致敏小鼠CD4~+ CD25~+调节性T细胞磁珠分选及体外扩增

本研究探讨致敏小鼠CD4+ CD25+调节性T细胞的分选及体外扩增。流式细胞术检测致敏小鼠及正常小鼠体内CD4+ CD25+ Treg细胞水平,免疫磁珠分选方法从小鼠脾细胞中分选出CD4+T细胞、CD4+ CD25+ Treg细胞和CD4+ CD25-T细胞,负载抗CD3/CD28单克隆抗体MACSiBead联合IL-2共同刺激CD4+ CD25+ Treg细胞进行体外扩增培养,用0.4%台盼蓝染色并计数检测细胞的活性,流式细胞术检测分选后细胞纯度、主要表面标记及Foxp3基因的表达。结果表明:致敏小鼠体内CD4+ CD25+ Treg水平较正常小鼠升高(P<0.05)。分选出CD4+ CD25+ Treg细胞纯度平均达到87%,细胞活性大于97%,高表达Foxp3基因。体外扩增2周后细胞数扩增倍数能够达到42倍,CD4+ CD25+ Treg细胞所占比例为85.32%,Foxp3表达由(76.92±1.72)%稍下降至(75.33±2.11)%(P>0.05)。结论:免疫磁珠分选法能够分选出高纯度的CD4+ CD25+ Treg细胞,该分选方法不影响分选靶细胞的细胞活力;体外成功扩增了CD4+ CD25+ Treg细胞,扩增后的CD4+ CD25+ Treg细胞表面标记及Foxp3基因表达无明显改变。     

Dsg3特异性的CD4~+ T细胞能够辅助B细胞产生天疱疮抗体

目的探讨CD4+T细胞在天疱疮致病性抗体产生中的作用。方法实验方面采用真核表达系统表达重组的天疱疮抗原桥粒芯糖蛋白3(Dsg3)胞外段功能区,联合不同佐剂(CFA或Alum)免疫C57BL/6小鼠,用免疫磁珠细胞分选(MACS)法分选出免疫后小鼠的CD4+T细胞,过继转移到T细胞受体β链(T cell receptor beta chain,TCRβ)缺陷小鼠,于转移后1、2、3、4周检测TCRβ缺陷小鼠体内CD4+T细胞的恢复,B细胞的增殖、活化,及特异性抗体的产生。结果过继转移后的TCRβ缺陷小鼠外周血中有CD4+T细胞的出现(比例有5%左右);CD4+T细胞进入缺陷小鼠脾脏中的淋巴小结,和B细胞相互作用;同时该小鼠血清中出现了特异性抗Dsg3抗体。结论 CD4+T细胞参与天疱疮致病性抗体的产生,在疾病中发挥极其重要的作用。     

调节性T细胞抑制小鼠淋巴瘤细胞系EL4体外增殖的研究

本研究探讨自体调节性T细胞对T细胞淋巴瘤细胞系EL4的增殖抑制作用及其机制。应用免疫磁珠分离法(MACS)分选获得C57BL/6小鼠CD4+CD25+T细胞(Treg细胞),流式细胞术检测分选所得的细胞纯度及Foxp3的表达水平,PT-PCR法检测Foxp3 mRNA的表达,3H-TdR掺入法检测分选的Treg细胞对T细胞淋巴瘤细胞系EL4的体外抑制作用,ELISA方法检测抑制实验中细胞因子TGF-β1和IL-10的水平。结果显示,MACS分选获得CD4+CD25+T细胞纯度达94.52%,Foxp3表达比例为84.72%;分选后的细胞用PT-PCR法可检测到Foxp3mRNA的表达;3H-TdR掺入法证实无论有无抗原呈递细胞(APC)或树突状细胞(DC)存在,自体Treg细胞在体外都能明显抑制EL4细胞的增殖(p0.05),APC或DC有可能增强这种抑制作用,且单纯DC对EL4细胞的增殖也有抑制作用;实验中可检测到细胞因子TGF-β1和IL-10。结论:自体Treg细胞在体外能够明显抑制淋巴瘤细胞系EL4细胞的增殖,APC或DC可能增强这种抑制作用,且单纯DC对EL4细胞的增殖也有抑制作用。细胞因子TGF-β1和IL-10是Treg细胞发挥抑制作用的途径之一。     

