双自杀基因CDglyTK治疗人舌鳞癌的实验研究

[目的]构建双自杀基因真核表达质粒pcDNA3.1( )-CDglyTK并观察脂质体介导其治疗人舌鳞癌的疗效.[方法]将pCEA-CDglyTK中双自杀基因CDglyTK亚克隆到pcDNA( )3.1上构建pcDNA3.1( )-CDglyTK,脂质体介导转染人舌鳞癌细胞,MTT法观察其生长曲线,流式细胞仪检测细胞凋亡.[结果]成功构建双自杀基因真核表达质粒pcDNA3.1( )-CDglyTK,体内外实验表明5-FC和GCV同时存在时具有明显的协同效应,其疗效优于单独使用5-FC或GCV.[结论]双自杀基因CDglyTK可显著提高人舌鳞癌的疗效.     

NP、HN、F基因重组质粒治疗人喉癌裸鼠模型的实验研究

目的：寻找理想的基因治疗喉癌的新方法。方法：采用通过RT－PCR方法及基因重组技术，将新城疫病毒的NP、NH、F基因克隆于真核表达质粒pcDNA3中。将pcDNA3－NP、pcDNA3－结构观察，裸鼠各种组织进行PCR检测，裸鼠血清进行ELISA实验，探讨其作用机理及安全性。结果：在实验组与对照组之间，鼠重，瘤重，瘤体积经统计学处理均有显差异。光镜及电镜下可见肿瘤细胞的坏死与凋亡及炎性细胞浸润。PCR检测：各种组织中均未检测到NP基因，ELISA实验：实验组为阳性，结论：pcDNA3－NH、pcDNA3－F具有抗肿瘤作用，其机理是pcDNA3－NP、pcDNA3－HN、pcDNA3－F能够引起Hep-ll肿瘤细胞的直接溶解。能够增加肿瘤的免疫原性，参诱导产生多种细胞因子。pcDNA3－NP、pcDNA3－HN、pcDNA3－F对正常组织细胞无损害。     

增强型自杀基因载体治疗宫颈癌的体外实验研究

目的探讨运用增强子增强hTERT启动子转录活性后，调控双自杀融合基因CDTK载体对人宫颈癌HeLa细胞的体外杀伤作用。方法将SV40增强子、CMV增强子、CMV增强子／启动子及SV40-CMV双增强子分别与hTERT启动子组合构建成报告基因载体。转染HeLa细胞后用双荧光素酶系统分析其活性差异；然后构建pHr—SCT／CDTKG治疗载体转染HeLa细胞，用流式细胞仅检测转染效率，RT-PCR检测融合自杀基因mRNA表达，HPLC检测5-Fu浓度，MTT分析载体杀瘤的效果。结果HeLa细胞中增强子能使hTERT启动子活性提高6-13倍，其中SV40-CMV双增强子／hTERT启动子的活性最高，达到CMV增强子／启动子的近3倍；体外转染pHr—SCT／CDTKG后可检测到cDTK的mRNA的表达；细胞上清中5-Fu最高浓度为50．83ug／mL；当5-FC浓度为200ug／mL、GCV浓度为10ug／mL时，HeLa细胞的相对细胞存活率为48．7％。结论SV40-CMV双增强子联合hTERT启动子能高效靶向的调控CDTK融合自杀基因杀伤宫颈癌细胞，因而是一种很有前景的基因治疗宫颈癌的策略。     

双自杀基因CDglyTK治疗人舌鳞癌的实验研究

[目的]构建双自杀基因真核表达质粒pcDNA3.1(-)-CDglyTK并观察脂质体介导其治疗人舌鳞癌的疗效。[方法]将pCEA-CDglyTK中双自杀基因CDglyTK亚克隆到pcDNA( )3.1上构建pcDNA3.1( )-CDglyTK，脂质体介导转染人舌鳞癌细胞，MTT法观察其生长曲线，流式细胞仪检测细胞凋亡。[结果]成功构建双自杀基因真核表达质粒pcDNA3.1( )-CDglyTK,体内外实验表明5-FC和GCV同时存在时具有明显的协同效应，其疗效优于单独使用5-FC或GCV。[结论]双自杀基因CDglyTK可显提高人舌鳞癌的疗效。     

