灭菌处理牛心包制备脱细胞支架的内皮化

文题释义：组织工程：主要研究种子细胞、生物材料、构建组织和器官4个方向,其核心是建立由细胞和生物材料构成的三维空间复合体,对病损组织进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替代,具有良好的发展前景和广阔的应用市场。牛心包脱细胞支架：经化学和物理方法去除牛心包中的细胞,形成无免疫原性或低免疫原性材料,构建组织工程支架。 背景：组织工程学研究常用的动物组织不可避免地存在各种微生物附着,而无菌是组织工程材料临床应用的一项基本要求。 目的：观察体积分数75%乙醇灭菌对牛心包性能及生物相容性的影响。方法：将牛心包组织分别用无菌PBS(对照组)、含1%抗生素(青霉素/链霉素/两性霉素B溶液)的PBS、氯己定及体积分数75%乙醇进行灭菌处理。采用LB固体培养基评价4种方法的杀菌效果;采用VB染色评估4组处理对牛心包组织结构的影响;通过CCK-8实验测定4种处理抽提液的细胞毒性。将体积分数75%乙醇灭菌处理的牛心包制作为脱细胞支架,与人脐静脉内皮细胞共培养,观察细胞的黏附与内皮化效果。结果与结论：①体积分数75%乙醇和氯己定处理24 h的牛心包满足完全灭菌的要求,1%抗生素处理组和对照组可见明显菌落形成;②VB染色显示,体积分数75%乙醇、氯己定和1%抗生素处理的牛心包胶原纤维呈波浪状排列整齐,结构紧凑,弹性纤维含量较少但结构清晰;③体积分数75%乙醇灭菌处理的牛心包不影响L929细胞的增殖活性,培养1-3 d内的细胞存活率均在100%以上;氯己定灭菌处理的牛心包有很强的细胞毒性,导致细胞死亡;④人脐静脉内皮细胞可在脱细胞支架表面正常生长与黏附;在20 d的种植期内,第8-12天脱细胞支架表面黏附的细胞最多;⑤结果说明,体积分数75%乙醇能够有效消灭附着在牛心包上的所有微生物,不会影响牛心包的组织学完整性与生物相容性。ORCID: 0000-0002-3448-8230(刘飞) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料;骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性;组织工程     

一种体外流动钙化模型的建立

目的 构建一种基于模拟生理流体环境、且可便捷、高效反映心血管植入物钙化特性的体外测试模型,为心血管植入物的快速开发提供新的手段.方法 选择新鲜牦牛牛心包(青海裕泰畜产品有限公司,中国);选择3周龄Wistar雄性幼鼠5只,体质量(50±5)g.采用常规戊二醛(GA)与处理牛心包交联方法,制备GA交联的牛心包材料(Yak...     

不同处理方法的牛心包生物力学特性测试分析

目的　探索一种理想的牛心包处理方法。方法　观察戊二醛及 2 ,3 -丁二醇改性戊二醛处理后的牛心包热挛缩温度、生物力学特性及超微结构变化。结果　鞣制后心包厚度和僵硬度增加 ,柔韧性降低。丁二醇组的弹性模量 (8.75± 1 .71 )较戊二醛组 (6.5 9± 1 .3 7) (P <0 .0 5 )更近似于正常瓣膜组织 ;且其极限拉伸强度优于戊二醛组。超微结构显示丁二醇组胶原纤维与弹性纤维结构完整 ;戊二醛组胶原纤维和弹性纤维均明显变性 ,结构模糊。结论　 2 ,3 -丁二醇改性处理后的牛心包具有更好的生物力学特性 ,该方法是一种较为理想的牛心包处理方法     