小鼠调节性T细胞的CD4+ CD25+ CD127low/-标记分析

新的特异性细胞表面标记的发现是提高调节性T细胞(Treg)测量和分选技术的重要环节,Foxp3是公认的天然Treg的标记,却不能作为分选细胞的标记,CD127是新发现低表达于Treg细胞表面的标记。本实验测定CD4+CD25+CD127low/-和CD4+CD25+Foxp3+标记的小鼠外周血及脾脏Treg细胞的数量,并测定CD4+CD25+CD127low/-细胞内Foxp3转录因子的表达水平,分析CD4+CD25+CD127low/-标记在小鼠Treg细胞测定及分选的价值。收集BALB/c小鼠外周血及制备脾细胞悬液,分别三重荧光染色CD4、CD25、CD127及CD4、CD25、Foxp3后应用流式细胞仪检测,得出CD4+CD25+CD127low/-、CD4+CD25+Foxp3+这两种标记的小鼠外周血和脾脏Treg细胞的比例;再在CD4、CD25、Foxp3基础上加CD127染色(四重荧光染色),检测CD4+CD25+CD127low/-细胞Foxp3转录因子的表达情况。结果显示:①BALB/c小鼠外周血CD4+T细胞的分布:在总T细胞中CD4+TCD4+CD25+T细胞的中位表达水平分别为39.02%、5.35%;在CD4+T细胞中CD4+CD25+CD127low/-、CD4+CD25+Foxp3+细胞的中位表达水平分别为7.13%、3.97%;②BALB/c小鼠脾脏CD4+T细胞的分布:在总T细胞中CD4+T、CD4+CD25+T细胞的中位表达水平分别为23.49%、3.86%;在CD4+T细胞中CD4+CD25+CD127low/-、CD4+CD25+Foxp3+细胞的中位表达水平分别为12.8%、8.23%;③BALB/c小鼠外周血和脾脏CD4+CD25+CD127low/-细胞比例高于CD4+CD25+Foxp3+细胞,以脾脏更为明显(P<0.01);④小鼠外周血及脾脏CD4+CD25+CD127low/-细胞高表达Foxp3转录因子,CD4+CD25+Foxp3+细胞低表达CD127。结论:BALB/c小鼠外周血和脾脏CD4+CD25+CD127low/-较CD4+CD25+Foxp3+能定量更多的Treg细胞;CD127low/-作为CD4+CD25+Treg细胞表面的特征性标志,在细胞分选时受其他细胞的干扰最小,是定量和纯化小鼠Treg细胞的更好标记选择。     

多发性硬化抗原特异性CD4~+CD25~+调节性T细胞的体外扩增及其功能效应

目的针对多发性硬化(MS)患者CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)的免疫功能缺陷,尝试利用体外培养法获取功能正常的Treg。方法密度梯度离心法获得MS患者(n=5)和健康对照者(n=5)外周血单个核细胞(PBMC),免疫磁珠法分选B细胞和CD4+CD25-初始T细胞,前者进一步经可溶性CD40配体(sCD40L)刺激活化后作为抗原提呈细胞(APC),与后者混合体外共培养,并以髓鞘碱性蛋白(MBP)85-99等刺激后收获细胞;经流式细胞仪分选获得CD4+CD25highCD127low Treg。通过增殖分析鉴定所获Treg的免疫抑制功能。结果磁珠法分选B细胞、初始T细胞的纯化率分别达到90%和80.62%。体外诱导扩增所获的MBP反应性Treg比例为3.5%⁶%,MS组与健康对照组Treg比较抑制功能活性无明显差异。结论经此方法可扩增获得免疫功能正常的Treg细胞,进而为今后开展MS的特异性免疫调节治疗提供客观的依据。     

人CD4~+FOXP3~+T细胞的异质性研究进展

CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)是一群具有免疫调节功能的细胞,对维持自身免疫耐受和免疫自稳必不可少,FOXP3特异性表达于Treg细胞,是Treg细胞发育、活化、发挥功能的关键。目前,CD4+FOXP3+T淋巴细胞常被用来定义Treg细胞进行科学研究,而最近研究表明,人CD4+FOXP3+T淋巴细胞存在表型和功能上的异质性,这其中包括具有免疫抑制功能的CD4+FOXP3+Treg,还包含没有抑制功能的其它类型T细胞,而这些不同功能的细胞亚群可以通过表型的差异加以区分。本文就近年来关于CD4+FOXP3+T细胞亚群表型特征和功能的异质性研究作一综述。     

