5-氮杂-2′-脱氧胞苷对结肠腺癌细胞株Caco-2细胞生物学行为的影响

[目的]研究去甲基化5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对人结肠腺癌细胞株Caco-2细胞生长周期及凋亡的影响,探讨其临床治疗的可能性。[方法]分别使用0.4、1.6、6.4、25.6、102.4μmol/L浓度的5-Aza-CdR处理Caco-2细胞;通过MTT检测5-Aza-CdR对Caco-2细胞存活率的影响;应用流式细胞检测5-Aza-CdR对Caco-2细胞生长周期及凋亡的影响;RT-PCR检测处理前后抑癌基因RASSF1A mRNA表达的改变。[结果]1.6μmol/L浓度的5-Aza-CdR可以明显的抑制Caco-2细胞的增殖,细胞周期中处于G0/G1期的细胞明显的增多,阻滞于G1期,凋亡率增高;5-Aza-CdR的作用与其浓度、时间在一定范围内呈正相关。5-Aza-CdR处理后,无RASSF1A表达的Caco-2细胞可检测出基因RASSF1A的重新表达。[结论]5-Aza-CdR可消除某些抑癌基因启动子甲基化状态,使其重新表达而抑制Caco-2细胞的生长,并促进其凋亡。     

5-杂氮-2′-脱氧胞苷对乳腺癌MCF-7细胞体外迁移能力的影响及机制探讨

目的观察5-杂氮-2′-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）对非浸润性人乳腺癌MCF-7细胞体外迁移能力的影响,并探讨其机制。方法将MCF-7细胞分两组,观察组用含5.0μM5-Aza-CdR的培养液处理4 d,对照组加入等体积的DMSO。采用细胞划痕实验观察细胞体外迁移能力,采用RT-PCR、甲基化特异性PCR（MSP）法检测CXC趋化因子受体-4（CXCR4）、乳腺癌转移抑制基因-1（BRMS1）mRNA及其启动子区甲基化状态。结果与对照组比较,观察组36、48 h细胞划痕愈合率明显升高,MCF-7细胞的CXCR4 mRNA表达量明显增加（P〈0.05）;5-Aza-CdR使CXCR4启动子区甲基化的CpG岛1完全去甲基化,BRMS1启动子区CpG岛B的非甲基化状态亦无明显改变。结论 5-Aza-CdR增强了MCF-7细胞的体外迁移能力,可能与其去甲基化机制上调了促转移基因CXCR4表达有关。     

5-氮杂-2′-脱氧胞苷对胃癌AGS细胞CHFR基因去甲基化作用及意义

目的观察5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）对胃癌AGS细胞CHFR基因去甲基化的作用,并探讨其临床意义。方法分别采用BSP和RT-PCR技术检测5-Aza-CdR处理前后胃癌AGS细胞CHFR基因启动子甲基化状态及其mRNA。结果 AGS细胞CHFR基因启动子在5-Aza-CdR处理前呈现高甲基化状态（甲基化率≥60%）,其mRNA表达完全缺失;5-Aza-CdR处理后则表现为低或无甲基化状态（甲基化率≤20%）,其mRNA表达恢复正常。结论 CHFR基因启动子在AGS细胞中呈高甲基化状态,5-Aza-CdR能显著逆转其CHFR基因异常甲基化,诱导CHFR基因表达,为胃癌的治疗提供新思路。     

5-氮杂-2-脱氧胞苷对百草枯诱导SH-SY5Y细胞神经毒性的影响

目的探讨甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷(5'-aza-d C)对百草枯所诱导的SH-SY5Y细胞神经毒性的影响。方法 SH-SY5Y细胞预先用5'-aza-d C处理24 h,然后暴露于百草枯12 h。对细胞凋亡比例、相关蛋白Bcl-2和Bax表达以及培养液上清中活性氧簇(ROS)进行检测。结果和百草枯加5'-aza-d C干预后SH-SY5Y细胞活性显著降低,凋亡增加。此外,与单独百草枯处理相比,在暴露于百草枯加5'-aza-d C的联合作用后,ROS水平显著增加(P<0.05)。抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低,凋亡诱导蛋白Bax表达增加,Bcl-2/Bax的比例下降,同时,细胞色素C的表达增加。结论 5'-aza-d C通过干预调节DNA甲基化,引起细胞氧化应激增加,并启动线粒体凋亡途径,这些进一步加重百草枯对SH-SY5Y细胞的神经毒作用。     

