大鼠脑微血管内皮细胞的培养

目的:探索一种简便易行、可培养出高纯度大鼠脑微血管内皮细胞的方法。方法:1月龄SD大鼠,解剖得到大脑皮质,密度离心法获得较纯的脑微血管段后进行原代培养,传代采用差速消化和贴壁方法进行纯化。通过形态学观察及第Ⅷ因子相关抗原免疫荧光检测对培养细胞进行鉴定。结果:密度离心法分离出的大量微血管段呈"串珠样"结构,培养24h可见短梭形、多角形细胞,8～10天基本融合。第2代细胞经免疫荧光染色,第Ⅷ因子相关抗原呈阳性,阳性率达90%。结论:原代细胞采用低分子量葡聚糖加Percoll密度离心法、传代细胞采用差速消化和差速贴壁法纯化可成功培养高纯度的脑微血管内皮细胞。     

大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养

目的分离、培养原代脑微血管内皮细胞,建立体外血脑屏障模型。同时探索高纯度、活性好的脑微血管内皮细胞的分离培养方法。方法取3周大鼠大脑,分离皮质,经过匀浆、葡聚糖离心以及消化后,取纯度较高的脑微血管段种植于胶原蛋白包被过的塑料培养瓶中进行培养。显微镜观察及检测Ⅷ因子相关抗原。结果镜下细胞呈长梭形。7d左右细胞可融合,Ⅷ因子相关抗原免疫组化检测为阳性．且阳性细胞占绝大部分。结论本实验成功分离大鼠脑微血管内皮细胞,并进行原代培养,为脑微血管内皮细胞的进一步研究提供了模型．也为构建更高级的大鼠体外血脑屏障奠定基础。     

辛伐他汀对不同氧供条件下大鼠脑微血管内皮细胞跨内皮电阻及MMP-9表达的影响

目的:观察在常氧、短暂缺氧、持续缺氧及复氧条件下,辛伐他汀对大鼠脑微血管内皮细胞(BMECs)跨内皮细胞电阻(TEER)及基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达的影响。方法:原代分离培养SD大鼠BMECs,随机分为常氧组、短暂缺氧组、持续缺氧组、复氧组,各组均实施辛伐他汀0.1μmol/L、1.0μmol/L、10μmol/L3种浓度预处理。观察各组细胞形态学及增殖活性变化;采用TEER评估各组通透性;免疫细胞荧光化学法测定MMP-9蛋白表达。结果:短暂缺氧、持续缺氧及复氧条件下大鼠BMECs细胞受损逐渐加重,MMP-9表达逐渐增加,TEER及细胞增殖活性逐渐下降。辛伐他汀干预能不同程度提高TEER并抑制MMP-9蛋白的表达,使细胞增殖活性提高。但这种抑制MMP-9的作用对短暂缺氧大鼠BMECs的TEER值及细胞增殖活性无显著改善。结论:辛伐他汀能通过抑制MMP-9蛋白的表达来提高持续缺氧及复氧条件下大鼠BMECs的TEER,而对短暂缺氧后TEER的改善作用不明显。     

Toll样受体4对高糖诱导胰岛微血管内皮细胞株凋亡蛋白表达的影响

目的:观察小鼠胰岛微血管内皮细胞(MS1)Toll样受体4(TLR4)的表达及其对高糖诱导凋亡蛋白表达的影响。方法:离体小鼠MS1分为低浓度葡萄糖(5.6mM)对照组(C组)、高浓度葡萄糖(25.0mM和35.0mM)诱导组(HG组)、TLR4抑制剂干预组(35.0mM葡萄糖+1μM CLI-095,HG+CLI组)及TLR4抑制剂对照组(5.6mM葡萄糖+1μM CLI-095,CLI组)。平行培养24h或48h后,先用CCK-8法检测C组和HG组MS1细胞活力,选定高糖干预浓度(35.0mM)及时间(48h);再分别应用免疫组化和Western Blotting检测各组MS1细胞TLR4表达水平;应用Western Blotting检测各组MS1细胞凋亡蛋白Caspase-9、Caspase-3表达水平;应用明胶酶谱分析法检测基质金属蛋白酶2(MMP2)活性变化。结果:与C组比较,HG组MS1的TLR4蛋白表达显著增加(P0.01);凋亡蛋白Caspase-9和Caspase-3表达均显著升高(P0.01,P0.05);MMP2活性明显增强(P0.05);与HG组比较,HG+CLI组Caspase-9水平均明显降低(P0.01),Caspase-3水平仅有降低趋势,差异无统计学意义(P0.05);TLR4的表达和MMP2活性虽有下降,但差异亦无统计学意义(P0.05)。结论:MS1高表达TLR4可能参与高糖诱导的MS1细胞凋亡。     

