNA疫苗组(P<0.05)。经提取的外膜蛋白(Omps)诱生后,两疫苗组的SI值极显著高于pCDNA3.1(+)组和PBS免疫组(P<0.01),两疫苗组之间则无差别。两疫苗组免疫鸡外周血淋巴细胞产生的IFNγ-极显著高于两对照组(P<0.01)。强毒攻击后DNA疫苗组和弱毒疫苗组的保护率分别为60%和73.3%。结论:成功构建了禽多杀性巴氏杆菌OmpA DNA疫苗,该疫苗为动物提供一定的免疫保护力,但不够理想。     

羊种布氏杆菌核酸疫苗的制备及其免疫效果

目的：构建羊种布氏杆菌基因组DNA表达文库,并研究其免疫效果。方法：将羊布氏杆菌基因组DNA经限制性内切酶Hind Ⅲ消化后,克隆入pSV-β-Gal质粒,构建含羊布氏杆菌基因组DNA酶切片段的表达文库,用构建的表达文库经股四头肌免疫小鼠,结果：从文库中筛选了26个含羊种布氏杆菌基因组DNA片段的细菌克隆。免疫小鼠,可以刺激小鼠产生羊种布氏菌凝集抗体,并使淋巴细胞转化率明显增高,结论：构建的羊布氏杆菌基因组DNA表达文库可以刺激小鼠产生体液免疫应答和细胞免疫应答。此工作为制备有效的布氏杆菌及其它胞内寄生菌疫苗提供了实验基础。     

禽多杀性巴氏杆菌(5∶A)荚膜保护性抗原提纯及单克隆抗体细胞系的建立

用机械物理方法与Sephadex G-200分子筛层析、DEAE-cellulose离子交换层析相结合,将多杀性巴氏杆菌(5∶A)荚膜抗原粗提物(CE)分为P_1、P_2两种成份,并经免疫保护性试验证明:荚膜中含有保护性蛋白成份P_1,P_1分子量为129.1 kD,且至少含分子量分别为46.7kD、42.6kD和39.8kD的3种蛋白亚基。 用CE免疫BALB/c小鼠,首次建立了2株抗P_1的单克隆抗体细胞1B和2B_7。特异性试验表明,所制备的McAb只与多杀性巴氏杆菌反应,而不与其他细菌交叉为特异性高、纯度高的单克隆抗体,对于多杀性巴氏杆菌病的诊断、流行病学调查及防治有一定的意义。     

DNA疫苗的免疫机制及其优化策略

DNA疫苗的研究成为疫苗研究领域的热点,被誉为疫苗研究的第三次革命,开创了人类与疾病作斗争的疫苗研究新篇章。DNA疫苗既可以诱导细胞免疫又可以诱导体液免疫应答,成为最有希望的新型疫苗之一,但其免疫机制还不是十分清楚,免疫原性相对较弱,限制了DNA疫苗的广泛应用。     

双歧杆菌菌处理体对疫苗诱导免疫应答的影响

双歧杆菌为人体益生菌 ,富含细胞壁肽聚糖 (ＷＰＧ)、脂磷壁酸 (ＬＴＡ)及细菌核酸 (ＤＮＡ)等佐剂成分。口服双歧杆菌制剂具有免疫调节作用得到许多实验证实。本实验用乙酸、丙酮等有机溶剂去除细菌的特异性表面抗原壁磷壁酸 ,保留ＷＰＧ、ＬＴＡ、ＤＮＡ等成分 ,偶联基因工程乙肝表面抗原前Ｓ2 (ｐｒｅ Ｓ2 )形成“拟菌颗粒” ,皮下接种Ｃ5 7 ＢＬ 6小鼠 ,并以抗原、弗氏完全佐剂 (ＣＦＡ)、商品乙肝疫苗 (史克公司产品 )作为对照 ,每次皮下接种 0 .1ｍｌ,2次免疫后 5周测定小鼠的免疫指标 ,以评判菌处理体的佐剂效果。ＥＬＩＳＡ方法测定…     