肿瘤甲基化抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷抑制人皮静脉内皮细胞及生长因子受体2

目的分析肿瘤甲基化抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖、迁移、管室结构及血管内皮生长因子受体(VEGFR)2的影响来探讨5-Aza-CdR对肿瘤血管形成HUVEC的抑制作用。方法将HUVEC以胰酶消化传代至第3代,5-Aza-CdR含药血清进行干预,噻唑蓝(MTT)法检测5-Aza-CdR对HUVEC增殖的影响,Transwell小室观察5-Aza-CdR对HUVEC迁移的速度,管样结构检测5-Aza-CdR对HUVEC管腔结构形成的影响,Western印迹检测5-Aza-CdR对HUVEC受体VEGFR2表达的影响。结果在72 h时5-Aza-CdR 10μmol/L药物组对HUVEC的增殖分化和迁移抑制最为明显,10μmol/L药物组对HUVEC管样结构形成的抑制最为明显,5-Aza-CdR明显抑制VEGFR2蛋白表达,并与剂量浓度大小有正相关关系,浓度越大其抑制蛋白表达的作用也越明显。结论5-Aza-CdR可能通过抑制HUVEC的增殖、迁移、分化、管样结构形成及其主要的促生长因子VEGFR2来阻滞肿瘤血管生长、扩散。     

5-氮杂-2′-脱氧胞苷对肺癌SPC-A-1细胞p16、MGMT基因甲基化及其表达的影响

目的观察5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）对体外培养的肺癌SPC-A-1细胞p16、MGMT基因启动子区DNA甲基化状态及其表达的影响,探讨肺癌细胞p16、MGMT基因失活的机制及去甲基化制剂对p16、MGMT基因表达的调控。方法 5-Aza-CdR处理体外培养的肺癌SPC-A-1细胞,甲基化特异性PCR（MSP）法检测用药前后细胞p16、MGMT基因的甲基化状态,RT-PCR法检测用药前后细胞p16、MGMT mRNA。结果加入5-Aza-CdR前,SPC-A-1细胞p16、MGMTmRNA表达缺失,其启动子区域表现为DNA甲基化。加入5-Aza-CdR后,SPC-A-1细胞中p16、MGMT基因呈现DNA去甲基化,而且表达缺失的p16、MGMT mRNA重新表达。结论启动子区高甲基化是肺癌细胞p16、MGMT基因失活的主要原因之一,去甲基化制剂5-Aza-CdR能逆转p16、MGMT基因甲基化状态,从而调控p16、MGMT基因表达。     

5-杂氮-2’脱氧胞苷对肝癌细胞中TIMP-3基因的作用

目的观察多株肝癌细胞中TIMP-3CpG岛的甲基化状况,观察甲基化药物5-杂氮-2’脱氧胞苷对肝癌细胞株中TIMP-3基因表达及其CpG岛甲基化程度的影响。方法运用MSP定性检测8株肝癌细胞中TIMP-3CpG岛甲基化状况。使用去甲基化药物5-杂氮-2’脱氧胞苷对甲基化阳性的细胞株进行于预,观察干预组与对照组TIMP-3基因表达差异,并使用焦磷酸测序技术定量检测CpG岛甲基化差异。结果在8株肝癌细胞系中C3A、Hep-3B、HepG23株检测到TIMP-3CpG岛甲基化阳性。经去甲基化药物干预后,在这3株肝癌细胞中均发现TIMP-3mRNA的表达较对照组有明显上调（P〈0．05）,CpG岛的甲基化率下降（P〈0．05）。结论甲基转移酶抑制剂能显著降低肝癌细胞株TIMP-3CpG岛甲基化程度及上调TIMP-3mRNA的表达。     

5-氮杂-2＇-脱氧胞苷对胃癌AGS细胞增殖、凋亡的影响及机制探讨

目的观察5-氮杂-2＇-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）对胃癌AGS细胞增殖、凋亡的影响,并探讨其机制。方法分别用低、中、高浓度5-Aza-CdR处理AGS,对照组不处理。CCK-8检测AGS细胞增殖状态,流式细胞仪检测AGS细胞周期及凋亡率,MSP检测AGS中DAPK基因启动子甲基化状态,RT-PCR和Western blot法分别检测AGS中的DAPKmRNA及其蛋白。结果低、中、高浓度组AGS细胞增殖速度显著低于对照组（P均〈0.05）,并呈浓度、时间依赖性（P均〈0.05）。5-Aza-CdR使AGS细胞停滞在G0/G1期（P均〈0.05）,细胞凋亡率增加（P均〈0.05）。对照组DAPK基因启动子表现甲基化状态,低、中、高浓度组DAPK基因启动子被逆转成未甲基化状态。低、中、高浓度组AGS细胞DAPK mRNA及蛋白表达量均显著高于对照组（P均〈0.05）,并呈浓度依赖性。结论 5-Aza-CdR可抑制AGS细胞增殖、促进其凋亡,可能与逆转DAPK基因启动子甲基化状态并使其重新表达有关。     