大鼠脑皮质微血管内皮细胞的分离和培养

目的： 本研究旨在探索1种有效分离、培养和获取较高纯度大鼠脑微血管内皮细胞（BMECs）的方法。方法: 自12 d SD大鼠脑分离出皮质，采用二次酶消化、BSA和Percoll非连续梯度离心获得较纯的脑微血管段后，接种于涂布有明胶的培养皿进行原代培养；相差显微镜观察细胞的形态学特性，进行血管内皮细胞特异性标志物Ⅷ因子相关抗原免疫组化检测。结果: 培养24 h即可见细胞从贴壁的脑微血管段周围爬出，细胞呈短梭形，集落呈典型的“鹅卵石样”，区域性单层生长，6-7 d内皮细胞开始融合，血管内皮细胞特异性标志物Ⅷ因子相关抗原表达阳性，纯度达92.6%。结论: 成功地自大鼠脑皮质分离并培养出纯度较高的BMECs，为进一步开展脑微血管内皮细胞的生物学特性的相关研究提供有用的方法。     

脑血康片对急性脑出血大鼠PAR-1表达及动态演变的影响(英)

目的：探讨脑出血后蛋白酶激活的受体-1（PAR-1）的动态表达及脑血康片(NXKT)的干预作用。 方法： 将72只Wistar大鼠随机分为正常组、脑出血模型6 h、24 h、3 d、7 d组和脑血康片6 h、24 h、3 d、7 d组。用Ⅶ-S型胶原酶诱导大鼠脑出血模型。免疫组化方法测定各时间点大鼠脑出血后血肿周围水肿组织PAR-1蛋白的表达；RT-PCR检测PAR-1 mRNA的表达。 结果： 正常组大鼠大脑PAR-1蛋白和PAR-1 mRNA表达轻度阳性, 模型组6 h时PAR-1表达强度开始增强，24 h PAR-1表达进一步增加，于3 d达到高峰，然后开始下降，7 d时明显下降。在6 h、24 h、3 d及7 d各时点，模型组、NXKT组PAR-1 mRNA吸光度比值及PAR-1阳性细胞数升高与正常组比较均有显著差异(P<0.05或P<0.01)，NXKT组PAR-1阳性细胞数、PAR-1 mRNA吸光度比值降低与模型组比较各时点均有显著差异(P＜0.05或P＜0.01)。 结论： 脑出血后PAR-1受到凝血酶的持续活化，脑出血后凝血酶的作用可能是通过PAR-1介导的; NXKT可抑制PAR-1活化，从而使行为学得到改善,这可能是NXKT促进神经功能修复的主要机制之一。     

压力、剪应力和川芎嗪对大鼠脑微血管内皮细胞血管生成的影响

为探讨剪应力、压力和川芎嗪对血管生成的影响,采用体外培养的大鼠脑微血管内皮细胞(rCMEC),用自制的可独自调节压力和剪应力的平板剪切装置预处理,再进行Matrigel体外三维培养.结果表明,在两个组合条件(分别为20dyn/cm2剪应力、0 mmHg压力、63μg/ml川芎嗪与10dyn/cm2剪应力、40mmHg压力、126μg/ml川芎嗪)与对照之间,内皮细胞血管生成有显著差异(P＜0.01),不同实验条件下不同时间血管生成亦有显著差异(P＜0.01).结果提示,适当水平的剪应力、压力和川芎嗪联合作用可能明显改变内皮细胞的血管生成.     