人CD4+FOXP3+T细胞的异质性研究进展

CD4+ CD25+调节性T细胞(Treg)是一群具有免疫调节功能的细胞,对维持自身免疫耐受和免疫自稳必不可少,FOXP3特异性表达于Treg细胞,是Treg细胞发育、活化、发挥功能的关键.目前,CD4+ FOXP3+T淋巴细胞常被用来定义Treg细胞进行科学研究,而最近研究表明,人CD4+ FOXP3+T淋巴细胞存在表型和功能上的异质性,这其中包括具有免疫抑制功能的CD4+ FOXP3+ Treg,还包含没有抑制功能的其它类型T细胞,而这些不同功能的细胞亚群可以通过表型的差异加以区分.本文就近年来关于CD4+ FOXP3 +T细胞亚群表型特征和功能的异质性研究作一综述.     

外周血T细胞亚群及TGF-β1在终末期肾衰竭患者中的表达及意义

目的探讨外周血CD4+T细胞、CD8+T细胞、调节性T(Treg,CD4+CD25+Foxp3+T)细胞及转化生长因子β1(TGF-β1)在终末期肾衰竭(ESRF)患者免疫调节过程中的作用及患者免疫功能紊乱的可能机制.方法应用流式细胞术(FCM)和ELISA法对正常组(HC)、ESRF未透析组(NHD)、常规血液透析组(HD)分别检测CD4+T细胞、CD8+T细胞、Treg细胞占淋巴细胞百分比及血清TGF-β1水平.结果 NHD患者及HD患者外周血CD4+T细胞百分比、CD4+/CD8+T细胞比值、Treg细胞百分比及TGF-β1水平均显著低于正常人(P<0畅05);HD患者Treg细胞较NHD患者下降更明显(P<0畅05).结论 ESRF患者体内存在以细胞免疫功能缺陷为主的的免疫系统,在这种背景下,Treg细胞百分比及TGF-β1水平下降,未能改善ESRF患者的免疫功能,血液透析可能加重了患者免疫功能紊乱.     

大鼠CD4+CD25-T细胞的Foxp3基因转染及其表达

背景:调节性T细胞在维持机体免疫应答稳态和免疫耐受方面具有非常重要的作用,但外周血中CD4+CD25+调节性T细胞含量极低,且增殖能力较差.目的:以携带Foxp3基因的慢病毒EGFP+载体转染大鼠CD4+CD25- T细胞,观察其在大鼠CD4+CD25- T细胞中的表达.方法:以免疫磁珠两步法分选大鼠CD4+CD25- T细胞,用携带大鼠Foxp3基因的慢病毒载体体外转染分选的细胞,以转染Foxp3基因的CD4+CD25- T细胞为实验组,EGFP空白质粒组及CD4+CD25- T细胞为阴性对照组,CD4+CD25+ T细胞为阳性对照组.荧光显微镜和RT-PCR分别从蛋白和mRNA水平检测Foxp3基因的表达.结果与结论:成功完成了免疫磁珠的分选,获得了纯度较高的CD4+CD25-T细胞和CD4+CD25+ T细胞,细胞存活率为(94±2)%,慢病毒转染的CD4+CD25- T细胞高表达Foxp3基因.表明以携带Foxp3基因的慢病毒载体系统可有效介导Foxp3基因在大鼠CD4+CD25- T细胞中高表达.     

CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞体外诱导扩增与临床应用研究进展

CD4+CD25+Foxp3+调节性T(Treg)细胞在维持外周免疫耐受、预防自身免疫性疾病及移植排斥反应的过程中起着重要作用。Treg细胞治疗方法具有作用时间持久、低毒和靶向特定抗原的特点,但由于Treg细胞在外周血中数量甚少,限制其在临床的应用。研究表明体外扩增得到的Treg细胞的免疫治疗效果大于初始Treg细胞。本文就目前Treg细胞的体外诱导扩增和临床应用等方面的研究进展进行总结。     

CD+4CD+25CDlow/-127细胞体外抑制效应T淋巴细胞增殖的影响

1995年,Sakaguchi等 [1]率先在小鼠外周血中分离获得发挥免疫抑制功能的CD+4CD+25T淋巴细胞,被称为调节性T淋巴细胞(Regulatory T cells,Treg).Treg细胞不仅具有抑制自体反应性T淋巴细胞的功能,还能阻止效应性T淋巴细胞的过度增殖和活化,甚至能影响B淋巴细胞产生免疫球蛋白 [2].因此,对Treg细胞的功能研究正成为当今国内外的研究热点.本研究以CD+4CD+25CDlow-127为膜表面标志分选Treg细胞,利用羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(carboxyfluorescein diaeetate,succinimidyl ester,CFSE)方法 体外检测其对效应T淋巴细胞增殖的影响,从而为Treg细胞的功能研究奠定实验基础.     

