PCR快速检测沙门菌试剂盒的研制与应用

目的 在优化聚合酶链反应(PCR)检测沙门菌程序的基础上,研制沙门菌PCR检测试剂盒。方法 通过样品检测，确定试剂盒的组成及各种组分对保存期的影响，对PCR和ELISA2种快速检测试剂盒进行比较。结果 该试剂盒能检测出20Pg的沙门菌DNA；在含有Taq酶、未冻干、-20℃的条件下，试剂盒保存期为12个月；以国标法做参照，ELISA试剂盒的敏感性和特异性分别为100％，97.2％．PCR试剂盒的敏感性和特异性均为100％；ELISA和PCR试剂盒的符合率为97．2％；PCR试剂盒检测临床粪便样品150份，检测结果与国标法相符。结论 沙门菌PCR试剂盒具有特异、灵敏、快速等优点，适用于沙门菌快速检测。     

沙门菌属LAMP检测方法在食品卫生检验中的应用评价

目的探讨沙门菌属环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法在食品卫生检验中的应用价值。方法利用文献报道的LAMP检测方法和分离培养法分别对135份食品标本进行沙门菌检测,评价LAMP法和分离培养法的一致性。结果 LAMP方法检出14份食品标本沙门菌阳性,阳性率为10.4%,电泳和加荧光染料染色后均能判断结果;分离培养法检出6份食品标本沙门菌阳性,阳性率为4.4%。LAMP法检出阳性率高于培养法(P=0.021)。LAMP方法可在24 h内从食品中检测出沙门菌,而分离培养法检出沙门菌需要4~7 d,LAMP检测方法更快速。结论沙门菌属LAMP方法检测阳性率高于分离培养法,LAMP方法可用于食品中沙门菌的核酸检测。     

环介导等温扩增（LAMP）技术检测沙门菌属方法的建立

建立一种检测沙门菌属快速敏感的环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）检测方法。针对沙门菌属侵袭蛋白（invA）基因序列的六个区域设计四条LAMP引物，65℃保温约60min，完成对沙门菌属的扩增，扩增产物经电泳和酶切鉴定。利用LAMP和普通PCR方法同时检测4株沙门菌和9株非沙门菌（对照组）来验证LAMP方法的特异性；将肠炎沙门菌菌液做一系列10倍稀释后用LAMP和PCR方法进行检测来比较两者敏感性。4株沙门菌扩增出LAMP特征性梯状条带，9株非沙门菌没有出现LAMP扩增，LAMP产物的特异性通过限制性内切酶得到了证实；LAMP检测沙门菌属的特异性与普通PCR相同，但其敏感性比普通PCR高10倍，LAMP检测沙门菌属的检测下限为10cfu／ml，PCR检测下限为100cfu／ml。LAMP检测速度相比PCR更快速，在60min内即可完成扩增反应。建立了一个快速、特异、敏感的沙门菌属LAMP检测方法。     

从一患儿脑脊液中检出肠炎沙门菌的检测分析

目的脑脊液中病原菌的检测。方法用MiniVIDAS全自动荧光免疫分析系统和按照GB／T4789-2008同时进行检测。结果用MiniVIDAS全自动荧光免疫分析系统和按照GB／T4789—2008检测4份标本和1份菌株，患儿粪便标本中检出沙门菌，从患儿脑脊液中分离出的1份菌株经检测为沙门菌，粪便标本中检出的沙门菌和从患儿脑脊液中分离出的菌株经进一步鉴定均为肠炎沙门菌，不是伤寒沙门菌。结论两种方法检测结果一致，MiniVIDAS全自动荧光免疫分析系统检测快速准确，灵敏度高。在突发性公共卫生事件特别是食物中毒事件中可进行快速病原菌诊断。沙门菌血清型较多，在菌株鉴定中一定要仔细，以免误诊。     

