AdPPO4基因部分序列的cDNA克隆与序列分析

目的克隆大劣按蚊(An dirus)前酚氧化酶(prophenoloxidase,PPO)基因部分序列.方法根据已报道的多种昆虫以及冈比亚按蚊PPO基因编码的保守氨基酸序列设计简并引物,以大劣按蚊幼虫总RNA为模板进行RT-PCR扩增,目的片段经TA克隆后测定其核苷酸序列,然后进行序列查询与比对.结果从大劣按蚊幼虫中获得的PPO4基因(AdPPO4)部分序列长597 bp,编码199个氨基酸;AdPPO4与冈比亚按蚊PPO4基因的核酸和氨基酸序列同源性分别达84%和90%.结论从大劣按蚊幼虫中成功地克隆出了AdPPO4基因的部分序列,与冈比亚按蚊PPO4基因具有很高的同源性.     

大劣按蚊TEP1 cDNA的克隆和生物信息学分析

目的 克隆大劣按蚊(Anopheles dirus)含硫酯键蛋白1(thioester-containing protein 1,TEP1)的cDNA,并分析其序列.方法 根据已报道的冈比亚按蚊等多种昆虫的TEP1氨基酸保守序列设计简并引物,以大劣按蚊血淋巴细胞总RNA为模板,进行RT-PCR扩增.对目的 片段纯化回收,经TA克隆后测定其核苷酸序列.利用DNASIS程序分析该序列,并推导其氨基酸序列,最后利用BLAST和DNASIS等进行不同昆虫TEP1氨基酸序列的比对.结果 RT-PCR扩增出一约770 bp的条带,TA克降后DNA测序发现,阳性克隆的核苷酸序列长774 bp,推导其氨基酸序列长258 aa.生物信息学分析表明,该序列与冈比亚按蚊、阿拉伯按蚊、斯氏按蚊TEP1基因的氨基酸序列同源性分别达72%、72%和59%,与冈比亚按蚊的TEP4氨基酸序列同源性为59%.结论 从大劣按蚊血淋巴细胞中成功克隆出了TEP1的cDNA部分序列.     

大劣按蚊成蚊cDNA文库的构建与质量鉴定

目的　构建大劣按蚊成蚊cDNA文库 ,为进一步筛选、克隆按蚊免疫及疟原虫发育相关基因奠定基础。方法　分离大劣按蚊成蚊mRNA ,用Stratagene公司的ZAPExpress文库构建试剂盒构建cDNA文库并鉴定其质量。结果　所建文库滴度达 2 1× 10 6pfu/ml,重组效率达 98%以上 ,插入片段长度平均为 1kb以上。结论　采用ZAPExpress文库构建试剂盒可以成功构建出较高质量的大劣按蚊成蚊cDNA文库     

约氏疟原虫感染斯氏按蚊与大劣按蚊前后中肠前酚氧化酶的变化

目的比较分析约氏疟原虫感染斯氏按蚊与大劣按蚊前后中肠前酚氧化酶(prophenoloxidase,PPO)的分布及其变化,探讨中肠PPO与按蚊抗疟原虫感染免疫防御反应的关系.方法解剖分离约氏疟原虫感染前和感染后3、5、7、11和15 d斯氏按蚊与大劣按蚊的中肠.利用烟草天蛾PPO抗体分别进行免疫组化染色和免疫印迹分析.结果斯氏按蚊与大劣按蚊在未感染约氏疟原虫前的中肠循环管道内均已存在PPO,而感染后循环管道内的PPO扩散到中肠组织间隙并聚集成片状、块状或条索状,大劣按蚊中肠PPO的聚集程度大于斯氏按蚊;在感染前和感染后不同时期免疫印迹均可检测到斯氏按蚊与大劣按蚊中肠PPO蛋白带,分子量约为67×103,感染后的PPO蛋白带型比感染前明显增强,而且大劣按蚊中肠PPO蛋白带型比斯氏按蚊尤为明显.结论约氏疟原虫感染前按蚊中肠循环管道内存在的PPO可能是经与血淋巴相通的循环管道扩散而来,感染后导致的中肠内PPO不同分布及其变化可能与疟原虫感染按蚊密切相关,并可能具有重要的生理学意义以及与激活按蚊抗疟原虫感染的免疫防御反应相关.     