HIV-2 DNA疫苗免疫小鼠的免疫反应观察

目的：用构建的HIV－2外膜蛋白gp105和核心蛋白gag基因的DNA疫苗免疫小鼠，评价其免疫效果。方法：将HIV－2型gp 105和gag基因克隆到表达载体pIRES1neo中，构建重组DNA疫苗质粒。间接免疫荧光试验证明，构建的DNA疫苗在真核细胞中表达了gp105或／和gag.构建的疫苗免疫小鼠后，用流式细胞仪测定CD4^ 、CD8^ T淋巴细胞亚类数，并用HIV－2抗体ELISA检测试剂盒检测免疫鼠血清中抗HIV－2抗体水平。结果：构建了3种HIV－2 DNA疫苗pIRES1gag、pIRSE1gp105和pIRES1gag-gp105，转染BHK细胞后均能表达抗原蛋白，免疫小鼠后可有效地刺激淋巴细胞增殖并诱导产生抗HIV－2特异性抗体，其中pIRES1gag-gp105免疫鼠中，淋巴细胞增殖最显著，而pIRES1gp105免疫鼠中HIV－2特异性抗体水平最高。结论：构建的DNA疫苗均能诱导机体产生免疫反应，其中pIRES1gp105诱导的体液免疫应答最显著，而pIRES1gag-gp105 诱导的细胞免疫响应最显著。     

日本血吸虫组织蛋白酶B DNA疫苗的免疫保护效果研究

目的 :观察已构建日本血吸虫大陆株 31kDa组织蛋白酶BDNA疫苗VR1 0 1 2 Sj31及VR1 0 1 2 SjGST Sj31在BALB c小鼠体内的免疫保护效果。方法 :用纯化的空白质粒载体VR1 0 1 2、重组质粒VR1 0 1 2 Sj31及VR1 0 1 2 SjGST Sj31于股四头肌注射免疫BALB c鼠 :将 36只 6～ 8周龄BALB c鼠随机分为 3组 ,每组 1 2只 ,对照组 (A组 )注射空白质粒载体VR1 0 1 2 ,B组注射重组质粒VR1 0 1 2 Sj31 ,C组注射重组质粒VR1 0 1 2 SjGST Sj31。质粒剂量均为 1 0 0 μg ,每隔 2周免疫 1次 ,共免疫 3次 ,第 3次免疫后第 2 1天 ,每只鼠经腹部感染 1 0条尾蚴 ,4 2天后剖杀计数各小鼠成虫数和每克肝卵数 ,观察诱导产生的减虫和减卵效果 ,并用ELISA分析小鼠血清中的抗体。结果 :ELISA分析表明 ,第 3次免疫后小鼠出现特异性IgG抗体。与空白质粒对照组比较 ,2个实验组的减虫率分别为 2 5 0 %及 30 0 % (P <0 0 5 ) ,肝组织减卵率分别为 5 4 90 %及 6 9 74 % (P <0 0 0 1 ) ,每雌肝减卵率分别为 4 7 96 %、5 4 6 2 % (P <0 0 0 1 )。与B组相比 ,C组的肝组织减卵率为 32 92 % (P <0 0 0 1 ) ,每雌肝减卵率为 1 2 79% (P <0 0 5 )。结论 :DNA疫苗VR1 0 1 2 Sj31和VR1 0 1 2 SjGST Sj31能诱导小鼠产生一定水平的抗     

细胞因子佐剂对HIV DNA疫苗免疫效果的影响

根据联合国艾滋病规划署(UNAIDS)资料，在艾滋病流行的20年里，全世界已有6000万人感染了人类获得性免疫缺陷病毒(HIV)，其中1／3已因艾滋病或HIV感染相关疾病而死亡。尽管目前公认疗效较好的高效抗逆转录病毒治疗(HAART)在抗HIV感染中取得一定效果，但由于药物昂贵和HIV耐药株的产生影响了艾滋病治疗，限制了其在发展中国家使用。因此，最终将需要一种有效的疫苗来控制HIV感染的流行及传播。近年来，不少学者研究了多种类型的HIV疫苗，其中最引人关注的是HIV—1 DNA疫苗(核酸疫苗)。     