蝎形引物PCR快速检测环境水样中沙门菌方法研究

[目的]以蝎形引物PCR技术为基础建立一套环境水样沙门菌的快速检测方法。[方法]选择沙门菌himA基因设计出以荧光素(FAM)和淬灭物(DABCYL)双标记探针的茎环尾状结构构成蝎形引物，对8种沙门菌和8种非沙门菌经增菌、DNA提取后，以蝎形引物PCR方法进行检测，探讨该检测方法的可行性、特异性和灵敏度，并与普通引物PCR法检测50份环境水样进行比较。[结果]蝎形引物PCR方法检测沙门菌，细菌密度与荧光相对强度存在着量比关系，与普通引物PCR法比较，具有快速、特异、灵敏度高的特点，在50μl PCR及反应体系中最低可检出2cfu沙门菌。[结论]沙门菌蝎形引物在PCR扩增中，探针可特异地与目的DNA片段杂交，使DABCYL不能有效地淬灭FAM产生的荧光，荧光可经仪器直读检出。所建立的快速检测方法可定性或定量的用于环境水样中沙门菌检测。     

食品中沙门菌变性高效液相色谱检测技术的研究与方法建立

目的:应用PCR结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术建立食品中沙门菌的快速检测方法.方法:根据沙门菌fimY基因序列的特点设计特异性引物,PCR扩增的产物经DHPLC技术进行快速检测.以沙门菌等89株参考菌株做特异性检测;沙门菌液体培养物稀释成不同梯度,做灵敏度检测.结果:试验结果表明该方法有很好的特异性,而其它非沙门菌均为阴性.该方法灵敏度较高,检测低限可达到45 cfu/ml.结论:该方法可以快速、准确检测食品中沙门菌,是食品中致病菌检测的新技术和新方法.     

多重实时PCR快速同时检测沙门菌和志贺菌

目的 建立改良分子信标，多重实时PCR同时检测沙门菌和志贺菌的快速方法，应用于食源性致病菌的快速诊断。方法 根据GenBank公布的沙门菌侵袭性基因invA和ssaR基因，分别设计一对引物和改良分子信标探针，用同色荧光标记，用于同体系检测沙门菌。志贺菌根据ipaH基因的保守序列，设计引物和改良分子信标探针，加入沙门菌检测体系中，建立三重实时PCR一改良分子信标检测体系，应用于同时对沙门菌、志贺菌食物中毒的快速诊断和门诊肠道致病菌的检测。结果 改良分子信标一多重实时PCR反应体系DNA灵敏度为69～93fg/μl。菌液灵敏度为32～64CFU／ml或1～2CFu／PCR反应体系，无交叉反应。该反应体系同时检测134株沙门菌和67株志贺菌，均出现特异的荧光信号，两种细菌检测互不干扰。对细菌性食物中毒样本等共1100份同时进行沙门菌和志贺菌检测，569份沙门菌实时PCR阳性，其中551份沙门菌培养阳性；42份志贺菌实时PCR阳性，其中41份志贺菌培养阳性。从样品处理到检测结果仅需时间2h至1d。结论 改良分子信标-多重实时PCR检测体系快速、灵敏度高，特异性强，可用于沙门菌和志贺菌食物中毒的快速诊断，伤寒、痢疾等肠道传染病的初筛及预防医学门诊的健康人群体检，为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。     

复合PCR鉴定沙门菌的方法

沙门菌属于肠杆菌科，是具有鞭毛、能运动的革兰阴性杆菌，而且它是导致食源性疾病的主要病原菌之一。为了加强口岸执法管理、缩短检验检疫流程和提高检验检疫工作效率，本实验拟建立复合聚合酶链反应快速检验鼠伤寒沙门菌的方法，以求提高检验工作准确性和速度。本实验在参考国内外文献的基础上，设计了两对引物，建立了较稳定的PCR检测系统。本实验中，使用了不同的菌株作为比较，证实了系统特异性良好，并且从不同的食品来源检出的沙门菌，皆能被本实验系统鉴定检出。使用复合PCR技术，能快速、准确的鉴定肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌，并且较之经典的鉴定方法，时间上提前了2—3d。     

应用二重PCR对沙门菌属和肠炎沙门菌检测

[目的]建立快速检测肠炎沙门菌的检测方法。[方法]以属特异性引物ST11、ST15和肠炎沙门菌的特异性引物Sefl167、Sef478构建二重PCR反应体系，对样本进行沙门菌属的鉴定同时对肠炎沙门菌进行检测。[结果]实验证明本方法可以准确的对沙门菌属进行鉴定，同时也能比较准确的对肠炎沙门菌进行鉴定。[结论]为沙门菌食物中毒的鉴定提供更加快捷的检测方法。     

食品中沙门菌国家标准检验方法实验室验证及结果分析

目的 实验室验证食品中沙门菌国家标准检验方法的可操作性及可行性.方法 按照国家疾病预防控制中心《食品卫生微生物学检验沙门菌检验》标准验证方案进行.用不同浓度的沙门菌菌悬液人工染菌2类食品共40份,同时用两种增菌液增菌,4种分离培养基分离,对比检出率及分离效果.结果 检出率34.4%,最低检出线为10～2.3 cfu/25 g.结论 该方法使用选择性强、特异性高的分离培养基及快速筛选方法,克服了传统沙门茵检测方法的检测周期较长、所需试剂繁多等缺点.该方法使沙门菌检测具有更好的适用性和可操作性.     

