小鼠体内生精系统重塑模型的建立

目的建立小鼠体内生精系统重塑模型,为在体研究生精相关基因的功能提供技术方法。方法以白消安(busulfan)40mg/kg腹腔注射后3～5周雄性小鼠为受体小鼠,以稳定表达GFP的精原细胞系GC-1spg为供体细胞,移植入受体小鼠睾丸曲细精管中,观察供体细胞移植后在受体小鼠曲细精管中的定位、增殖和分化情况。结果成功建立小鼠睾丸曲细精管显微注射技术平台,并发现精原细胞系GC-1spg移植回体内环境后,不但能够在受体小鼠曲细精管生存,而且能够定位于相当于精原干细胞所处的niche中增殖、分化,并产生成熟精子。结论我们应用精原细胞系GC-1spg成功地建立了小鼠体内生精系统重塑模型。     

精原干细胞移植受体鼠模型的建立

目的通过对4周龄昆明白小鼠腹腔内单次注射白消安来制作精原干细胞移植受体鼠模型。方法将实验动物分为4组,A、B、C组注射白消安的剂量分别是30 mg/kg4、0 mg/kg5、0 mg/kg体重,D组为对照组。注射后每天记录小鼠的存活情况,注射白消安后的20 d3、0 d4、0 d称量睾丸重量、测定血常规、制作并观察睾丸组织学切片、统计曲细精管的中空率。结果A、B、C、D组的死亡率分别是25.00%3、1.58%、80.00%、0.00%,注射白消安后30 d各组小鼠曲细精管中空率分别是45.25%、75.25%、1.50%、0.00%,白细胞、红细胞、血小板数量等血常规指标均恢复正常。结论腹腔内单次注射30 mg/kg或40 mg/kg剂量的白消安,死亡率较低(25.00%、31.58%),30 d后曲细精管中空率较高(45.25%7、5.25%)、血常规指标恢复正常,适合做精原干细胞移植受体。     

化疗药物建立小鼠无精子症模型的实验研究

目的制作小鼠无精子症模型,观察其对支持细胞的影响,为进一步的精原干细胞移植提供受体。方法将4~5周龄ICR小鼠分为4组:环磷酰胺组注射环磷酰胺(200 mg/kg)、白消安组注射白消安(40 mg/kg)、复合组注射环磷酰胺(120 mg/kg)和白消安(20 mg/kg)以及对照组注射0.9%生理盐水。注射后第35天、45天和60天取双侧附睾制作精子悬液,涂片后固定计数,制作并观察睾丸组织学切片(HE)。结果与对照组比较,各给药精子数量显著减少(P<0.05);HE染色:各给药组生精小管内细胞排列疏松,细胞层数减少,各生精小管间隙扩大,间质细胞减少,其中白消安组与复合组于给药后第35天、45天睾丸生精小管内精子及精子细胞消失,第60天时部分生精小管内可偶见精子细胞及精子。结论利用化疗药物采用腹腔内单次注射可以建立小鼠无精子症模型,且操作简捷、周期短、费用低、效果好,可以做精原干细胞移植受体。     

环磷酰胺和白消安构建Wistar大鼠非梗阻性无精子症模型的比较

目的 探讨环磷酰胺和白消安制作Wistar大鼠非梗阻性无精子症模型的方法.方法 160只SPF级成年雄性Wistar大鼠随机分为10组,每组16只,第A-C组分别予以白消安20 mg/kg,15 mg/kg,10 mg/kg单次腹腔注射,第D-F组分别予以环磷酰胺200 mg/kg,100 mg/kg,75 mg/kg单次腹腔注射,第G-I组分别以白消安40mg/kg,20 mg/kg,环磷酰胺200 mg/kg单次灌胃给药,第J组予以生理盐水2.0 mL行单次腹腔注射.用药至大鼠的一个生殖周期后睾丸、附睾组织切片找不到精子和精子细胞即为无精症模型成功.结合用药方式、模型成功率等得出实用的成模方式.结果 用药后38d,存活大鼠睾丸及附睾组织切片结果提示第A,B,G,H组达到无精症模型的标准,即睾丸、附睾组织切片找不到精子和精子细胞,其大鼠存活率分别为18.75％、50.00％、6.25％、12.5％,其余各组大鼠无精症模型效果欠佳.各组成模方式的比较,白消安15 mg/kg单次腹腔注射其造模成功率较高且死亡率较低,是实用的Wistar大鼠无精子症模型制作方式.结论 白消安15 mg/kg单次腹腔注射可获得Wistar大鼠非梗阻性无精子症模型,模型成功率为50％.     