粘附蛋白在环氧交联牛心包材料体外内皮化中作用的实验研究

为研究生物材料体外内皮化的最佳条件 ,我们作了血管内皮细胞 (EC)在PC牛心包材料上生长特性的研究。方法为环氧交联 (PC)牛心包材料 ,漂洗后用 3种不同的粘附蛋白预衣被 ,种植犬的血管EC ,未衣被组作为对照。结果表明 :Fibronectin(FN)及Laminin(La)组 ,经 710d培养 ,片上EC形成单层 ,而未衣被组及CollagenI(CL I)组PC心包片上无细胞生长。结论 :(1)PC牛心包材料的确具有细胞毒性 ;(2 )La及FN具有拮抗PC细胞毒性的作用 ;3)经La及FN的衣被 ,PC牛心包生物材料达到了体外内皮化的要求 ,其中以La效果最佳 ,与FN相比 ,两者有显著性差异 (P <0 0 5 )。粘附蛋白CL I在本实验中没有发挥其促EC粘附及生长作用。     

用六次甲基二异氰酸酯(HDI)作为牦牛心包材料交联剂的探索实验

为寻求一种优于戊二醛(GA)的新型生物瓣膜材料交联剂,作者从可行性探索的角度,用气态六次甲基二异氰酸酯(HDI)处理川西牦牛心包材料。通过对心包材料的收缩温度(T_s)和氮基酸组成的测定,对气态HDI与心包胶原组织的反应作了初步分析。此外还评价了材料的生物相容性和缓钙化性能,测定了材料的力学性能。实验结果表明:HDI可以作为心包材料的交联剂,但必须防止HDI与心包作用的同时,也与心包中含有的水份反应。经HDI处理的牦牛心包材料具有良好的生物相容性和力学性能。与戊二醛处理的牦牛心包材料相比,其缓钙化能力有所提高,证明HDI有可能成为一种生物瓣膜材料的交联剂。     

牛心包液氮冷冻减薄后性能研究

本文研究了牛心包液氮冷冻并减薄后的性能变化,并与猪心包进行了对比。采用苏木精-伊红(HE)染色的方法进行组织学微结构观察,并通过拉伸试验评价了冷冻和减薄对心包力学性能的影响,组织学观察和力学性能评价均采用猪心包作为对照。结果表明牛心包在液氮冷冻后性能未见区别;冷冻减薄后,割线模量和极限强度与猪心包基本相当,弹性模量略高于猪心包。研究表明,牛心包减薄容易获得理想的厚度和预期的性能,其可作为经导管瓣膜瓣叶材料的一种选择。     

不同化学方法改性的牛心包体外降解规律的研究

牛心包材料是一种以胶原蛋白为主要成分的天然生物材料。为了研究牛心包作为组织工程材料的可能，本实验通过采用失重法、蛋白质检测法及氨基酸测定法定量地研究和对比了几种不同改性方法处理过的牛心包的体外降解规律，力求找到一种改性方法使材料既有可控的降解性，又有较小的抗原性，以使牛心包成为一种良好的可降解性GTR材料。研究结果显示，用乙醇封端处理的心包相对于戊二醛及环氧交联处理的心包，在降解性方面更易满足可降解GTR材料的要求。蛋白质检测法及氨基酸测定法也为以后建立控制心包降解速率的数学模型奠定了良好基础。     

一种新的生物瓣材料——Ⅳ、牦牛心包纤维组织的编织形态及其一维拉伸性能

本文用H.E.染色观察胶原纤维束的编织形态,用Weigert染液染色观察弹性朊的分布与走向,以获得与材料力学性能有关的结构信息。实验结果表明: (1)牦牛心包与Edwards公司的黄牛心包片的纤维组织编织形态相似。不同点仅前者的弹性朊纤维比后者稍细但较密,前者的胶原纤维束多波纹但稍疏松; (2)牦牛心包由20多层的纤维编织层组成。各层以不同角度交错叠盖,层与层间由各层分出的胶原纤维束和弹性朊纤维将毗邻纤维层连接起来。各纤维层的厚度不等,约为60～100μ。 (3)牦牛心包为似多层层板,由非蛋白纤维的基质与蛋白纤维编织层组成。其应力—应变曲线随试样裁取的方向不同而异,即牦牛心包系天然的各向异性层板。     