汉滩病毒重组腺病毒疫苗与DNA疫苗的联合免疫效果分析

汉坦病毒基因组由L、M、S3个负链RNA片段组成，M片段编码囊膜糖蛋白G1和G2，G1和G2在病毒的吸附、病毒膜与细胞膜的融合、中和抗体的产生等方面起着重要作用。以腺病毒为载体的活载体疫苗安全性好，能有效感染呼吸道和肠道等组织细胞，不仅能激发黏膜免疫，还能诱导系统免疫和细胞免疫反应。我们分别以腺病毒和质粒pcDNA3．1为载体，构建了含有完整汉滩病毒基因M片段和单独表达G1的重组腺病毒和重组DNA疫苗。DNA疫苗能够引发体液和细胞介导的免疫应答，但接种后只能引发很弱的免疫应答。为了克服上述疫苗的缺     

柯萨奇B3病毒结构和非结构蛋白DNA 疫苗诱导小鼠产生免疫应答的研究

目的 制备4种柯萨奇B3病毒（CVB3）结构和非结构蛋白重组质粒DNA疫苗,并探讨其诱导机体产生体液和细胞免疫应答的效果。方法 用基因重组技术构建4种CVB3结构和非结构蛋白重组质粒,将各重组质粒体外转染真核细胞,用Western blot检测表达产物;于BALB／c小鼠后腿胫骨前肌注射免疫,于0、4、8周共免疫3次,100μg/次。免疫后不同时间检测体液和细胞免疫应答指标。结果 4种重组质粒酶切出相应大小的片段,经测序证实为CVB3序列,Western blot证实能够在体外真核细胞中表达。pcDNA3/vp2、pcDNA3/VP1、pcDNA3/2A和pcDNA3/3D均可诱导小鼠产生相应的特异性抗体、细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和淋巴细胞增殖反应、迟发型超敏反应（DTH）,并对致死量的CVB3m、CVB5和CVB2攻击具有保护作用,表现为病毒攻击后第3天血中病毒滴度降低,第10天心肌病理变化比对照组明显减轻,且小鼠生存率显著提高。其中以pcDNA/VP1和pcDNA3／3D组保护作用最明显。结论 CVB3结构蛋白VP1和非结构蛋白3D质粒DNA有可能用作CVB DNA疫苗的候选基因,值得进一步深入研究。     

呼吸道合胞病毒DNA疫苗的构建和免疫效果的初步观察

目的构建呼吸道合胞病毒（RSV）的DNA疫苗并对其免疫效应进行观察,为RSV的免疫预防提供新思路。方法构建表达RSV-F蛋白的质粒pcD—F,接种BALB／c小鼠后以RSV long株进行攻击,于攻击当日和攻击后第5、14天采用ELISA和ELISPOT方法分别检测小鼠RSV特异性IgG抗体和分泌RSV特异性IFN-γ的淋巴细胞,荧光定量PCR方法检测小鼠肺组织RSV—RNA的含量。肺组织切片行苏木精-伊红染色,观察RSVlong株攻击后肺组织病理改变。结果pcD-F免疫小鼠后,产生RSV特异性IgG抗体（滴度1：60）,RSV攻击后第14天,pcD—F免疫小鼠的特异性IgG抗体水平升至1：250,明显高于对照组（P〈0．05）。RSV攻击后,pcD—F免疫小鼠分泌RSV特异性IFN-γ的淋巴细胞升至99个／1×10^5细胞,明显高于对照组的9个／1×10^5细胞（P〈0．05）。pcD-F免疫小鼠的肺部炎症反应明显轻于对照组,肺部RSV得到有效的清除。结论成功构建的RSVDNA疫苗具有良好的免疫原性。     

Effectivity of oral recombinant DNA vaccine against Streptococcus agalactiae in Nile tilapia

The effects of oral vaccination by two immune routes (gavage and mixed fodder administration) using a recombinant DNA vaccine SL7207-pVAX1-sip against Streptococcus agalactiae were assessed. SL7207-pVAX1-sip significantly enhanced various innate immune responses of tilapia, such as total serum protein, superoxide dismutase activity, lysozyme activity, complement C3 concentration in serum, serum antibacterial activity, and interleukin 1β and tumor necrosis factor-α. Vaccinated fish had higher relative percent survival values (57% and 63% for gavage group and mix fodder administration, respectively) at 10 weeks after S. agalactiae infection. When administered mixed fodder, the DNA vaccine SL7207-pVAX1-sip against S. agalactiae may produce more effective protection. These findings can promote the application and development of DNA vaccines in aquaculture.     

