人血管内皮生长因子C基因真核表达载体的构建及鉴定

目的：克隆血管内皮生长因子C（Vascular Endothelial Growth Factor C）功能片段的cDNA，构建人VEGF-C基因的真核表达载体，以便进一步研究VEGF—C在宫颈癌中表达的意义及在淋巴管生长及转移中的作用。方法：根据人VEGF—CcDNA序列，设计合成二对特异性引物，第一对5’端含有EcoR Ⅰ及第二对3’端含有XhoI酶切位点。运用RT—PCR法克隆人MDA—MB231中的VEGF—C cDNA部分编码序列（CDS）：经双酶切后将其克隆入真核表达载体pcDNA3．1（＋），重组质粒在处于感受态的大肠杆菌DH5d中扩增，纯化。通过PCR和双酶切鉴定阳性重组子及进行基因序列的测定。结果：用RT—PCR克隆到VEGF—CcDNA部分CDS；PCR和双酶切鉴定阳性重组子，显示有人VEGF—C cDNA编码序列，基因序列测定显示重组质粒上插入的人VEGF—C序列正确。结论：从富含VEGF—C的人MDA—MB231细胞系中克隆得到的VEGF—C基因功能片段cDNA．成功构建了人真核表达栽体pcDNA3．1（＋）／VEGF-C。     

正反义人DNA(5-胞嘧啶)甲基转移酶基因片段真核表达载体的构建

DNA(5-胞嘧啶)甲基转移酶[DNA (Cytosine-5)-methyltransferase,DNMT]以组织特异的方式识别、催化和调节半甲基化的DNA子链胞嘧啶残基,并维持DNA甲基化模式[1].异常的DNA甲基化方式与人的某些肿瘤和发育异常有关[2～6].为探讨反义DNA片段对肝癌细胞株的阻抑作用,并阐明与恶性表型有关的癌相关基因转录和DNA甲基化水平的关系,我们采用PCR克隆技术进行构建DNMT正、反义基因片段真核表达载体的研究,现介绍如下.     

Survivin特异性siRNA真核表达载体的构建

目的构建Survivin特异性siRNA真核表达载体，为以Survivin基因为靶点、小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）为手段的白血病和其它恶性肿瘤基因治疗的基础和临床应用提供良好的技术手段。方法根据GeneBank数据库提供的Survivin基因所有变异体的共同核苷酸序列，按照Tuschl设计原则，选择设计双链siRNA，再转化为能表达其小发卡结构RNA（small hairpin RNA，shRNA）的DNA序列，并与载体pSINsi-hU6定向连接，构建受控于启动子u6的真核表达载体pSIN／shRNA1、pSIN／shR-NA2，经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定。结果构建Survivin特异性siRNA真核表达载体pSIN／shRNA1、pSIN／shRNA2，经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计完全一致。结论Survivin特异性siRNA真核表达载体构建成功。     

Twist基因真核表达载体的构建和表达检测

[目的]构建Twist基因读码框架至真核表达载体pCDNA3．1，为进一步研究Twist蛋白的功能做材料准备。[方法]采用RT-PCR方法，以正常人子宫体组织cDNA为模板，扩增Twist基因全长读码框架，并构建到真核表达载体pCDNA3．1中。[结果]经过克隆测序结果证实，成功将Twist基因读码框架插入真核表达载体pCDNA3．1的相应位置：将pCDNA-Twist载体转染细胞系后，发现Twist蛋白在细胞中得到高水平的表达。[结论]Twist真核表达载体的成功构建，为深入研究Twist蛋白对肿瘤转移的作用提供了理想的材料。     