睾丸高表达蛋白质HSD-14对小鼠精子发生的影响

目的 研究睾丸高表达基因HSD-14及其编码蛋白质对小鼠精子发生的影响.方法 利用本实验室构建的人睾丸特异ESTs文库,通过电子克隆方法获得一新基因命名为HSD-14基因.纯化原核表达的HSD-14蛋白,并制备兔多克隆抗体.通过HE染色观察腹腔注射HSD-14纯化蛋白或睾丸曲细精管显微注射HSD-14纯化抗体后小鼠睾丸组织的生精变化,并进行TUNEL凋亡检测.结果 电子克隆获得HSD-14基因,在原核表达系统中表达成功.小鼠腹腔注射HSD-14纯化蛋白或睾丸曲细精管显微注射HSD-14纯化抗体后,均发现曲细精管中生精细胞大量脱落,生精细胞的层次紊乱,管腔内有时可见成团脱落的生精细胞,附睾中几乎观察不到成熟精子.TUNEL凋亡检测结果表明,抗体注射组小鼠曲细精管中生精细胞(以精母细胞为主)凋亡程度较正常小鼠睾丸和免疫前血清注射组明显,且多数细胞停留在精母细胞甚至精原细胞的阶段.结论 HSD-14通过诱导精母细胞凋亡抑制小鼠精子发生.     

生精冲剂对环磷酰胺致生精障碍小鼠的治疗作用

目的:观察生精冲剂对环磷酰胺致生精障碍小鼠的治疗作用.方法:随机将30只昆明小鼠等分成3组:正常组、模型组、中药组.用腹腔注射环磷酰胺法建立生精障碍模型.造模完成后,中药组灌胃中药生精冲剂16 g/(kg·d),模型组和正常组经口灌胃等量生理盐水,连续15 d.测量各组小鼠睾丸质量,放射免疫法测定小鼠血清卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、睾酮(T)的水平,对睾丸组织进行组织形态学观察,比较各组小鼠精子计数.结果:与正常组比较,中药组小鼠血清FSH、LH、T水平、睾丸质量、精子计数差异均无统计学意义(P均>0.05);与模型组比较,差异均有统计学意义(P均<0.05).组织学观察中药组小鼠睾丸曲细精管生精细胞层数及管腔内精子数高于模型组.结论:生精冲剂可有效治疗生精障碍.     

雄激素受体敲除小鼠睾丸生精功能变化及p63的表达

目的 研究雄激素受体（AR）敲除小鼠睾丸生精功能及p63在曲细精管中表达的改变.方法 采用雄性Flox-AR小鼠与雌性ACTB-Cre小鼠交配,并敲除胚胎中AR,筛选AR敲除（AR敲除组）和AR未敲除（对照组）雄性小鼠各10只,对比睾丸曲细精管生精功能及p63的表达.结果 两组小鼠曲细精管内径、管周膜厚度、管壁生殖细胞层数、生殖细胞成熟度评分及总Makler评分之间差异均有统计学意义（P＜0.05）,p63的阳性表达主要位于精原细胞及精母细胞,精子细胞及成熟精子中表达呈阴性,且AR敲除组表达阳性率及HSCRE评分均显著低于对照组（P＜0.01）.结论 AR表达与小鼠睾丸曲细精管p63表达关系密切,AR敲除小鼠睾丸曲细精管生精功能受损、p63表达下调,p63调控生殖细胞的早期分化.     

抗氧化剂与钙离子拮抗剂合用防治大鼠免疫性睾丸炎的实验研究

目的研究抗氧化剂与钙离子拮抗剂联合应用对大鼠免疫性睾丸炎的防治作用及其作用机制.方法Wistar大鼠随机分为正常对照组、预防免疫性睾丸炎症组(预防组)和免疫性睾丸炎症模型组(模型组),从第一次免疫的次日起,预防组每天给予90 mg/kg维生素E、C合剂(Vit C Vit E=21)和50 mg/kg维拉帕米灌胃,共80d,模型组未给予干预措施,正常对照组未加任何处理.检测3组的精子计数、精子畸形率、皋丸重量、曲细精管直径,光镜观察皋丸间质及曲细精管生精细胞的变化.结果预防组与正常对照组的精子计数、精子畸形率、皋丸重量和曲细精管直径差异均无统计学意义(P＞0.05),镜下表现接近于正常对照组.模型组与正常对照组相比,精子计数、睾丸重量和曲细精管内径均有明显减少(P＜0.05～0.01),精子畸形率明显增加(P＜0.01).光镜下睾丸间质明显充血,生精细胞脱落,生精上皮空泡变,多核巨精细胞形成,不同程度的炎性细胞浸润.结论维生素E、维生素C、维拉帕米联合应用可明显减轻大鼠免疫性炎症损伤.     