PNP-TK融合自杀基因系统对肝癌细胞杀伤作用的实验研究

目的分析PNP—TK融合自杀基因系统对HepG2肝癌细胞的杀伤作用及其对肝癌细胞的杀伤机制。方法利用重组PCR定点诱变法制备PNP—TK融合基因,将其插入真核表达载体pcDNA3．0中,构建融合基因表达载体pcDNA3．0／PNP—TK,经酶切、PCR及测序鉴定重组体,G418筛选获得稳定转染了pcDNA3．0／PNP—TK的抗性细胞克隆。RT-PCR和WesternBlotting检测PNP—TK基因在HepG2细胞中的表达。台盼兰排斥法测定细胞生长曲线,MTF法检测细胞对相应前药的敏感性及分别在一种和两种前药作用下所导致的旁观者效应。结果融合基因片段PNP—TK正确插入了pcDNA3．0载体中,pcDNA3．0／PNP—TK在肝癌细胞株HepG2中实现了表达。细胞抗性克隆对相应的前药十分敏感。在两种前药的联合作用下,pcDNA3．0／PNP—TK对肝癌细胞产生了良好的旁观者效应。结论具有双自杀基因功能的表达载体pcDNA3．0／PNP-TK对肝癌细胞HepG2有着良好的杀伤作用,有望将其应用于肝癌体内治疗。     

融合自杀基因AdCD-UPRT对人肺癌细胞A549的体外作用

目的:研究融合自杀基因CD-UPRT系统对A549细胞的体外作用.方法:包装、扩增携带重组腺病毒AdCD-UPRT,并测定其滴度.检测AdCD-UPRT感染A549细胞的效率、毒性及目的基因的表达.用MTT法观察AdCD-UPRT/5-FC系统对A549细胞的体外抑制作用及旁观者效应.运用AO-EB染色、电镜及FCM观察AdCD-UPRT/5-FC系统对A549细胞的诱导凋亡作用.结果:CD-UPRT融合自杀基因对A549细胞显示出明显的生长抑制作用并存在旁观者效应,使细胞周期阻滞于S期并诱导细胞凋亡.结论:CD-UPRT融合自杀基因系统对A549细胞有较强的细胞毒作用.     

外源性p16基因稳定转染对喉癌细胞周期和增殖的影响

目的：探索p16基因在喉癌细胞内的表达作用及基因治疗方面的应用前景。方法：采用亚克隆技术，构建p16真核表达载体pCDNA3-p16.利用lipofectamine介导，将外源野生型p16基因导入喉癌细胞系Hep-2，筛选阳性克隆，采用打点杂交技术、免疫荧光、免疫组化、图像分析法观察和分析p16基因的表达。同时以空载体质粒pCDNA3为对照，用流式细胞仪分析瘤细胞生长周期、荧光染色检测细胞凋亡。结果：打点杂交、免疫荧光、免疫组化及图像分析法分析证实转染p16基因的Ｈep-2细胞有外源p16基因的表达，外源基因p16在Hep-2细胞系中的表达能抑制Hep-2细胞系的生长。流式细胞仪计数和免疫荧光检测证实p16能诱导喉癌细胞系Hep-2发生凋亡并导致其发生G1期阻滞。结论：导入外源野生型p16基因可抑制喉癌细胞恶性增殖。     

RV-HSV-TK/GCV自杀基因系统治疗宫颈癌的实验研究

目的探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV-TK/GCV)自杀基因系统对人宫颈癌细胞系Hela体外及体内的杀伤作用及其产生的旁观者效应.方法采用脂质体转染法将GINaTK载体转入包装细胞PA317.取病毒上清液感染人宫颈癌细胞Hela,得到带有HSV-TK基因的Hela/TK细胞,并将其分别用于体外和体内实验.体外实验中,Hela/TK细胞对丙氧鸟苷(GCV)的敏感性和旁观者效应采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定.动物试验中分别在BALB/C小鼠的右腋窝皮下按不同比例注射Hela/TK细胞和Hela细胞,然后给予GCV治疗.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测肿瘤组织中HSV-TK基因的表达情况.结果转染HSV-TK基因的Hela/TK细胞表现出比亲本Hela细胞更强的杀伤肿瘤效应.体外实验结果显示,当Hela/TK细胞数占混合细胞10%时,低浓度(10μg·ml-1)的GCV就可将50%左右的肿瘤细胞杀死.体内实验结果显示,GCV可明显抑制Hela/TK细胞在BALB/C小鼠体内的肿瘤形成.经GCV治疗后,Hela/TK组和混合细胞组肿瘤体积分别较对照组肿瘤体积缩小52.8%和69.4%(均P＜0.001).小鼠的平均生存期也显著延长(P＜0.001).结论逆转录病毒可介导HSV-TK基因转入人宫颈癌细胞Hela并获稳定表达,HSV-TK/GCV自杀基因系统在体内外对宫颈癌细胞均有杀伤作用,且存在明显的旁观者效应.     