Survivin反义RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的 为了特异封闭白血病细胞survivin的表达，抑制其功能，本实验构建了survivin反义核酸载体并导入白血病细胞系中。方法 应用RT—PCR获得survivin的cDNA片段，反向插入pcDNA3质粒载体中；经限制性酶切和测序鉴定所构建的反义核酸是否正确；采用电转染方法将重组体导入HL—60细胞中；RT—PCR技术检测转染细胞survivin表达的变化。结果 经限制性酶切和测序鉴定证明survivin反义核酸已成功构建；RT—PCR产物电泳结果显示，与转染前细胞、空质粒转染细胞相比，转染survivin反义核酸的细胞survivin mRNA水平明显降低。结论 本实验已成功建立了survivin反义核酸真核表达载体，而且在白血病细胞系中发挥了特异封闭作用，为进一步研究survivin反义核酸在白血病治疗中的作用提供了实验基础。     

膜-细胞骨架联接分子ezrin shRNA 真核表达载体的构建

 目的 构建膜-细胞骨架联接分子(ezrin)特异的RNA干扰质粒载体。 方法 设计转录短发夹状RNA (short hairpin RNAs, shRNA)的DNA 序列,与pSUPER质粒载体连接; 将构建成功的特异性表达载体(pSUPER-ezrin)转染至人乳腺癌MCF-7细胞系,并应用RT-PCR和Western blot检测ezrin的表达。 结果 与MCF-7细胞和转染空白质粒pSUPER细胞相比,转染pSUPER-ezrin表达载体的MCF-7细胞ezrin mRNA和蛋白的表达明显降低。 结论 构建的ezrin特异性shRNA表达载体可有效地沉默ezrin基因,为进一步研究ezrin表达对乳腺癌转移的影响奠定了基础。     

人微管不稳定蛋白基因真核表达载体的构建与表达及对食管癌细胞的作用

目的 构建人微管不稳定蛋白基因(stathmin)真核表达载体,研究其对食管癌细胞EC9706的作用.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增stathmin cDNA,克隆至pMDl8-T载体并酶切鉴定后,亚克隆至pEGFP-C2真核表达载体.将测序鉴定正确的重组载体和空载体经脂质体转染EC9706细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株.通过荧光显微镜观察转染细胞荧光蛋白的表达,采用Western blot检测转染细胞中增强型荧光蛋白(EGFP)和stathmin融合蛋白的表达.选取稳定转染的细胞株,采用细胞计数法绘制细胞生长曲线,采用流式细胞仪分析细胞的增殖状态,平板克隆形成实验、裸鼠移植瘤实验分析转染细胞成瘤性.结果 RT-PCR扩增获得450 bp的cDNA编码序列;克隆至pMD18-T载体,经酶切鉴定后获反向插入质粒;亚克隆至pEGFP-C2载体后,经酶切与测序鉴定,重组载体pEGFP-stathmin构建成功.重组载体和空载体转染EC9706细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株.通过荧光显微镜观察到,转染细胞中呈现绿色荧光;经Western blot证实,重组载体表达46 000的融合蛋白.与空载体转染细胞相比,转染重组载体的EC9706细胞形态变大,增殖速度减慢,细胞分裂阻滞于G2/M期,细胞克隆形成数减少,裸鼠体内成瘤性降低(P＜0.05).结论 构建的真核表达载体pEGFP-stathmin在食管癌EC9706细胞中能够稳定表达,并抑制肿瘤细胞的增殖和成瘤性.     

CUL5基因的RNA干扰真核表达载体的构建

目的:构建CUL5基因的RNA干扰真核表达载体,探索CUL5在鼻咽癌放射治疗中加速再增殖的作用.方法: 根据 GenBank数据库提供的 CUL5基因mRNA序列,按照Tuschl 设计原则,设计选择双链小干扰RNA( small interfering RNA,siRNA ) ,再设计合成为能表达其小发卡结构RNA(small hairpin RNAs,shRNA)的DNA序列,并与pGPU6/GFP/Neo质粒定向连接,构建真核表达载体,并进行限制性内切酶酶切和DNA测序鉴定.结果: 经限制性内切酶酶切和DNA测序证实质粒中插入的为所需序列,通过RT-PCR证实其能够干扰CNE2细胞的CUL5基因表达.结论: CUL5基因RNA干扰真核细胞表达载体的构建成功.     