磁水对小鼠睾丸生精功能的影响

目的研究磁水对小鼠睾丸生精功能的影响.方法用磁水饲养小鼠,经2和6个月后,对小鼠附睾尾中精子数、睾丸曲细精管直径及曲细精管内生精细胞数等项指标进行观测.结果实验组各项数据均比对照组显著减少,含实验2和6个月时,睾丸减重14.2%、9.6%和附睾尾精子数减少12.6%、9.5%;曲细精管及附睾管内精子数也明显减少(P<0.05).结论磁水未能促进小鼠睾丸的生精功能.     

小鼠生精周期表皮生长因子受体在睾丸曲细精管的分布

目的 观察生精周期不同阶段中表皮生长因子受体（ＥＧＦＲ）在小鼠曲有管的分布规律，在进一步理解ＥＧＦＲ在生精过程中的意义。方法 通过糖原及多糖显色反应克腚曲细精管的生精周期，采用逻霉菌抗生物素蛋白－过氧化酶免疫组化技术观察ＥＧＦＲ在相应曲细精管上皮的分布。结果 曲细精管部分支持细胞和中细胞呈ＥＧＦＲ阳性反应。Ⅶ～Ⅸ早期部分精原细胞、细线期精母细胞的细胞核呈ＥＧＦＲ阳性反应。Ⅹ～Ⅺ期胸 粗线期精母细胞     

Rad18打靶小鼠模型遗传稳定性分析

  目的探讨RAD18在维持遗传稳定性中的作用。方法对Rad18-/-小鼠模型进行生育力检测。观察不同月龄Rad18-/-雄小鼠睾丸质量、结构以及精子发生和形态的变化。结果Rad18-/-小鼠具有生育能力,但随着年龄增加睾丸质量和生育力下降。组织学检测显示Rad18-/-小鼠睾丸的生精小管有正常的精子发生,睾丸特异性tH2B分布正常。但在12月龄时,25%的生精小管中仅残留已分化的生殖细胞,缺失精原细胞,并且附睾中的精子形态无异常。结论含有精原干细胞的精原细胞耗尽导致了Rad18-/-小鼠随年龄增加而生育力下降。     

用曲细精管微注射法建立绿色荧光蛋白转基因小鼠

目的 研究曲线精管微注射法建立转基因小鼠的可行性。方法 选取人巨细胞病毒启动子调控的增强型绿色荧光蛋白（pCMV－EGFP）表达载体，应用体视解剖镜和显微注射仪将不同剂量的被脂质体包裹的质料DNA注射到不同年龄的KM小鼠曲细精管内。在注射后40d左右，雄鼠与雌鼠合笼交配；分娩后3周，剪取仔鼠尾，提取基因组DNA，应用PCR、Southern blotting技术进行整合检测。处死2只首建小鼠，荧光显微镜观察组织冰冻切片中EGFP的表达。结果 共注射41只雄性小鼠，存活34只，其中32只具有交配、受精能力，获得仔鼠382只。仔鼠经检测，PCR阳性133只，织冰冻切片中EGFP明显表达。结论 曲细精管微注射法是动物基因转移的一条简便可行的新途径。     

Histology and Immunohistochemistry Study on Mianbu Fang Healing Immunological Infertility of Male Mice

Objective To observe the histological and immunohistochemical changes caused by of Traditional Chinese Medicine--Mianbu Fang (Immunological Infertility Healing Mixture) in testis and epididymus of male mice with immunological infertility induced by antisperm antibody (AsAb ). Materials & Methods Models of mice with immunological infertility were used by in jection of mice sperm. These mice were treated with Mianbu Ⅰ , Mianbu Ⅱ or Pred nisone Acetates. The characteristics on histology and immunohistochemistry of mice were analyzed. Results High level of AsAb was detected in serum and seminal vesicle plasma of model mice after treatment. Immune compounds mostly deposited in limiting membrane of seminiferous tubules, spermatogonium and epithelia of epididymis ducts. The num ber of spermatogenic cells per convoluted seminiferous tubule decreased. However, the Chinese medicine could significantly reduce the level of As Ab, or even eliminate the an tibodies and clear out the immune compounds and increase the number of spermatogenic cells of seminiferous tubules. Conclusion Chinese Medicine Mianbu Ⅰ and Ⅱ can regulate, absorb and clear out cir culation and partial AsAb, as well as immunological compound. Hence, they can in crease the number of spermatogenic cells of seminiferous tubules and increase the preg nancy of mice.     