牛心包脱细胞支架的制备研究

组织工程支架材料是构建组织工程器官或组织的重要基础,天然脱细胞基质由于具有其优良特性而成为理想的支架材料。本研究采用胰酶去污剂法、冻融去污剂24 h法、冻融去污剂48 h法、冻融核酸酶法和去污剂核酸酶法等5种方法对牛心包组织进行脱细胞处理。通过HE染色、扫描电镜观察、含水量检测、力学检测、DNA含量检测和细胞毒性试验,判断不同脱细胞方法的脱细胞效果及其对牛心包基质的影响,从而筛选出对牛心包进行脱细胞的最佳方法。结果显示冻融后去污剂24 h法可以完全脱除牛心包的细胞成分,同时细胞外基质和力学特性保持完好,细胞毒性低,且经济实惠,是制备牛心包脱细胞支架的较好方法。     

牛心包脱细胞处理后免疫原性的研究

牛心包用0.5%胰蛋白酶处理3 h,探讨其作为组织工程心脏瓣膜支架材料的可行性。大鼠被分成新鲜牛心包组、脱细胞处理牛心包组、空白对照组三组,分别测定其血清中产生的特异性抗牛心包抗体IgG的OD值,结果发现IgG含量在术后7 d三组间比较无统计学意义(P>0.05),其余各时点间比较差异有显著性(P<0.05),在相应时点新鲜牛心包产生的IgG值比脱细胞处理的牛心包高,且新鲜牛心包产生的IgG值在术后2月达峰值,而脱细胞处理牛心包产生的IgG在术后1月达峰值。组织学观察发现脱细胞处理后牛心包完全清除了细胞成分,纤维网架结构轻度松散,但基本保持完整。结果表明,这种脱细胞方法能完全清除牛心包上的细胞成分,降低免疫原性。     

一种新型的生物瓣材料—Ⅹ.牦牛心包中部分酶的组织化学观察

本文通过对九只(3～9岁)正常牦牛心包的心前区进行光镜酶组织观察,得知:(1)3～9岁牦牛心包的超微结构有差异,但酶的活性与年龄无关;(2)除AKP酶外,其余14种酶的活性一般规律是,问皮细胞的活性大于纤维细胞的活性;(3)间皮细胞和纤维细胞的代谢特点以糖酵解为主。     

原花青素交联牛心包材料的研究

本研究针对天然交联剂原花青素处理牛心包材料的性能进行研究.采用原花青素交联牛心包组织,制备人工生物心脏瓣膜材料,并对其交联特性、力学特性、抗酶降解性能、亲疏水性能、细胞毒性试验以及溶血试验等进行分析.结果显示:原花青素或戊二醛处理的牛心包组织变性温度、力学特性、表面亲水性能和抗酶降解能力都明显提高;与传统交联剂戊二醛相比组织稳定性、亲水性能和抗酶降解能力未见显著性差异,但是最大断裂强度显著提高(原花青素交联组织最大断裂强度(13.863 0 MPa)明显高于戊二醛交联组织(10.784 2 MPa);溶血试验结果表明原花青素处理固定组织的溶血率(2.61%)远低于戊二醛处理的组织(12.54%);细胞毒性试验结果表明原花青素交联组织在1、3、5 d的细胞增殖率分别为76.19%、88.96%、100.12%,而戊二醛在相同的时间点的细胞增殖率分别为63.15%、57.28%、48.74%.原花青素交联的瓣膜材料组织结构稳定、亲水性好、毒性小且能维持较好的力学性能,作为人工生物瓣膜材料具有很好的研究前景.     

牦牛心包的化学改性及其防钙化能力的研究

本文用川西牦牛心包为原料,初步分析了牦牛心包组织的主要成分。通过对牦牛心包组织中胶原的化学改性,用大白鼠为钙化实验动物,研究了经戊二醛固定后牦牛心包组织中胶原的羧基和氨基与组织钙化的关系。实验结果表明,增加组织中胶原的羧基含量,可加速组织在动物体内的钙化;减少羧基含量,则可降低组织的钙化,而氨基对组织钙化是乎没有影响。TEM研究结果,说明胶原是导致牦牛心包组织钙化的主要成分之一。X-衍射分析钙化的牦牛心包组织,说明组织在大白鼠体内的钙化与生物瓣在人体内钙化的形式相同,均是以Ca_(10)(PO_4)_6(OH)_2的形式沉着于组织中。此外还用EDAX,组织学,SEM等方法研究了牦牛心包组织在动物体内的钙化情况。     