柯里拉京杀伤人喉癌Hep-2细胞的体外实验研究

目的 观察柯里拉京（Corilagin）对人喉癌细胞系Hep-2的杀伤作用。方法 在体外细胞培养的基础上,通过倒置显微镜、肼比色法、流式细胞仪观察Corilagin作用后Hep-2细胞的形态学、增殖率和细胞周期的改变。结果 Corilagin作用后的Hep-2细胞形态发生了明显变化;其抑制增殖作用呈量效、时效关系;Corilagin可阻肿瘤滞细胞于S期,并可诱导细胞凋亡。结论 Corilagin能显著抑制Hep-2细胞增殖,可能与阻滞细胞于S期和诱导凋亡有关,Corilagin抗肿瘤作用值得进一步研究。     

喉癌和鼻咽癌体外药敏试验AgNOR法的实验及临床研究

目的：用嗜银蛋白检测技术（AgNOR)分析喉癌和鼻咽癌对8种常用化疗药物的敏感性。方法：从56例喉癌和鼻咽癌患者获取新鲜肿瘤组织标本，采用单纯机械分离法制备单细胞悬液。加入抗癌药物后培养36h，细胞悬液涂片，银染，计数银染颗粒后计算均值下降率；12例患者同期行化疗。结果：51例肿瘤获得实验成功，可评价率为91.1%，AgNOR颗粒均值下降率从0-63%，在8种单一药物中，对DDP的敏感率最高，其它较为敏感的药物为VCE、T-FU、PYM；鼻咽癌对抗癌药物的敏感性显著于喉癌对抗癌药物的敏感性；体外药敏与体内疗效的总符合率为80%。结论：AgNOR技术简便易行，与临床相关性好，是一种有应用前景的体外药敏筛选方法。     

血管内皮生长因子受体启动子驱动重组腺病毒双自杀基因系统选择性杀伤大肠癌细胞

目的 探讨血管内皮生长因子受体(KDR)启动子驱动重组腺病毒CDglyTK融合基因体系对结直肠癌细胞株LOVO及人脐血管内皮细胞株ECV30的选择性杀伤作用.方法 将质粒pAdEasy-KDR-CDglyTK在293细胞内包装、扩增后,体外感染表达KDR的LoVo、ECV30细胞和对照组不表达KDR的LS17T细胞,并给予不同浓度的前药GCV(ganciclovir)和/或5-FC(5-fluorocytosine),观察该体系对细胞株的杀伤效应.结果 制备的病毒滴度为2.0×1012pfu/ml.3种细胞的感染率相似,且感染率随腺病毒滴度的递增而增加,当MOI为200时,所有细胞株均接近100%感染.以MOI为100的重组体分别感染各细胞株,发现其对前药的敏感性不同:表达KDR的LoVo和ECV30细胞对前药具有较高的敏感性,且二者敏感性无显著差异(P>0.1);与前二者相比,LS17T细胞对前药不敏感(P<0.001).同时,CDglyTK双自杀基因的疗效优于任一单自杀基因(P<0.001).流式细胞术检测表明该体系抑制LoVo细胞DNA的合成,表现为S期细胞比率增多及G1期细胞减少(P<0.001).结论 KDR基因启动子调控的CDglyTK融合基因体系可选择性杀伤结直肠癌LoVo细胞和血管内皮细胞.     