自体调节性T细胞可抑制恶性淋巴瘤细胞的增殖

本研究探讨自体调节性T细胞对T细胞淋巴瘤细胞系EIA的作用及其机制。应用免疫磁珠分离法（MACS）分选获得C57BL／6小鼠CD4＋CD25＋T细胞（Treg细胞）,流式细胞术检测细胞纯度及Foxp3表达情况,MTY比色法检测分选的Treg细胞对T细胞淋巴瘤细胞系EL4的体外抑制作用,应用ELISA方法检测TGF—B1和IL-10的含量。结果表明：MACS分选获得CIM＋CD25＋T细胞纯度达91．6％,活细胞比例〉95％,Foxp3表达率为78．9％。MTT比色法证实自体Treg细胞在体外能够明显抑制EIA细胞的增殖（P〈0．05）,且呈细胞因子非依赖性。作者首次证明,自体Treg细胞体外有明显抑制T细胞淋巴瘤细胞系EIA增殖的作用。     

胸腺基质淋巴细胞生成素诱导重症肌无力患者胸腺CD4~+CD25~-T细胞向CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞分化

目的:探索胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)对重症肌无力(MG)合并胸腺异常患者胸腺CD4+CD25-T细胞诱导生成CD4+CD25+Foxp3+调节性T(Treg)细胞的研究。方法:以磁珠分选的方法得到胸腺CD4+CD25-T细胞及树突状细胞(DC)细胞,通过不同浓度(0.1、1、10、20 ng/m L)的TSLP活化DC后诱导CD4+CD25-T细胞向CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞分化,以流式细胞术检测CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞/CD4+T细胞比率;RT-PCR检测Foxp3 m RNA表达;Western blot法检测上调的CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的Foxp3蛋白表达;ELSIA法检测培养上清IL-10的含量。结果:10 ng/m L TSLP组、20 ng/m L TSLP组经诱导后CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞/CD4+T细胞比例均明显升高,Foxp3的表达水平也相应增加,IL-10水平升高,与PBS对照组相比差异有统计学意义(P0.05)。结论:TSLP可以诱导MG合并胸腺异常患者胸腺CD4+CD25-T细胞向CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞分化,并促进Foxp3的表达。     

应用扩增的Treg预防异基因骨髓移植后移植物抗宿主病的实验研究

目的：探讨扩增后的CD4+CD25+调节T细胞(regulatory T cell ,Treg)输注对异基因骨髓移植(allo-BMT)后小鼠移植物抗宿主病(GVHD)的影响。方法：利用免疫磁珠法分选小鼠Treg细胞； 以抗鼠 CD3ε 单抗、抗鼠CD28 单抗 、鼠重组 IL-2及辐射过的Balb/C小鼠脾细胞为共刺激因子，扩增TREG细胞；建立C57BL/6→BALB/c小鼠allo-BMT模型,接受移植小鼠随机分为3组,移植骨髓后6-8小时后分别予尾静脉输注扩增的Treg细胞、CD4+CD25-T细胞和RPMI 1640培养液(空白对照)。以移植后GVHD表现,肝、脾、小肠组织病理形态、生存期为观察指标并进行组间比较。结果：经免疫磁珠法分选可获得高纯度(91.80±2.15)%及具较强活力(97.58±1.23)%的Treg细胞；移植后(四周左右)的扩增后Treg细胞移植组小鼠肝、脾、小肠GVHD病理损害较同期CD4+CD25-T细胞移植组与空白对照组小鼠有一定程度的减轻。3组小鼠移植后平均存活时间分别为（61. 45±27. 88）天、(18.58±12. 39)天和(26. 37±15. 65)天, 扩增后Treg细胞移植组小鼠平均存活时间较CD4+CD25-T细胞、空白对照组小鼠延长(P<0.05)。结论：allo-BMT后输注增殖的Treg细胞可以减轻移植后GVHD程度,延长小鼠生存时间。     