沙门菌传统检测与应用快速检测试剂盒的比较

目的比较二者所用时间,检出限,找出比较好的沙门检测方法。方法分别用传统检测方法和沙门氏菌快速检测试剂盒对几种沙门菌标准菌株进行检测,对两者结果进行比较。结果 OXOID沙门氏菌快速检测试剂盒所用时间比传统检测方法短,但其检出限较传统检测方法高。结论实际工作中为保证工作准确,节省时间,最好应用传统检测方法与快速检测试剂盒相结合。     

荧光定量PCR快速检测沙门菌方法的建立及应用

目的:建立沙门菌实时荧光PCR的快速检测方法,探讨其可行性和应用价值。方法:根据沙门菌的特异性DNA作为靶序列,以沙门菌菌株提取核酸DNA作为模板进行荧光检测。结果:本研究在7种相关菌株的检测中,除沙门菌出现很好的阳性外,其余菌株均为阴性;在纯菌条件下,定量检测低限为30 cfu/ml;同一样品检测3次Ct值的变异系数均小于5%;对模拟标本与分离培养对比,二者符合率为100%。结论:该方法的建立,不仅为食源性沙门菌污染及食物中毒的快速检测提供依据,而且还可直接用于临床粪便标本的检测。     

应用LAMP同时快速检测沙门菌和志贺菌的效果评价

目的探讨环介导等温扩增（LAMP）方法同时快速检测沙门菌和志贺菌的应用价值。方法通过通用增菌培养,应用LAMP方法和分离培养法分别对76份食堂从业人员粪便标本进行沙门菌和志贺菌检测。结果LAMP方法检出1份标本沙门菌阳性,阳性率为1．32％;分离培养法检出1份都柏林沙门菌,阳性率为1．32％;2种方法的检测结果一致。LAMP方法可在3h内检出沙门菌、志贺菌,而分离培养法需要3-5d,鼠伤寒沙门菌LAMP方法的灵敏度为170CFU／ml,福氏志贺菌LAMP方法的灵敏度为190CFU／ml,与常见的食源性致病菌均无交叉反应。结论与分离培养法相比,LAMP方法特异性高,灵敏度高,不需要特殊仪器,能够在简易的实验条件下,快速、简便地同时检测沙门菌和志贺菌,LAMP方法适用于基层疾病控制实验室开展沙门菌和志贺菌的快速筛查检测。     

乳粉中沙门菌检测能力验证分析

目的了解实验室在乳粉中沙门菌检测领域的水平。方法乳粉样品的前处理按照作业指导书要求进行,根据GB4789.4-2016《食品安全国家标准食品微生物检验沙门氏菌检验》进行沙门菌的分离鉴定,优先选用沙门菌属显色培养基为参照,并以VITEK2 COMPACT全自动微生物分析仪对可疑菌落进行鉴定。结果此次能力验证考核结果为NLYZ-SAL-077样品中检出沙门菌,NLYZ-SAL-531样品中未检出沙门菌。结论本次乳粉中沙门菌检测能力验证结果满意,提高了实验室的检测能力,为微生物实验室以后检验工作使用辅助方法的检测提供了参考依据。     

食品中沙门菌实时荧光PCR快速检测方法的研究

目的利用荧光定量PCR技术，建立食品中沙门菌污染的快速敏感特异的检测方法。方法以沙门菌的fimY基因作为靶序列，设计一对引物和探针，以沙门菌菌株提取核酸DNA作为模板，优化引物和探针的浓度比和Mg^2＋浓度，以沙门菌和10种相关细菌考核检测体系的灵敏性、稳定性和特异性，并初步应用于样品的检测。结果本研究建立的反应体系在引物和探针的浓度为0．8μmol／L，1．0μmol／L，Mg^2＋浓度为3mmol／L时，具有良好的特异性和敏感性。在10株相关菌株的检测中，除沙门菌出现很好的阳性外，其余菌株均为阴性。在纯菌条件下，定量检测低限33cfu／ml。稳定性分析表明：同一样品重复检测3次Ct值的变异系数均小于5％。检测样品结果显示实时PCR方法较传统方法敏感、快捷、简便。结论该方法特异性强，稳定性高，操作简便快捷，适应食品微生物检验发展需要，具有较大的推广及应用价值。     