罗葵地区大劣按蚊成蚊调查

大劣按蚊是海南省山林及山麓地区的主要传疟媒介，１９９１年６月－１９９２年６月，连续１３个月在保葶县罗葵地区什故村对大劣按蚊成蚊进行了调查，发现当地大劣按蚊构成比为６０％（２０７／３４５），４、５、６、７、８月份均有，５月为密度高峰；平均密度为２．４只／人工小时；半通宵观察平均叮人率为２．９６；经产蚊比率为０．６４６，日存活率为０．８８；预期寿命为７．８天；恶性疟原虫孢子增殖需要１１．３天；传染性蚊     

海南省大劣按蚊蚊体微量元素的测定

应用等离子原子发射光谱分析技术分析了大劣按蚊初羽化以及饲血后０天，５天，１０天５天不同生长时期９种元素。结果表明，大劣按蚊蚊体中元素的含量随蚊虫的发育而明显变化，并随其不同生长期而有明显肖长趋势，具有非常明显的差异。     

大劣按蚊卵黄蛋白原cDNA的克隆及转录水平研究

目的克隆大劣按蚊卵黄蛋白原c DNA,进行序列分析,并研究该基因在不同蚊期的转录水平变化。方法首先提取大劣按蚊总RNA,反转录成c DNA;然后设计昆虫卵黄蛋白原简并引物,以该c DNA为模板进行PCR扩增和测序,对所获取的序列进行生物信息学分析;最后利用实时荧光定量PCR方法检测卵黄蛋白原基因在蚊卵、幼虫、蛹和成蚊各时期的转录水平变化。结果 PCR成功扩增出了清晰的单一目的条带,经测序为一段1 071 bp的序列,BLAST比对分析显示该序列与浅色按蚊、库态按蚊和斯氏按蚊的卵黄蛋白基因同源性高达90%,与冈比亚按蚊、微小按蚊和美彩按蚊的同源性达89%。对大劣按蚊各时期卵黄蛋白原转录水平的研究结果显示,4 d龄按蚊卵黄蛋白原m RNA水平是3 d龄按蚊的15.2倍,而吸血后卵黄蛋白原m RNA水平高效上调,是未吸血组的955.7倍(P0.01);吸血组6 d龄按蚊卵黄蛋白原m RNA表达较吸血组4 d龄按蚊骤降(下降近1 870倍),而与未吸血组6 d龄按蚊相比,差异无统计学意义。结论本研究成功地克隆了大劣按蚊卵黄蛋白原基因的c DNA;大劣按蚊血餐后24 h卵黄蛋白原基因高效表达,提示卵黄蛋白原基因可能参与了大劣按蚊蚊卵的发育。     

大劣按蚊血淋巴酚氧化酶与约氏疟原虫卵囊黑化关系的研究

目的：探讨大劣按蚊血淋巴酚氧化酶（PO）与约氏疟原虫卵囊黑化的关系。方法：以大劣按蚊/约氏疟原虫模型，利用聚丙酰凝胶电泳后的酶底物显色法，比较、分析血餐后5、7、11、15d时不吸血组、吸正常血组和感染组3组的雌大劣按蚊血淋巴酚氧化酶的单酚氧化酶（MPO）和双酚氧化酶（o-DPO)活性；同时观察感染组约氏疟原虫的感染度及其卵囊黑化比率。结果：感染组的血淋巴MPO和o-DPO酶活性明显高于不吸血组和吸正常血组（P＜0.05)；但是随着约氏疟原虫卵囊黑化比率的增高，感染组血淋巴MPO和o-DPO活性逐渐下降。另外，吸正常血组的MPO和o-DPO酶活性明显高于不吸血组（P＜0.05)。结论：吸血和约氏疟原虫的感染均能激活大劣按蚊前酚氧化酶级联反应，而大劣按蚊血淋巴酚氧化酶可能在大劣按蚊对黑化约氏疟原虫卵囊中发挥重要作用。     

大劣按蚊丝氨酸蛋白酶AdSP3的组织定位和定量研究

目的 对大劣按蚊丝氨酸蛋白酶3(AdSP3)的表达进行组织定位和定量研究.方法 首先利用RT-PCR方法对大劣按蚊血淋巴细胞、唾液腺和蚊胃进行AdSP3的扩增,然后利用Realtime PCR对大劣按蚊感染约氏疟原虫后不同时相点的血淋巴细胞AdSP3表达水平进行定量研究.结果 从血淋巴细胞和唾液腺均成功扩增出目的片段;...     