牦牛与迁饲黄牛及低海拔黄牛肺动脉干及肺组织形态的比较

目的:对牦牛和迁饲黄牛及低海拔黄牛肺动脉干与肺组织形态进行比较研究,获得高原土生或迁饲动物慢性低氧时适应进化的模式。方法:采集青海地区海拔3000~4000m的牦牛、2500 m的高山迁饲黄牛及甘肃平凉1300 m的低海拔黄牛的肺动脉干及肺组织,固定、切片、染色后行光镜和电镜比较观察。结果:55%的迁饲黄牛和98%牦牛肺动脉干中膜以弹性纤维及胶原纤维为主,而45%的迁饲黄牛和100%低海拔黄牛以弹性纤维及平滑肌增多为主,且平滑肌增多成团分布。牦牛和迁饲黄牛肺浆膜结构致密,间皮下以弹性纤维为主,而低海拔黄牛肺浆膜结构疏松,间皮下以胶原纤维为主。相比于迁饲黄牛,牦牛和低海拔黄牛肺终末细支气管黏膜纵行皱襞更明显,牦牛肺呼吸性细支气管黏膜上皮为单层或假复层柱状上皮,多数细胞可见到纤毛,并且黏膜仍有皱襞形成;而黄牛主要为单层柱状上皮,部分细胞可见纤毛。迁饲黄牛肺内小动脉血管壁和微动脉管壁厚度增加,与牦牛及低海拔黄牛比较差异有统计学意义。结论:牦牛肺动脉干和肺组织形态与结构有适应高原的独特形式,迁饲黄牛在适应高原时发生了与牦牛一样的趋同性改变,同时又兼具低海拔黄牛的特点。     

环氧改性与戊二醛处理的牦牛心包的扫描电镜形态比较

作者将环氧改性与戊二醇固定的牦牛心包缝制成血管，然后缝合在成年家犬颈动脉上．４个月后，取出材料，作扫描电镜观察，比较两者的形态学变化，并将未被植人的牦牛心包作同步电镜观察．结果表明，环氧改性的牦牛心包更为完整，其浆膜层脱落程度小，更为光滑，胶原纤维的走向更富弹性和抗张强度。植入体内后，环氧改性的牦牛心包撕裂程度明显较低．说明环氧改性的牦牛心包的力学性能明显优于戊二醛固定的牦牛心包，材料的力学性能是由胶原纤维的走向决定的。     

酒精对戊二醛固定牛心包影响的实验研究

目的探讨酒精处理对戊二醛固定牛心包体内钙化和力学性能的影响。方法牛心包经戊二醛固定后,再用酒精处理,未经酒精处理组作为对照组。将两组牛心包埋植于大鼠皮下,分别于3周和2个月后取出,然后通过原子吸收光谱法和VonKossa钙染色评估两组牛心包钙含量变化。进行力学性能测试和热皱缩温度测定评估两组牛心包的物理性能。结果组织学检查显示酒精再处理对牛心包胶原纤维结构无明显破坏;大鼠皮下埋植实验显示酒精再处理能显著抑制戊二醛固定牛心包的钙化,3周时酒精再处理的戊二醛固定牛心包组钙含量是(1.08±0.30)mg/g,酒精未处理组钙含量是(24.55±7.16)mg/g;2个月时酒精再处理戊二醛固定牛心包组钙含量是(1.20±0.43)mg/g,酒精未处理组钙含量是(120.22±37.36)mg/g,差异有统计学意义;酒精再处理后牛心包的断裂伸长率增大,抗拉负荷增大,但抗拉强度改变无统计学意义;酒精再处理后牛心包的热皱缩温度下降。结论酒精处理戊二醛固定的牛心包动物体内实验显示有显著的抗钙化作用,并且具有良好的力学性能。     