5-氮杂-2’-脱氧胞苷对内皮祖细胞分化的影响及机制研究

目的探讨5-氮杂-2’-脱氧胞苷诱导内皮祖细胞分化为内皮细胞的作用及初步机制研究。方法收集脐带血,Ficoll-Paque淋巴细胞分离液和6%羟乙基淀粉沉降法分离获得单核细胞并培养,采用免疫组化及倒置相差显微镜鉴定细胞为内皮祖细胞(EPCs),EPCs培养7d后,分别加入1μmol/L(即d C1组),3μmol/L(即d C2组)5-Aza-d C的培养液,阴性组为采用0.0076%DMSO进行干预。流式细胞术检测5-Aza-d C处理后第0、3、7d后CD34+、CD31+的表达,RT-PCR分析VE-cadherin、Tie-2及v WF基因表达,western blotting检测v WF蛋白表达,MSP法检测BMP4基因Cp G岛甲基化表达情况。结果 1单核细胞经倒置相差显微镜及VE-cadherin、Tie-2、v WF、KDR、CD34及CD133等因子证实为EPCs;2流式细胞术结果显示,d C2组在经5-Aza-d C处理后的第3d、第7d CD34+(分别为30.2%、6.7%)降低,同阴性组(46.7%、40.8%)比较差异具有统计学意义(均P0.05);d C2组在经5-Aza-d C处理后的第7d C CD31+(47.9%)升高,同阴性组(31.3%)比较差异具有统计学意义(P0.05);3RT-PCR结果显示,d C2组在处理后第14d Tie-2、VE-cadherin基因均明显高于阴性组(均P0.05);d C1、d C2组在处理后的第3d、第7d、第14d Tie-2、v WF、VE-cadherin基因均明显高于处理后的第0d(均P0.05);4Western blotting检测显示,d C2组第0d、第3d、第7d v WF蛋白表达量均高于阴性组(均P0.05);d C1、d C2组在第3d、第7d v WF蛋白表达量均高于所对应组别的第0d v WF蛋白表达量(均P0.05);5甲基化处理后d C1组和d C2组BMP4呈低表达,而非甲基化时d C1组和d C2组BMP4呈强表达。结论 5-Aza-d C具有定向且快速诱导EPCs分化为内皮细胞的可能,这一作用机制可能与促进BMP4分化基因表达,进而刺激Tie-2、VE-cadherin及v WF的表达的作用有关。     

白藜芦醇对人乳腺癌骨高转移细胞株MDA-MB-231BO生长抑制和凋亡的影响

目的观察白藜芦醇（Res）对人乳腺癌骨高转移细胞株MDA-MB-231BO生长抑制和凋亡的影响,探讨其在抑制乳腺癌骨转移中的应用价值。方法将0、12.5、50、100、200μmo/L的Res分别与MDA-MB-231BO细胞作用24、48、72 h;用CCK-8法检测MDA-MB-231BO细胞的生长抑制率,流式细胞仪分析细胞周期并检测细胞凋亡率,荧光显微镜观察细胞形态。结果随Res浓度的增加及作用时间的延长,MDA-MB-231BO细胞的生长抑制率逐渐升高,S期细胞逐渐增多。Res浓度为200μmol/L、作用48 h,MDA-MB-231BO生长抑制率为82.17%±5.37%、早期凋亡率为4.48%±1.23%、晚期凋亡率为9.48%±2.30%,荧光显微镜下观察用药组随着Res浓度的增加,凋亡细胞逐渐增多。结论Res能抑制人乳腺癌骨高转移细胞株MDA-MB-231BO细胞增殖,使MDA-MB-231BO细胞阻滞于S期,并可诱导该细胞凋亡。     

Estrogen receptor beta inhibits 17beta-estradiol-stimulated proliferation of the breast cancer cell line T47D