黄酒对同型半胱氨酸诱导的大鼠血管内皮细胞基质金属蛋白酶2表达的影响

 ［摘要］目的:观察黄酒和红葡萄酒是否能抑制同型半胱氨酸(Hcy)诱导的大鼠血管内皮细胞(VECs)中基质金属蛋白酶2(MMP-2)的表达。方法:大鼠原代主动脉VECs经分离培养及纯化鉴定后,取第3~4代细胞用于实验。将Hcy(0、50、100、500、1 000 μmol/L)与VECs共同孵育48 h及100 μmol/L Hcy与VECs共同培养24、48、72 h,分别用免疫印迹和明胶酶谱法检测Hcy 对MMP-2蛋白表达和活性的影响,确定Hcy最佳干预的浓度和时间。每种酒（1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%、2.0%）与100 μmol/L Hcy共同孵育VECs 48 h, MTT法检测酒类对细胞活性的影响,确定最佳干预浓度后处理分control组、Hcy组、Hcy+黄酒组、Hcy+红酒组和Hcy+酒精组5组。培养48 h后收集样品,免疫印迹法检测VECs中MMP-2的表达量,明胶酶谱法测定VECs上清液中MMP-2的活性。结果:Hcy在50~500 μmol/L呈浓度依赖性地促进MMP-2蛋白表达和活性的增强（P<0.05或P<0.01）,Hcy在100 μmol/L时干预24、48、72 h MMP-2蛋白表达和活性的增强呈时间依赖性,48 h时最明显（P<0.01）。与Hcy组相比,黄酒组和红酒组VECs MMP-2蛋白表达及上清液中MMP-2活性显著下降（P<0.05）,酒精组MMP-2蛋白表达及上清液中MMP-2活性下降,但差异均无统计学意义（P>0.05）。与酒精组相比,黄酒组和红酒组VECs MMP-2表达及上清液中MMP-2活性的差异有统计学意义（P<0.05）,黄酒组和红酒组之间无显著差异（P>0.05）。结论: Hcy能增强血管内皮细胞MMP-2蛋白表达及酶的活性,小剂量的黄酒和红葡萄酒均能抑制Hcy 诱导的MMP-2表达及活化。     

压力、剪应力和川芎嗪对大鼠脑微血管内皮细胞凋亡和细胞周期的影响

为探讨剪应力、压力和川芎嗪对血管内皮细胞的细胞周期和凋亡的影响,以自制的可独自调节压力和剪应力的平板剪切装置提供剪应力和压力,与川芎嗪三者共同作用于大鼠脑微血管内皮细胞(rCMEC),采用流式细胞术检测剪应力、压力和川芎嗪对rCMEC细胞周期和凋亡的影响.结果表明,在两个组合条件(分别为20 dyn/cm2剪应力、0 mmHg压力、63μg/ml川芎嗪与10 dyn/cm2剪应力、40 mmHg压力、126μg/ml川芎嗪)下,内皮细胞的细胞周期与对照组无显著差异(P＞0.05),而凋亡率则明显低于对照组(P＜0.01).结果提示,适当水平的剪应力、压力和川芎嗪联合作用可能明显抑制rCMEC凋亡.     

缬沙坦对大鼠肾间质纤维化的影响

肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis,RIF)是各种原因引起的肾脏疾病进展至终未期肾功能衰竭的共同病理特征.     

高压氧对沙鼠脑缺血时微血管内皮细胞形态及其粘附性的影响

以沙鼠为对象探讨急性脑缺血动物经不同氧压暴露对脑膜微血管内皮细胞形态变化与粘附性的影响。结果显示,脑缺血动物经高压氧治疗后,脑膜微血管内皮细胞轮廓清楚,与白细胞、红细胞、血小板的粘附程度明显减轻。表明高压氧可能具有抑制血细胞与血管内皮细胞粘附作用。实验还观察到,动物在300kPa氧压暴露时脑膜微血管出现节段性痉挛,400kPa氧压下,痉挛程度加重,并可见有内皮细胞裂隙增宽,血管内容物外溢,而在250kPa氧压暴露时则未见此现象。提示在大于300kPa氧压暴露时微血管的这种反应,可能是饥体氧中毒在微循环环节上的征象。     

大鼠肺微血管内皮细胞的培养

目的建立简单有效地获取大鼠肺微血管内皮细胞(PMVEC)的培养方法。方法从实验动物、培养基、植块方法、胎牛血清浓度等方面对植块培养法进行改进,应用W istar雄性大鼠的肺组织,进行PMVEC的原代培养并传代培养;通过倒置显微镜、扫描、透射电镜观察其形态,并进行免疫组织化学鉴定。结果体外培养的大鼠PMVEC呈梭形或多角形,形成单层后呈典型的鹅卵石样或铺路石样排列,获得的血管内皮细胞纯度较高,抗Ⅷ因子阳性反应,成功建立了PMVEC的原代培养方法。结论改进的植块培养法简便、可靠,获得的PMVEC纯度高,生长状态良好,保持了内皮细胞的结构和功能,可用于其功能特性的进一步研究。     