VEGF-C基因RNA干扰真核表达载体的构建及其效果鉴定

目的：构建VEGF-C基因RNA干扰（RNAi）的真核细胞表达载体。方法：以VEGF-C为靶基因,以pGenSil-1质粒为载体,设计构建重组体,根据GenBank数据库提供的VEGF-C基因核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计两条带发夹结构的核苷酸序列,克隆到空载体pGenSil-1中,转化DH5α菌株,提取质粒,进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析,将重组的pGenSil-VEGF-C质粒转染LOVO细胞48小时,检测其对LOVO细胞VEGF-C蛋白与mRNA表达的影响。结果：经酶切鉴定筛选出的重组体测序结果与目的序列完全一致,重组载体显著降低Lovo细胞VEGF-C的蛋白和mRNA表达,重组载体构建成功。结论：利用RNAi技术可成功构建抑制VEGF-C表达的小干扰RNA重组体。     

CUL5基因的RNA干扰真核表达载体的构建

目的：构建CUL5基因的RNA干扰真核表达载体,探索CUL5在鼻咽癌放射治疗中加速再增殖的作用。方法：根据GenBank数据库提供的CUL5基因mRNA序列,按照Tuschl设计原则,设计选择双链小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）,再设计合成为能表达其小发卡结构RNA（small hairpin RNAs,shRNA）的DNA序列,并与pGPU6／GFP／Neo质粒定向连接,构建真核表达载体,并进行限制性内切酶酶切和DNA测序鉴定。结果：经限制性内切酶酶切和DNA测序证实质粒中插入的为所需序列,通过RT—PCR证实其能够干扰CNE2细胞的CUL5基因表达。结论：CUL5基因RNA干扰真核细胞表达载体的构建成功。     

VEGF-C基因RNA干扰真核表达载体的构建及其效果鉴定

目的:构建VEGF-C基因RNA干扰(RNAi)的真核细胞表达载体。方法:以VEGF-C为靶基因,以pGenSil-l质粒为载体,设计构建重组体,根据GenBank数据库提供的VEGF-C基因核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计两条带发夹结构的核苷酸序列,克隆到空载体pGenSil-l中,转化DH5α菌株,提取质粒,进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析,将重组的pGenSil-VEGF-C质粒转染LOVO细胞48小时,检测其对LOVO细胞VEGF-C蛋白与mRNA表达的影响。结果:经酶切鉴定筛选出的重组体测序结果与目的序列完全一致,重组载体显著降低Lovo细胞VEGF-C的蛋白和mRNA表达,重组载体构建成功。结论:利用RNAi技术可成功构建抑制VEGF-C表达的小干扰RNA重组体。     

CtBP1基因shRNA真核表达载体的构建及其干扰效果的初步鉴定

目的：构建C-末端结合蛋白-1（CtBP1）基因RNA干扰（RNAi）的真核表达载体,转染人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1（ADR＋/＋）,初步鉴定其干扰效果。方法：以人CtBP1基因为靶基因,以pGenesil-1质粒为载体,根据GenBank数据库提供的CtBP1基因核苷酸序列,选择设计两条siRNA干扰序列,将带9个碱基茎环结构的干扰序列插入带有绿色荧光蛋白（EGFP）基因、卡那霉素（Kanr）抗性基因及U6启动子的真核表达载体pGenesil-1中,构建针对CtBP1基因的shRNA真核表达载体,转化大肠杆菌DH5α菌株,提取质粒,进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析。确认载体构建成功后,用脂质体LipofectamineTM2000将重组质粒瞬时转染人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1（ADR＋/＋）,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,计数转染细胞数,计算转染效率,RT-PCR法检测载体对CtBP1基因的表达抑制效果。结果：构建针对CtBP1基因的pGenesil-1-CtBP1小发夹RNA（pGenesil-1-CtBP1-shRNA）,经限制性内切酶酶切、PCR和DNA测序证实与设计完全一致;在荧光显微镜下观察到B-MD-C1（ADR＋/＋）细胞表达绿色荧光蛋白（EGFP）,证实重组质粒己转染入细胞,转染效率达到60%-70%;RT-PCR结果显示B-MD-C1（ADR＋/＋）细胞中CtBP1基因被特异抑制,基因表达抑制率达40%以上,与转染试剂对照组、空白对照组和阴性序列对照组间的差异均具有统计学意义（P均〈0.05）。结论：成功构建CtBP1基因的shRNA表达载体,可以有效抑制B-MD-C1（ADR＋/＋）细胞上CtBP1基因表达。为进一步研究CtBP1基因功能进而逆转肿瘤的多药耐药奠定基础。     