pcDNA3.1/MAGE-3-HSP70融合蛋白诱导特异性抗肿瘤免疫应答的研究

目的构建重组表达质粒pcDNA3．1／MAGE-3-HSP70，观察其诱导免疫应答的能力和抗肿瘤免疫治疗的作用。方法通过RT-PCR扩增MAGE-3和HSP70 cDNA，以pcDNA3．1为载体，构建pcDNA3．1／MAGE-3-HSP70重组质粒，肌肉注射接种小鼠，间隔7d，共3次，以pcDNA3．1／MAGE-3、pcD—NA3．1／HSP70、pcDNA3．1和PBS为对照，检测脾淋巴细胞CTL杀伤活性、脾细胞培养上清IL-2、IFN-γ浓度、外周血淋巴细胞亚群变化及鼠血清中抗MAGE-3抗体水平。pcDNA3．1／MAGE-3-HSP70重组质粒免疫已负荷B16／MAGE-3的小鼠，观察小鼠成瘤时间、生存时间。结果pcDNA3．1／MAGE-3-HSP70质粒免疫的小鼠，其脾淋巴细胞对MAGE-3阳性靶细胞表现出明显的杀伤活性，与各对照组相比，P〈0．01，差异有统计学意义；外周血中CD4^＋、CD8^＋T细胞和脾细胞培养上清中TH1类细胞因子IFN-γ、IL-2水平明显升高。pcDNA3．1／MAGE-3-HSP70重组质粒免疫已负荷B16／MAGE-3的小鼠后，小鼠成瘤时间明显延迟，生存期明显延长。结论pcDNA3．1／MAGE-3-HSP70DNA疫苗在体内能诱导出显著的MAGE-3特异性抗肿瘤免疫应答，且能抑制体内已经存在的少量肿瘤细胞的成瘤。     

二价轮状病毒灭活疫苗的免疫效果评价

目的 评价二价轮状病毒灭活疫苗免疫效果,探讨其开发的可行性.方法 首先将G1型和G3型轮状病毒灭活疫苗等量混合制备二价疫苗,设立抗原量相等的G1型、G3型单价疫苗对照及PBS阴性对照,然后肌内注射免疫小鼠,通过ELISA检测血清和肠道中病毒特异性IgG和IgA、微量中和实验检测血清中病毒特异性中和抗体,ELISPOT分析免疫小鼠脾细胞中病毒特异性IFN-γ分泌细胞和IL-4分泌细胞的数量,评价二价疫苗的免疫效果.结果 与阴性对照组相比,二价疫苗显著诱发了G1和G3特异性血清IgG、IgA、中和抗体和肠道IgG、IgA.与单价疫苗组相比,二价疫苗诱发的G1特异性血清IgG和IgA、肠道IgG和IgA及血清中和抗体与G1单价疫苗组诱发的相应抗体间差异无统计学意义;但二价疫苗组诱发的G3特异性血清IgG(t=2.691,P＜0.05)及中和抗体(t=2.561,P＜0.05)却显著高于G3单价疫苗组诱发的相应抗体水平,其余G3特异性抗体水平两者无差异.同时,与阴性对照组相比,二价疫苗免疫小鼠脾细胞中IFN-γ和IL-4分泌细胞的数量均显著增加.与单价疫苗组相比,G1刺激产生的IFN-γ和IL-4分泌细胞的数量,二价疫苗组与G1单价疫苗组无显著差异;但在二价疫苗组,G3刺激产生的IL-4分泌细胞的数量显著高于G3单价疫苗组(t=2.327,P＜0.05),而IFN-γ分泌细胞的数量两组无显著性差异.结论 二价疫苗可以有效的诱发免疫应答,疫苗不同成分诱发的免疫应答未发生干扰抑制,这些结果为临床二价轮状病毒灭活疫苗的开发提供了实验依据.     

DNA fingerprinting of Pasteurella multocida recovered from avian sources

Repetitive sequence-based PCR (rep-PCR) and amplified fragment length polymorphism (AFLP) were used to characterize a sample of 43 field isolates and 4 attenuated vaccine strains of Pasteurella multocida recovered from multiple avian species. Both rep-PCR and AFLP assays were rapid and reproducible, with high indices of discrimination. Concordance analyses of rep-PCR and AFLP with somatic serotyping indicate that, in general, somatic serotyping is a poor indicator of genetic relatedness among isolates of P. multocida. In addition, the data provide evidence of host specificity of P. multocida clones. Overall, the results of our study indicate that the rep-PCR and AFLP techniques enable rapid fingerprinting of P. multocida isolates from multiple avian species and enhance the investigation of fowl cholera outbreaks.     