微血栓大鼠循环内皮细胞,血浆内皮素和一氧化氮测定的结果分析

目的：对微血栓动物模型行普通肝素和低分子量肝素的治疗，通过内皮细胞计数（CEC）、内皮素（ET）、一氧化氮（NO）三项指标观察分析其血管内皮细胞损害及肝素的治疗效果。方法：对18只wistar大鼠行尾静脉注射高分子右旋糖苷（高右），制成微血栓动物模型。其中12只在高右基础上分别予普通肝素（普肝组，n＝6）和低分子量肝素（低肝组，n＝6）治疗。其余6只不治疗。另以5只wistar大鼠行尾静脉注射生理盐水为正常对照组（对照组，n＝5）。对上述各组作循环内皮细胞计数（CEC）、血浆内皮素（ET）及一氧化氮（NO）测定。结果：高右组CEC、ET高于对照组和治疗组（P＜0．05），NO则低于对照组和治疗组（P＜0．05）。治疗组的上述结果均有明显恢复至对照组的趋势。结论：微血栓大鼠有血管内皮损伤，普通肝素及低分子量肝素不仅能抗微血栓形成，且可促进血管内皮细胞功能恢复，其中以低分子量肝素为优。     

罗格列酮对改善糖尿病大鼠心肌微血管内皮细胞功能的影响

目的探讨罗格列酮对糖尿病大鼠心肌微血管内皮细胞功能的影响。方法腹腔注射小剂量链脲佐菌素结合高能量饲料制备2型糖尿病大鼠模型，随机分为未治疗组与治疗组：罗格列酮4mg／（kg·d）。16周后定量测定血管内皮损伤标志物：可溶性血管内皮细胞蛋白C受体（sEPCR）、可溶性血栓调节蛋白（sTM）、血管性血友病因子（VWF）和一氧化氮（NO）的血浆浓度。分光光度法及免疫组化法分别测定心肌组织内NO浓度、NO合酶（NOS）的活性及内皮型NO合酶（cNOS）在微血管内皮细胞的表达。结果罗格列酮治疗组血糖及血浆中sEPCR、sTM、vWF显著低于未治疗组，但高于非糖尿病对照组。与未治疗组比较，罗格列酮治疗组心肌组织中NO、结构型NOS（cNOS）含量增高，eNOS阳性反应产物量增多，而诱导型NOS（iNOS）含量降低。结论罗格列酮可以降低糖尿病大鼠血糖，减轻内皮细胞损伤与改善心肌微血管内皮细胞功能，有助于减少糖尿病时心肌微血管病的发生与发展。     

卡巴胆碱抑制肿瘤坏死因子所致微血管内皮细胞通透性增高

目的探讨卡巴胆碱对肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）诱导的增加微血管通透性的作用。方法采用FITC标记白蛋白漏出法、考马斯亮蓝染色法观察卡巴胆碱对TNF-α诱导微血管内皮细胞通透性，细胞形态和细胞骨架变化的影响。结果与对照组比较，TNF-α明显增加微血管内皮细胞通透性（P〈0．05），诱导细胞皱缩，细胞间隙增大和细胞骨架排列紊乱。给予卡巴胆碱可以明显抑制TNF-α诱导微血管内皮细胞通透性增加，并呈剂量依赖性，同时可以使细胞间隙明显减小，细胞骨架排列有序。结论卡巴胆碱可能通过抑制TNF-α对细胞骨架的损伤，进而抑制微血管通透性增加。     