靶向Galectin-1基因的 siRNA真核表达载体构建及鉴定

目的:构建Galectin-1特异性siRNA真核表达载体psilencircle-G1si,转染细胞株U14,下调Galectin-1的表达.方法:运用生物信息学技术候选siRNA序列,合成SECs转染U14细胞,以荧光定量PCR快速筛选有效序列;siRNA序列插入siRNA真核表达质粒psilencircle,构建psilencircle-G1si并转染U14细胞,实时荧光定量PCR、Western blot检测Galectin-1表达量.结果:psilencircle-G1si酶切、测序表明与设计一致,实时定量PCR及western blot表明psilecircle-G1si 能调低U14 细胞 Galectin-1的表达.结论:成功构建Galectin-1特异性siRNA真核表达载体psilencircle-Glsi,为进一步研究解除肿瘤细胞反杀伤T细胞的策略奠     

Nucleostemin基因荧光真核表达载体构建及表达特性

目的:构建Nucleostemin(NS)基因真核表达载体,并在COS-7细胞中表达.方法: 设计引物在肺癌细胞株(LTEP-a-2)中扩增NS全长cDNA片段,插入pMD-18T 质粒中得pMD-18T-NS载体,并测序;再将pMD-18T-NS质粒经酶切后导入真核表达载体pcDNA3.1(+)-GFP质粒中,构建pcDNA3.1(+)-GFP-NS载体,并检测其真核表达情况.结果: 经RT-PCR扩增得到1 650 bp的全长NS cDNA片段,酶切及测序后鉴定证明pMD-18T-NS构建成功.pcDNA3.1(+)-G-FP-NS载体转染COS-7细胞经蛋白印迹及激光共聚焦显微镜检测显示,该GFP-N-S融合基因在COS-7细胞中获得较好表达.转染后见该基因定位于核仁,细胞逐渐失去黏附贴壁的特性,细胞的增殖受阻;稳定表达(4～20周)后,细胞形态发生改变,体积增大,核增多,细胞成瘤细胞样改变.结论: 成功构建pcDNA3.1(+)-GF-P-NS真核表达载体,并在COS-7细胞中有效表达;NS基因在COS-7发生瘤样改变过程中发挥着重要作用,可能与肿瘤发生密切相关.     

PRKACB基因真核表达载体的构建及稳转细胞株的筛选

目的:克隆人cAMP依赖性蛋白激酶催化亚单位β基因(PRKACB),构建重组真核表达载体pEGFP-C1-PRKACB,并筛选其稳定转染肺癌细胞株.方法:应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,从真核细胞中扩增得到人PRKACB的全长序列,克隆至表达增强型绿色荧光蛋白载体中,经酶切、PCR鉴定后测序证实克隆成功.将重组载体转至真核细胞,采用RT-PCR、Western blot技术检测外源基因PRKACB的表达.应用新霉素(G418)筛选出稳定转染pEGFP-C1-PRKACB的非小细胞肺癌细胞株.结果:测序结果证实成功将PRKACB基因克隆至真核表达载体中,酶切片段与预期大小一致(1 200bp).RT-PCR及Western blot结果显示:转染后的细胞中PRKACB在转录和翻译水平的表达均有明显提高.稳定转染pEGFP-C1-PRKACB的细胞株经Western blot证实其PRKACB蛋白上调最显著.结论:成功构建了真核表达载体pEGFP-C1-PRKACB,并筛选其稳定转染后上调最显著的细胞株,为进一步研究PRKACB的生物学功能奠定了基础.     