重组腺病毒介导的KDR-CDglyTK 基因靶向杀伤胃癌细胞的体外实验研究

目的探讨腺病毒介导KDR启动子驱动的双自杀基因体系对人胃癌细胞SCG7901靶向杀伤作用以及是否存在旁观者效应。方法用MOI=100时,将携带融合基因重组腺病毒Ad-KDR-CDglyTK及Ad-CMV-CDglyTK体外感染SCG7901、ECV304和HepG2细胞,检测细胞的感染效率以及转基因肿瘤细胞在mRNA水平上融合基因的表达;在前药5-氟胞嘧啶(5-FC)和/或更昔洛韦分别按不同浓度、不同作用时间和方式下,观察双自杀基因体系对SCG7901细胞的靶向杀伤作用和旁观者效应。结果携带双自杀基因(CDglyTK)和报告基因(GFP)的重组腺病毒载体,感染复数为100时,95%以上的受感染SCG7901、HepG2和ECV304细胞中有GFP表达。感染腺病毒Ad-CMV-CDglyTK的各细胞以及感染腺病毒Ad-KDR-CDglyTK的SCG7901及ECV304细胞对单一前药具有较高的敏感性,细胞的存活率各随单一前药浓度的增加而递减;而感染腺病毒的Ad-KDR-CDglyTK的HepG2细胞对前药不敏感。感染腺病毒Ad-KDR-CDglyTK的SCG7901及ECV304细胞分别在同一浓度前药的作用下,...     

腺病毒介导的双自杀基因系统对乳腺癌细胞的杀伤作用

目的 探讨腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶(CD)和胸苷激酶(TK)融合双自杀基因系统对乳腺癌治疗作用.方法 用重组VEGFP-CD/TK-GFP基因的腺病毒体外感染表达VEGF的乳腺癌MCF-7细胞和对照组不表达VEGF的乳腺上皮细胞,荧光显微镜观察其感染效率,以RT-PCR检测受感染细胞CD/TK的表达,然后给子前药环氧鸟苷(GCV)和/或5-氟胞嘧啶(5-FC),用MTT法观察该体系对细胞生长增殖的影响;用流式细胞术观察细胞周期变化.建立MCF-7裸鼠皮下移植瘤模型,采用瘤内注射腺病毒载体联合腹腔内注射前药GCV和/或5-FC治疗后,观察肿瘤生长情况.结果 腺病毒对两种细胞的感染率相似,其感染率随腺病毒滴度的增高而递增.RT-PCR检测发现转染Ad-VEGFP-CD/TK的MCF-7细胞有目的 基凶的表达,而乳腺上皮细胞无表达.MTT法检测显示表达VEGF的MCF-7细胞对前药具有较高的敏感性,而不表达VEGF的乳腺上皮细胞对前药不敏感,CD/TK融合基因对MCF-7的疗效优丁任一单自杀基因(P＜0.01).在感染复数为100时,用流式细胞仪分析细胞周期显示治疗组细胞G0-G1期比率增多,S期细胞减少.在MCF-7裸鼠移植瘤模型中.该双自杀基因系统能够显著抑制肿瘤的牛长.其疗效优于任一单自杀基因(P<0.01).结论 腺病毒介导VEGF启动子驱动的CD/TK融合双自杀基因联合GCV和5-FC能有效治疗乳腺癌,其效果优于单自杀基因系统.     

Adenoviral mediated suicide gene transfer in the treatment of pancreatic cancer

Objective To determine the efficacy of adenovirus- mediated suicide gene transduction comb ined with prodrug 5- fluorocytosine (5FC) as a therapeutic protocol for pancreat ic cancer. Methods Cytosine Deaminase(CD) gene was cloned into pAdTrack- CMV- CD, pAdTrack- CMV- CD and pAdEasy- 1 were recombined in bacteria. The newly recombined adenovirus (A d)- CD containing green fluorescent protein (GFP) were packaged and propagated i n 293 cells and purified by cesium chloride gradient centrifugation. Human panc reatic carcinoma cell line- Patu8988 was infected with this virus, then 5FC was added. XTT assay was used to estimate relative numbers of viable cells. In viv o model of pancreatic cancer was established by injecting 1. 0×10[7] Patu8988 c ells subcutaneously in Balb/c nude mice. When tumors were palpable, Ad- CD was injected into each tumor and 5FC was administered. Results Positive clones were selected using endonuclease to digest the recombinants and the concentration of viral liquids containing the CD gene was 2×10[11] pfu /ml. Significant cytotoxic activity as shown for 5FC in the CD gene transduced 8988 cell line, while little effect was found in the nontransduced pancreatic ca rcinoma cells. Antitumor effect was observed in Patu8988 xenograft nude mice wi th in situ CD gene transduction. Conclusions CD gene mediated by adenovirus has high infectivity and may be useful for gene t herapy in pancreatic carcinoma. These data demonstrate the use of an enzyme pro drug strategy in experimental pancreatic cancer.     