钙通道与调节性T细胞效应功能的研究进展

调节性T细胞(Treg)为一类具有免疫抑制作用的T细胞,在维持免疫系统正常的外周耐受中发挥了重要作用,其中经典的CD4+CD25+Foxp3+Treg,无论是其数量还是抑制功能异常均可导致自身免疫性疾病。钙离子通道在免疫细胞发挥功能效应中是必不可少的,同样在Treg的发展和效应功能中也起着重要的作用,特别是STIM,ORAI,calcineurin-NFAT通路。现对钙离子通道在Treg的作用作一归纳总结。     

消化道肿瘤患者外周血中CD4^＋CD25^＋调节性T细胞的检测

CD4 CD25 调节性T细胞(regulatory T,Treg)是一类维持机体免疫动态平衡的T淋巴细胞亚群,具有免疫无能性和免疫抑制性特点[1-2]。本文对不同的消化道肿瘤、组织类型及治疗前后外周血CD4 CD25 Treg细胞的变化进行观察,以探讨CD4 CD25 Treg细胞的临床意义。1对象与方法1.1研究对象     

U0126对imDC诱导初始性CD4+T细胞的体外研究

目的:研究ERK1/2信号通路在imDC诱导同种异体CD4+T细胞分化为Treg细胞中的作用,探讨免疫耐受状态建立的可能分子机制.方法:密度梯度离心法从血液标本中分离PBMC,加入GM-CSF和IL-4联合诱导、扩增至第7天,使其转化为imDC,从细胞形态学、细胞表面标记物以及细胞功能三方面进行鉴定;免疫磁珠分选法从单个核细胞中分离初始性CD4+T细胞,将其混合培养,同时设空白组、混合对照组、低浓度UO126组、中浓度U0126组和高浓度U0126组,分别以FCM检测初始性CD4+T细胞转化为Treg 细胞的转化率.结果:空白组:3.25%±0.89%,混合对照组:21.80%±0.40%,低浓度U叭26组:22.58%±0.52%,中浓度U0126组40.81%±0.81%,高浓度U0126组:41.58%±0.81%.结论:人外周血来源的im[DC可以诱导初始性CD4+T细胞转化成Treg细胞:ERK1/2信号传导通路特异性阻断剂U0126可以部分促进初始性CD4+T细胞向Treg细胞转化,表明该阻断剂在免疫耐受的诱导中起了一定的作用.     

Th17/Treg失衡与肿瘤免疫

免疫微环境的平衡与肿瘤的发生、发展密切相关,而CD4+T细胞在肿瘤免疫应答中发挥重要的辅助作用.目前研究认为,初始CD4+T细胞在不同条件下可分化成不同亚型的T淋巴细胞,包括Th1、Th2、Th17和调节性T细胞( regulatory T cell,Treg),分别受不同的转录因子调控,在体内发挥不同的生物学功能.Th17细胞与Treg细胞是目前免疫学研究的热点,其不仅参与免疫应答、免疫耐受的调节,在自身免疫性疾病、炎症、移植排斥反应和肿瘤免疫中亦具有重要作用.Th17细胞在分化及功能上与Treg细胞相互抑制,维持机体局部微环境的平衡.本文旨在探讨Th17细胞、Treg细胞在肿瘤免疫中所扮演的不同角色,及Th 17/Treg失衡与肿瘤免疫的关系及作用.     

胃癌患者外周血中调节性T细胞和CTLA-4的表达及临床意义

目的 研究胃癌患者外周血CD4+ CD25+调节性T细胞(Tregs)和共刺激分子细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4,CD152)的表达水平,并探讨细胞频数的变化与肿瘤临床分期的相关性,从而探讨在胃癌肿瘤免疫过程中Treg细胞对免疫效应细胞的调节作用,共刺激通路是否异常及其在胃癌的发病机制中的作用.方法 用流式细胞仪检测49例胃癌患者外周血淋巴细胞表面的CD152及CD4+ CD25+调节性T细胞的表达,并与健康对照组及胃良性肿瘤组作比较.结果 胃癌患者外周血中CD4+ CD25+和CD3+CD152+水平显著增高,高于健康对照组及良性肿瘤组;胃癌临床分期越晚CD4+CD25+和CD3+ CD152+水平越高,在临床Ⅰ、Ⅱ期患者与临床Ⅲ、Ⅳ期患者之间存在显著差异,统计学有显著差异.结论 胃癌患者外周血淋巴细胞高表达CTLA-4分子,Treg细胞的数量较正常人明显增高,影响了T细胞彻底清除肿瘤细胞,从而使肿瘤逃避机体的免疫监视、与胃癌的发病有关.