人MUC1/Y基因真核表达载体的构建及其在COS/7细胞中的表达

MUCl/Y是1994年发现的新基因,其蛋白锚定于细胞膜.研究表明, MUCl/Y具有膜受体的特征,可能作为一种膜表面的重要分子通过ras信号传导通路参与细胞的恶性转化过程;进一步的动物实验表明,MUCl/Y的表达具有肿瘤特异性.由此推测,MUCl/Y可能是一种肿瘤主动特异性免疫治疗的理想靶分子[1],但迄今为止,MUCl/Y基因及其编码蛋白的功能尚未明确,因此,构建人MUCl/Y全长cDNA的真核表达载体,将对进一步研究该基因的功能以及以MUCl/Y为靶点的肿瘤核酸疫苗的制备,具有重要意义.     

人MAGE-3真核表达载体的构建与表达

目的 克隆人黑色素瘤特异性抗原MAGE-3基因，构建真核表达载体，建立MAGE-3阳性细胞株，制备肿瘤核酸疫苗。方法 用RT—PCR方法扩增MAGE-3cDNA，以pcDNA3．1 为载体，构建重组表达质粒pcDNA3．1／MAGE-3。重组质粒用脂质体转染鼠B16细胞，经RT—PCR、细胞免疫染色及免疫印迹法鉴定转化细胞中MAGE-3的表达。结果 正确构建了pcDNA3．1／MAGE-3重组质粒，并且在转化细胞中检测到了MAGE-3的表达。结论 成功构建了pcDNA3．1／MAGE-3真核表达质粒，建立了稳定表达人MAGE-3的鼠B16细胞株。     

Wistar大鼠重组γ-干扰素真核表达载体的构建

细胞因子是调节机体细胞免疫的重要物质。已有实验表明 ,γ 干扰素可明显提高机体抗肿瘤、抗感染的能力。随着分子生物学及分子遗传学等基础学科的发展 ,疾病的基因治疗已成为当今研究的热点。构建可供基因转染的真核细胞表达载体 ,是进行基因转染研究的基础 ,具有重要的实用价值。本文旨在构建可供调节机体细胞免疫的重组大鼠γ 干扰素真核表达载体 ,以供基因治疗研究之用。本研究首先采用ＲＴ ＰＣＲ的方法获得Ｗｉｓｔａｒ大鼠肺部γ 干扰素的目的基因 ,并进行纯化。引物序列为 :Ｆｏｒｗａｒｄ 5′ＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＣＣＡＴＧＡＧＴ…     

survivin启动子调控siRNA真核表达载体的构建及对HeLa细胞中stathmin基因的干涉作用

目的:探讨survivin基因启动子调控的siRNA真核表达载体对HeLa细胞中stathmin基因表达的肿瘤特异性封闭作用。方法:合成针对人stathmin基因的siRNA cDNA寡核苷酸链退火形成双链,连接入经BamHI和HindIII双酶切后的pSilencer4.1-CMV neo真核表达载体。PCR扩增suvivin基因启动子并测序,用EcoRI和BamHI分别双酶切,连接至经相同内切酶消化的载体,获得survivin启动子调控的siRNA真核表达载体,酶切及测序鉴定。脂质体法转染重组质粒入HeLa细胞,G418筛选。RT-PCR扩增stathmin基因,检测其对stathmin基因表达的干涉效果;流式细胞仪分析转染后HeLa细胞增殖周期的改变。结果:经酶切及测序鉴定,成功构建重组质粒;RT-PCR结果显示所构建的干涉载体可有效封闭stathmin基因表达;流式细胞仪分析结果显示,Hale细胞在stathmin siRNA作用下G2/M期细胞的比例明显增加。结论:survivin基因启动子调控的siRNA真核表达载体可有效地封闭HeLa细胞中stathmin基因表达并使HeLa细胞阻断于G2/M期,为以stathmin基因为靶点的恶性肿瘤生物治疗奠定了理论基础。