IL-2 preS DNA疫苗免疫正常小鼠和HBV转基因鼠的免疫应答研究

目的 探讨IL—2 preS DNA疫苗作为预防和治疗性疫苗的可行性及作用机理。方法 应用基因重组技术，构建人白细胞介素2(hIL-2)和前表面抗原(preS)的真核表达载体，将此重组载体用基因枪分别注射正常的BALB／c小鼠和HBV转基因小鼠，通过ELISA方法检测BALB／c小鼠和HBV转基因鼠的抗-preS2、HBsAg及抗-HBs抗体水平；荧光定量PCR方法检测HBV转基因鼠血清中HBV DNA拷贝数，并用免疫病理HE染色观察小鼠肝组织炎症活动度，同时检测肝功能指标。结果 ①基因枪注射真核表达质粒免疫正常小鼠后，100％小鼠能在第4、6周检测到抗preS1抗体，持续时间长达10周。②用IL-2 preS真核表达质粒基因枪肌肉注射方式优于正常肌肉注射和皮下注射的方式，且所需质粒量(10μg／只)仅为后者(100μg／只)的1／10。③在第4周高峰期检测IgG亚类，是诱导以TH1(IgG2a)细胞免疫为主的反应。④基因枪注射真核表达质粒(1μg／只)免疫转基因小鼠后，80％的小鼠产生了抗体，HBV DNA量下降，其中20％的小鼠HBsAg转阴。⑤HE肝组织染色显示：肝组织有明显的炎细胞浸润、肝细胞肿大、颗粒样变性、转氨酶升高。结论 IL-2 preS DNA疫苗能刺激小鼠机体产生体液和细胞免疫，可部分打破小鼠机体的免疫耐受，为新型乙肝疫苗和抗HBV持续性感染的特异性免疫治疗剂的设计和构建提供理论与实践依据。     

插入IL-2基因优化HBV DNA疫苗的研究

目的：观察IL-2基因的插入对DNA疫苗免疫效应的影响，探讨优化DNA疫苗设计、提高DNA疫苗兔疫效应的途径。方法：采用PCR产物直接克隆和重组DNA技术构建了人IL-2和HBsAg融合基因的真核表达载体pcDNA3．1 -S/IL-2，通过脂质体基因转移技术导入Cos-7细胞中检测其瞬间表达，并经肌肉注射免疫C57Bl/6小鼠，以检测和比较它们的细胞和体液免疫应答。结果：通过酶切、PCR及测序证实已正确完整地插入 IL-2基因，成功构建了 pcDNA3．1 -S/IL-2重组质粒。体外转染Cos-7后可见基因的表达和分泌，pcDNA3．1 -S/IL-2可以提高免疫小鼠的抗 HBs抗体滴度和脾淋巴细胞诱生的IL-2的生物活性水平，增加 HBsAg特异性的脾淋巴细胞增殖指数。结论：IL-2和 HBsAg基因的融合表达对 DNA疫苗的免疫反应起协同和增强作用，提示IL-2基因插入可能是增强DNA疫苗的免疫效应的可行途径。     

B细胞表位基因疫苗诱导特异性免疫应答及特性研究

为研究特异性B细胞表位短肽为基础的DNA疫苗的免疫应答特性,将鸭乙肝病毒Pre-S中的P127-138B细胞表位基因克隆到含多肽表达盒(peptideexpressioncassette,PEC)的载体中,体外转染C2C12肌肉细胞,用DOT-EIA检测表位短肽的表达,进一步分别免疫不同品系的BALB/c和C57BL/6小鼠,比较MHC限制性对免疫应答的影响。结果表明,重组pECk-b1b2载体可在体外瞬时高效表达,并保持原有的免疫活性;体内基因免疫能诱导针对表位短肽的特异性抗体;不同品系小鼠抗体产生动力学相似,但抗体滴度差异显著。这些结果提示,以B细胞表位为基础的基因免疫可诱导特异性免疫应答,为DNA疫苗的分子设计提供了新的思路和应用前景。