实时荧光PCR法快速分离食源性致病菌

目的建立快速的食源性沙门菌和志贺菌检测方法,以提高对该菌的检验速度和准确性,为公共卫生,食源性致病菌监测,突发性群体性食物中毒事件提供技术支持。方法采用实时荧光PCR法和培养法对40份不同类食品进行沙门菌和志贺菌的检测,并对分离的菌株进行血清分型和定量检测,比较两种方法的特异性,灵敏度,准确性。结果采用实时荧光PCR法检测40份样本,其中8份沙门菌核酸阳性,阳性率20%;采用培养法检测这40份样本,4份样品分离出沙门菌,阳性率10%,且4份样品经核酸检测均为阳性,32份核酸阴性样本采用培养法检测,均未分离到沙门菌和志贺菌。结论实时荧光PCR法结合传统分离培养法适宜食品中沙门菌,志贺菌的快速筛查鉴定及食物中毒等突发事件的快速诊断。     

多重PCR检测食品中的金黄色葡萄球菌、志贺菌和沙门菌

目的建立一种能同时检测食品中金黄色葡萄球菌、志贺菌和沙门菌的多重PCR检测方法。方法采用7.5%NaCl肉汤对食品样品中的金黄色葡萄球菌进行增菌,同时采用GN增菌剂对食品样品中的志贺菌和沙门菌进行增菌。根据金黄色葡萄球菌的nuc基因、志贺菌的ipaH基因、沙门菌的invA基因设计引物,通过多重聚合酶链反应(PCR)反应对食品样品中上述三种病原菌的目标基因进行扩增,同时对反应体系进行优化。结果特异性实验表明本方法的特异性良好。对污染金黄色葡萄球菌、志贺菌和沙门菌的牛奶样品进行检测,检出限为1cfu/ml。结论本实验建立的多重PCR检测方法适用于食品中金黄色葡萄球菌、志贺菌和沙门菌的快速检测,具有快速、简便、灵敏的特点。     

直接酶联免疫吸附法和聚合酶链反应联合检测沙门菌的应用

目的　通过比较试验 ,得到准确、快速的沙门菌检测方法。方法　 2 2 8株沙门菌经过前增菌、选择性增菌后 ,采用在聚合酶链反应 (PCR)和酶联免疫吸附法 (ELISA)同时检测 ,并将 2种快速检测方法进行比较研究。结果　PCR法的敏感性优于直接ELISA法 ,2种方法的检测符合率达 99%以上。直接ELISA结合PCR法对饮食行业工作人员健康检查的 15 4 6份人粪便样品进行检测 ,同时以国家标准方法为参照 ,直接ELISA法的敏感性和特异性达 10 0 %和 97 14 % ,PCR法的敏感性和特异性均为 10 0 %。结论　优化的沙门菌检测程序是对大量样品采用直接ELISA筛检 ,除去大量阴性样品 ,阳性样品用PCR法作进一步鉴定 ;血清型的确定用国家标准方法。     

食品中沙门菌特异性二重聚合酶链反应检测方法的研究

目的建立二重聚合酶链反应(PCR)方法快速检测食品中的沙门菌(Salmonella spp.)。方法以沙门菌特异性基因invA、hilA为靶基因,选择2对引物对16株沙门菌和24株非沙门菌进行扩增,验证二重PCR的特异性。梯度稀释DNA,以不同稀释度的DNA PCR扩增。在猪肉中以不同菌量人工污染,不同增菌时间培养,提取DNA进行PCR扩增。应用该方法检测实际样品。结果以invA、hilA为靶基因的两对引物对沙门菌的检出均有很好的特异性,PCR能检出0.1332pg的沙门菌DNA,人工污染猪肉的检测限为2.5cfu/ml。本研究共检测了53份食品样品,有21份检出了沙门菌。结论建立了适用于肉类、水产品及蛋糕等食品中的沙门菌检测的快速、灵敏、特异的二重PCR方法。