Rad18缺失对雄小鼠生殖细胞的影响

[目的]了解Rad18敲除雄小鼠生殖细胞的变化。[方法]用免疫组织化学方法检测2、6、12月龄Rad18-/-雄小鼠生精小管生殖细胞的特异性标记物TRA98的表达及分布,并与野生(WT)雄小鼠比较;用原位杂交技术检测Rad18在1周龄WT雄小鼠生精小管未分化精原细胞中的表达。[结果]缺失TRA98标记的早期精原细胞的生精小管比例在12月龄Rad18-/-和WT雄小鼠中分别为39.50%和2.76%,差异有显著性意义(P<0.05);但Rad18-/-退化生精小管中保留正常的Sertoli细胞,其附睾中未见TRA98阳性的生殖细胞,且精子形态正常;1周龄WT小鼠睾丸未分化精原细胞中有Rad18蛋白表达。[结论]Rad18可能对精原干细胞有维持作用。     

成人睾丸组织在裸鼠体内的存活情况研究

目的以成人睾丸组织为供体,免疫缺陷小鼠为受体,研究成人睾丸组织中生精细胞异种移植后的存活及变化情况。方法将成人正常睾丸组织植入去势裸鼠背部,于移植后110d取出移植物,进行组织形态学观察。结果在一例移植前显示非正常生精上皮结构标本的移植物中,大多数生精小管中只含有Sertoli细胞,而另一例移植前显示出正常生精上皮结构的标本,在移植到裸鼠背部110d后,仍然观察到圆形和长形精子细胞存在。结论将成人睾丸组织移植到免疫缺陷小鼠体内,110d后仍观察到有生精细胞的存活。     

小白鼠生精上皮周期的形成

在小白鼠生后第1天到第56天,根据细胞核及精细胞顶体的形态变化,分别观察睾丸生精上皮周期的形成。结果表明,小白鼠在生后第1天睾丸的生精上皮由原始生殖细胞和支持细胞组成。生后7天出现精原细胞。生后14天出现分裂前期的初级精母细胞。生后21天出现发育早期的精细胞。生后35天少数曲细精管内出现了成熟精子,生精上皮周期已经形成,并与成鼠一样,生精上皮周期由12种时相组成。     

应用PAP免疫组化染色法观察输精管结扎16～28月家兔的睾丸组织学变化

日本大耳白雄兔16只,行双侧输精管结扎手术。术后16、22、28个月处死动物,睾丸切片HE染色尤镜观察,大部分曲细精管恢复正常的成精过程,各级精细胞形态无明显异常,并可见呈灶状分布的姜缩曲细精管,被结缔组织包绕,有淋巴细胞和浆细胞浸润。PAP染色显示,恢复正常生精过程的曲细精管均阴性染色,萎缩的曲细精管与基底膜呈阳性染色。提示输精管结扎术后曲细精管萎缩与免疫损伤有关。     

小鼠生后睾丸发育的形态学与组织化学研究

对小鼠生后的发育进行了研究。形态学研究证明其发育可分为３个阶段：第１阶段为静止期（生后第１周），曲细精管为单层细胞构成的实心团。第２阶段为增殖、分化期（生后第２～４周），曲细精管上皮由单层变为复层，管壁由精原细胞、精母细胞、精子细胞及少量精子构成，附睾内出现少量精子。第３阶段为性成熟期（生后第５周之后），此期曲细精管内和附睾内都含有大量精子。组织化学研究发现第１周碱性磷酸酶（ＡＬＰ）与氨基肽酶（ＡＰ），定位于曲细精管上皮细胞呈中等阳性；第２周上皮细胞内阳性减弱；第３周后上皮细胞内为阴性，而小管周围出现一层强阳性反应结构。通过本研究证明精子形成与性成熟是两个概念，并发现ＡＬＰ及ＡＰ与睾丸的发育有密切关系。     

Rictor/mTORC2调节小鼠睾丸血睾屏障与精子发生

目的 研究Rictor/mTORC2在睾丸血睾屏障形成、睾丸发育和精子发生中的作用及相关机制.方法 采用Cre-loxP重组酶系统,构建睾丸支持细胞中rictor基因敲除小鼠.比较敲除鼠和对照鼠的生殖器官外观和质量.HE染色观察睾丸和附睾的组织形态.采用流式细胞技术检测生精小管的细胞周期.采用免疫荧光技术检测增殖蛋白(Ki-67)和分离酶蛋白的表达.采用免疫组化和Western blot技术检测血睾屏障相关蛋白表达.结果 相比对照鼠,敲除鼠的睾丸和附睾体积和重量都明显变小(P<0.01);敲除鼠的生精细胞中二倍体细胞显著上升(P<0.01),单倍体细胞显著下降(P<0.01),而四倍体细胞、Ki-67和分离酶蛋白无显著差异;血睾屏障相关蛋白出现严重的位置错乱,而蛋白表达量不受影响.结论 睾丸支持细胞中rictor基因的正常表达,在血睾屏障结构完整性维持和功能发挥以及精子正常发生中起着至关重要作用.