吸血和约氏疟原虫感染对AdPPOs基因家族转录水平的影响

目的观察血餐和约氏疟原虫感染对AdPPO1、AdPPO2和AdPPO3基因转录水平的影响.方法同批3～5 d龄大劣按蚊分为不吸血组(N)、吸正常血组(NB)和吸感染血组(IB),在血餐后24 h分别制备各组蚊总RNA,所有样品进行RT-PCR后,各吸取10 μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,凝胶图像分析系统扫描并读取数据,并对所得数据进行统计学处理.结果与不吸血组比较,吸血组和感染组AdPPO1的转录水平显著下降(P<0.05),但吸血组和感染组间没有显著性差异(P>0.05).吸血组AdPPO2的转录则明显上调(P<0.05),但与感染组间没有显著性差异(P>0.05);AdPPO3基因的转录水平在3组间均没有显著性差别(P>0.05).结论血餐明显抑制AdPPO1基因的转录,但明显上调AdPPO2基因的转录水平;约氏疟原虫感染后24 h,AdPPO1,AdPPO2和AdPPO3基因的转录水平均不受影响.     

大劣按蚊化学不育防制实验研究

用200p■p■m 六磷胺(Hempa)水溶液浸泡Ⅳ龄大劣按蚊幼虫,取24小时后雄性蛹,在两个实验地区的孳生地或附近定点羽化释放,三批共释放不育雄蚊15,482只,结果证明先以223杀虫剂先行喷洒后再释放不育雄蚊的效果较单纯释放不育雄蚊为优,有10.8%的捕获雌蚊所产的卵完全不育,平均卵的孵化率从释放前的84.8%下降为26.2%,与对照组比较,x~2检验差异有显著意义(x~2=10.70 p>0.05)。两个实验点均未发生新发病例。     

大劣按蚊与烟草天蛾丝氨酸蛋白酶的交叉免疫活性

目的 探讨大劣按蚊与烟草天蛾丝氨酸蛋白酶之间是否存在交叉免疫反应性.方法 首先利用生物信息学方法分析不同昆虫间丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列的保守性,尤其是大劣按蚊与烟草天蛾间丝氨酸蛋白酶的序列相似性;然后,PinPoint Xa-1表达载体对大劣按蚊丝氨酸蛋白酶进行体外原核表达,利用Western blot方法检测表达产物与烟草天蛾丝氨酸蛋白酶抗血清之间的免疫反应性.结果 生物信息学分析结果显示,不同昆虫间(包括大劣按蚊与烟草天蛾)丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列具有较高保守性;成功进行了大劣按蚊丝氨酸蛋白酶的体外原核表达,western blot结果显示,烟草天蛾丝氨酸蛋白酶抗血清能够能够识别表达产物.结论 大劣按蚊与烟草天蛾丝氨酸蛋白酶具有交叉免疫活性,利用烟草天蛾丝氨酸蛋白酶抗血清研究大劣按蚊丝氨酸蛋白酶是可行的.这将为下一步从蛋白水平研究大劣按蚊丝氨酸蛋白酶的生物学特性奠定基础.     

The Establishment of Natural Mating Colony for Anopheles dirus in Laboratory Conditions

This paper is to report the experience of establishing a natural matingcolony of A.dirus with-two different sized cages in laboratory conditions.In the large cage of 50×50×100cm in size,the mosquito colonyhas been propagated to the 42nd generation,and the natural mating ratewas stablized around 80% with a highest rate of 90.63%.In the small cageof 31×20×22cm in size,the mosquito colony,which was transferredfrom the 15th generation of the large cage colony,has been propagated tothe 28th generation,and the natural mating rate of the 14th generationreached 68.96% and the highest mating rate reached 80.36%.We havesatisfactorily accomplished the task to continue the natural mating colonyof A.dirus in the small cages as well as in the large cage,     

与大劣按蚊先天免疫相关丝氨酸蛋白酶的克隆及分析

目的克隆及分析与先天免疫相关的大劣按蚊差异基因。方法利用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)方法克隆大劣按蚊差异基因,并对与先天免疫相关的差异基因(文中命名为T6基因)进行生物信息学分析及半定量实验,分析约氏疟原虫感染前后其转录的变化,探讨它与按蚊抗疟原虫感染的先天免疫反应的关系。结果目前克隆的差异基因包含以下几类:①与先天免疫相关的酶类;②与能量代谢有关的酶;③与信号传递和调节有关的因子。对与先天免疫相关的分子进行的半定量实验表明,大劣按蚊T6基因的转录与感染疟原虫相关。结论本研究成功地克隆了与先天免疫相关的大劣按蚊差异基因,进一步的实验分析提示该基因可能与按蚊抗约氏疟原虫感染的黑化反应相关。