牛心包瓣性能的综合改进（Ⅲ）：醛处理对牛心包钙化的影响

本文观察了不同浓度戊二醛、甲醛处理对牛心包理化性能的影响。牛心包的收缩温度随着戊二醛或甲醛浓度的增高而提高。而抗拉强度在76～85℃收缩温度范围内,并没有随着收缩温度的提高而增强。随着收缩温度的提高,牛心包的抗蛋白酶水解性能有所增强。随着经甲醛溶液浸泡的牛心包收缩温度的提高,牛心包的钙化越趋严重。而经戊二醛溶液浸泡的牛心包,随着收缩温度的提高,其钙化有所减轻。     

生物瓣钙化机理初探

本文研究了三价金属离子AL~(3+)及Cr~(3+)对生物瓣原材料牛心包的作用.通过材料处理前后热收缩温度Ts的变化,指出AL~(3+)及Cr~(3+)处理材料可引起胶原分子间产生交联作用.指出了羧基在牛心包钙化中所起的重要作用,提出了新的牛心包材料钙化机理,利用该机理能较为圆满地解释前人的实验结果.为探索和找出有效的生物辦防钙化措施指出一条途径.     

组织工程牛心包补片在法洛四联症分期矫治中的应用

背景：行法洛四联症矫治手术时,对右室流出道狭窄较严重的病例,常需要行右室流出道补片加宽成形,目前采用的加宽材料有生物补片及人造织物补片等。 目的：比较涤纶人造血管片和组织工程牛心包补片在法洛四联症分期矫治手术中加宽右室流出道的早期临床效果。 方法：25例已行一期分流手术后再行二期心内矫治的法洛四联症患者,按照不同的二期手术时间分为两组：2007年4月至2010年7月接受二期手术的14例患者以涤纶人造血管片加宽右室流出道;2010年8月至2011年9月接受二期手术的11例患者,采用商品化的组织工程牛心包补片加宽右室流出道。比较两组术后早期的临床效果。 结果与结论：25例患者中,仅涤纶人造血管片组术后死亡1例,术后开胸止血1例,所有均未出现免疫排斥反应和毒性反应。组织工程牛心包补片组术后呼吸机使用时间、体外循环稳定后测量的右心室与左心室收缩压比值、右心室流出道压差、心包腔引流量、术后ICU治疗时间和术后住院天数均少于涤纶人造血管片组(P < 0.05)。说明采用组织工程牛心包补片加宽右室流出道的患者术后恢复较采用涤纶人造血管片的患者快,右室流出道疏通效果好,提示组织工程牛心包补片是法洛四联症患者分期矫治手术中加宽右室流出道的一种较理想材料。     

不同方法处理的牛心包生物相容性和钙化结果分析

目的 观察脱细胞处理对牛心包体内生物相容性及钙化的影响并与戊二醛处理的牛心包进行比较；材料和方法对新鲜牛心包随机分为三组，A、戊二醛处理组：新鲜牛心包采用0．5％的戊二醛进行处理；B、新鲜牛心包组：新鲜牛心包保存于四联抗生素液中；C、脱细胞组：新鲜牛心包酶．去污剂联合脱细胞后保存于四联抗生素液中。上述处理后的牛心包经细菌培养，显示无细菌生长后，植入雄性昆明小鼠皮下三周观察炎性浸润及钙化情况。采用von Kossa钙染色检查进行定性分析；原子吸收光谱检查进行钙含量定量分析。同时体外对三组牛心包进行力学和热皱缩温度进行测试。结果 三组间炎性浸润程度明显不同，0．5％的戊二醛处理组钙化程度明显增高，每克干重牛心包平均含钙量71．2mg，较其他两组有明显差异（P〈0．001），新鲜牛心包组（平均2．12mg／g干重）和脱细胞组（1．41mg／g干重）间钙化程度方面亦有显著统计学意义（P〈0．001）。组织学钙染色光镜下检查显示三组间黑色颗粒有明显差异，支持三组间钙含量定量结果的差异。戊二醛处理组的力学性能与优于新鲜组和脱细胞处理组，热皱缩温度高于新鲜组和脱细胞处理组。结论 新鲜牛心包脱细胞处理后钙化显著降低，免疫源性降低，有很好的生物相容性。