自杀基因联合细胞因子的癌症治疗

INTRODUCTION The transfer of suicide genes into tumor cells is currently being used in a variety of clinical gene therapy trials for the treatment of cancer, and suicide gene therapy is the transduction of a gene that transforms a non-toxic into a toxic substance[1].     

HSV-tk/GCV自杀基因系统对骨肉瘤细胞体外杀伤效应

目的：观察：HSV—tk／GCV系统对骨肉瘤细胞SAOS-2的体外杀伤作用．方法：构建tk基因逆转录表达载体pL(tk)SN,在lipofectamine2000介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,用NIH3T3测定病毒滴度,将重组病毒感染人骨肉瘤细胞SAOS-2,G418筛选出抗性克隆命名为SAOS／tk,以RT—PCR及Southern blot检测tk基因的整合及表达．观察tk基因修饰细胞生长状况及MTT法观察前药对tk基因修饰骨肉瘤细胞的杀伤效应．结果：RT—PCR及Southern blot分析证明tk基因在人骨肉瘤细胞系SAOS-2中有整合及表达;SAOS／tk与未转基因的原肿瘤细胞相比,两者生长速度及形态结构无明显差别;在前药敏感性试验中,GCV对SAOS／tk细胞的杀伤作用十分明显,半数致死量约为1mg／L,而亲本细胞SAOS-2和空白质粒转染SAOS／0细胞,半数致死量大于100mg／L．tk基因修饰细胞与不同比例亲本细胞混合后经GCV治疗,SAOS／tk占混合细胞总数的20％时即可杀伤约50％的混合培养细胞.结论：人骨肉瘤细胞系SAOS-2对HSV—tk／GCV系统高度敏感,并且有明显的旁观者效应,可望成为骨肉瘤基因治疗的新途径．     

重组腺病毒驱动KDR-CDglyTK融合基因系统对MCF-7细胞及血管内皮细胞的靶向杀伤作用

目的探讨腺病毒介导血管内皮生长因子受体(KDR)启动子驱动的CDglyTK融合基因体系对人乳腺癌细胞株MCF-7及血管内皮细胞(ECV304)选择性杀伤作用。方法将质粒pAdEasy-KDR-CDglyTK在293细胞内包装、扩增后,体外感染表达KDR的MCF-7、ECV304细胞株和对照组不表达KDR的LS174T细胞株,并给予不同浓度的前药5-FC和/或GCV,观察该体系对不同细胞株的杀伤效应及其旁观者效应。并通过流式细胞仪检测前药对瘤细胞周期的影响。结果所得病毒滴度为2.0×1012pfu/ml。3种细胞的感染率相似,其感染率随腺病毒滴度的递增而增加,当感染复数(MOI)为200时,所有细胞株均达约100%感染。以MOI为100的重组体分别感染各细胞株表现出对前药的不同敏感性:表达KDR的MCF-7细胞和ECV304细胞对前药具有较高的敏感性,二者敏感性差异无显著性意义(P=1.00);与前2者相比,不表达KDR的LS174T细胞对前药不敏感(P<0.001)。CDglyTK融合基因的疗效优于任一单自杀基因(P<0.001)。将感染腺病毒的细胞与未感染细胞以不同混合培养,观察到该体系明显的旁观者效应。流式细胞术检测表明该体系抑制MCF-7细胞DNA的合成,表现为G1期细胞比率增多及S期细胞减少(P<0.001)。结论KDR基因启动子调控的CDglyTK融合基因体系可选择性杀伤乳腺癌MCF-7细胞及血管内皮细胞。