Estrogen receptor (ER) beta counteracts the activity of ERalpha in many systems. In agreement with this, we show in this study that induced expression of ERbeta in the breast cancer cell line T47D reduces 17beta-estradiol-stimulated proliferation when expression of ERbeta mRNA equals that of ERalpha. Induction of ERbeta reduces growth of exponentially proliferating cells with a concomitant decrease in components of the cell cycle associated with proliferation, namely cyclin E, Cdc25A (a key regulator of Cdk2), p45(Skp2) (a key regulator of p27(Kip1) proteolysis), and an increase in the Cdk inhibitor p27(Kip1). We also observed a reduced Cdk2 activity. These findings suggest a possible role for ERbeta in breast cancer and imply that ERbeta-specific ligands may reduce proliferation of ER-positive breast cancer cells through actions on the G(1) phase cell-cycle machinery.     

Annexin a2对人乳腺癌MDA-MB-231增殖的影响及分子机制

目的研究Annexin a2的表达对人乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖、细胞周期分布和克隆形成能力的影响,并探讨其可能的分子机制。方法采用小干扰RNA（siRNA）技术下调人乳腺癌细胞中Annexin a2基因的表达,利用MTT比色法、流式细胞术、平板克隆形成实验观察Annexin a2表达水平下降后乳腺癌细胞增殖、周期分布和克隆形成能力的变化;利用免疫共沉淀和免疫荧光分析在MDA-MB-231细胞中与Annexin a2相互作用的蛋白。结果 Western blot证实siRNA干扰后MDA-MB-231细胞中Annexin a2蛋白表达水平明显下降;同时细胞增殖和克隆形成能力显著下降,细胞G0/G1期比例增高,G2/M和S期比例下降;免疫共沉淀发现Annexin a2与信号转导和转录激活因子3（STAT3）存在相互作用。结论 Annexin a2蛋白水平下降可以明显抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖和克隆形成能力,Annexin a2与STAT3相互作用有可能参与乳腺癌细胞的增殖调节。     

15-Aza—CdR对Hs888T骨肉瘤细胞增殖、凋亡及Apaf-1基因表达的影响

目的探讨DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2’脱氧胞苷（5-Aza-CdR）在骨肉瘤发生、发展中的作用及机制。方法采用不同浓度的5-Aza—CdR处理体外培养的骨肉瘤细胞Hs888T。MTT检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡情况,Westernblot法检测细胞Apaf-1蛋白表达水平。结果5-Aza-CdR处理后Hs888T细胞增殖明显受抑,细胞阻滞于G0／G1期,细胞凋亡增加,且与药物浓度及作用时间有关;Apaf-1蛋白表达水平显著增加。结论5-Aza—CdR在骨肉瘤发生、发展中起重要作用;可能机制为诱发Apaf-1在内的某些基因去甲基化。     

Effect of 5-Aza-2’-deoxycytidine on immune-associated proteins in exosomes from hepatoma

AIM: To study the effect of 5-Aza-2’-deoxycytidine (5-Aza-CdR) on heat shock protein 70 (HSP70), human leucocyte antigen-Ⅰ (HLA-Ⅰ) and NY-ESO-1 proteins in exosomes produced by hepatoma cells, HepG2 and Hep3B. METHODS: Exosomes derived from HepG2 and Hep3B cells treated with or without 5-aza-CdR were isolated and purified by ultrafiltration centrifugation and sucrose gradient ultracentrifugation. The number of exosomes was counted under electron microscope. Concentration of proteins in exosomes was measured...     

蛴螬提取物对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响及其机制探讨

目的 观察蛴螬提取物对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响及其机制。方法 采用MTT法检测蛴螬提取物处理过的人乳腺癌MCF-7细胞的生长抑制率,用免疫组化SP法检测用药前后增殖细胞核抗原（PCNA）、Ki-67、细胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表达改变,用流式细胞仪检测细胞周期的变化。结果 用蛴螬提取物处理后的MCF-7细胞生长抑制率明显高于对照组,这种抑制作用呈浓度和时间依赖性;MCF-7细胞经蛴螬提取物处理后Ki-67、PCNA、CyclinD1表达均下降,且随着蛴螬提取物作用时间的延长,S期细胞比例明显升高。结论 蛴螬提取物在体外对人乳腺癌MCF-7细胞株有显著的增殖抑制作用,其机制可能与下调CyclinD1、Ki-67、PCNA的表达有关。