血红素氧合酶-1影响脓毒症大鼠内皮细胞蛋白C受体表达发挥肾脏保护作用

目的研究血红素氧化酶-1 (heme oxygenase-1,HO-1)对脓毒症大鼠肾脏的保护作用机制,观察肾脏内皮细胞蛋白C受体(endothelial cell protein C receptor,EPCR)表达的变化以及血红素氧合酶-1对其影响。方法盲肠结扎-穿孔(cecal ligation and perforation,CLP)法制作脓毒症大鼠模型,72只脓毒症大鼠随机分为对照组、CLP组、HO-1促进剂(CLP+hemin)组、HO-1抑制剂(CLP+ZnPP)组,每组18只,后3组大鼠分别于腹腔内注射磷酸盐缓冲液、hemin和ZnPP,12 h后在大鼠腹白线做正中切口约1.5cm,分离盲肠,在盲肠的近端和末端各穿一个孔,挤出少许粪便于腹腔内,回纳盲肠,分层缝合腹腔,造成腹腔感染脓毒症模型。分时相处死大鼠,留取血浆、肾脏组织,分析各组之间肌酐(Cr)、胱抑素C(Cys-C)、血浆凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)的差别,ELISA法检测血浆EPCR、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)水平变化,肾脏组织经马休黄/猩红/天青石蓝染色法(MSB)对比各组之间病理变化,并应用Western Blot分析肾脏组织EPCR表达水平。结果与对照组相比在脓毒症组中大鼠肾脏微血栓形成明显,凝血功能障碍,炎症反应明显,肾脏功能受损;在HO-1促进剂组中大鼠肾脏微血栓及炎症反应较脓毒症组显著减轻(P<0. 05),肾脏功能得到改善,EPCR表达较脓毒症组上调,差异具有统计学意义(P<0.05);而HO-1抑制剂起到了相反的作用。结论血红素氧合酶-1能够增加脓毒症大鼠肾脏内皮细胞蛋白C受体的表达,发挥抗凝血及抗炎作用,从而改善脓毒症大鼠的肾脏功能。     

大鼠主动脉拉伤模型血管壁凝血酶活性的观察

目的 :观察大鼠主动脉拉伤模型血管壁凝血酶活性的变化。方法 :2FFogarty导管拉伤大鼠胸主动脉 ,术后不同时期取血管在体外与纤维蛋白原反应 ,以FPA的生成量代表血管组织的凝血酶活性。结果 :拉伤的大鼠胸主动脉术后 2 4h～ 4 8h凝血酶活性明显增高 ,72h后明显下降 ,但于 72h～ 7天仍维持于较高水平。结论 :内皮拉伤的大鼠主动脉模型动脉壁凝血酶活性明显增加 ,血管壁FPA生成可代表凝血酶活性 ,对再狭窄的研究有一定意义     

大鼠脑缺血-再灌注损伤对脑微血管通透性的影响

目的 :探讨大鼠脑缺血 -再灌注后脑组织微血管通透性的变化规律 ,为进一步探讨脑缺血及再灌注损伤机制提供参考数据。方法 :应用荧光素钠 (分子量 3 86 ,Fl Na)和 FITC标记的右旋糖苷( FD4,分子量 40 0 0 )为荧光示踪剂 ,以单侧颈总动脉远心端及同侧颈静脉插管并连接二管造成颈总动脉向颈静脉的引流 ,同时用动脉夹夹闭对侧颈总动脉造成脑缺血模型。缺血 1h后松开动脉夹并中断引流造成再灌注模型。测量脑组织荧光强度反映脑微血管通透性的变化。结果 :单纯的脑缺血即可引起脑组织微血管通透性的增强 ,再灌注后对小分子量物质的通透性随再灌注时间的延长有增加的趋势 ,而对较大分子量物质的通透性基本维持在同一水平。结论 :即使是在再灌注损伤最严重时 ,脑微血管对较大分子量的物质通透仍不明显 ,说明血 -脑屏障的存在可以有效地防止有害物质通过微血管壁侵入脑组织 ,但一旦进入脑组织 ,将滞留于脑组织中不易清除。     

内皮祖细胞移植对肺动脉高压大鼠一氧化氮、内皮素的影响

目的研究同种异体内皮祖细胞（EPCs）移植对野百合碱（monocrotaline,MCT）所致肺动脉高压（Pulmonary Artery Hypertensinn,PAH）大鼠的影响,并观察肺动脉血一氧化氮（NO）、内皮素（ET）的变化,探讨其治疗PAH的机制。方法体外培养并鉴定大鼠EPCs,MCT诱发肺动脉高压模型组由尾静脉注入标记的EPCs。在移植EPCs后第21天,测定肺血流动力学参数,计算平均肺动脉压（mPAP）,分别用硝酸还原酶法,放射免疫法测定NO及ET-1值。结果与模型组（29．33±3．01）mm—Hg相比,EPCs治疗组（21．89±2．69）mmHg平均肺动脉压明显下降,肺动脉血的NO值明显增加,（49．28±5．31 vs 21．64±3．06）μmol／L（P〈0．05）,ET-1值由（354．40±36．35）pg／ml降至（259．20±29．08）pg／ml（P〈0．05）。结论同种异体EPCs移植可有效降低肺动脉压力,作用机制可能与其分化为血管内皮细胞,修复损伤的肺血管内皮,调节NO与ET-1的含量有关。