CD44反义寡核苷酸对肿瘤细胞表面抗原和对CD3AK杀伤敏感性的调节作用

目的：观察CD44反义寡核苷酸调节人低分化黏液腺胃癌MCC80-3细胞Fas分子和凋亡抵抗基因bcl-2的表达水平，提高免疫效应细胞杀伤敏感性的作用和机制。方法：RT-PCR法检测CD44、bcl-2mRNA的表达水平。MTT法检测CD3AK杀伤活性。流式细胞术检测细胞表面CD44及Fas、FasL蛋白表达水平。结果：CD44反义寡核苷酸（1.6μmol／L）处理后，明显地抑制MGC80-3细胞CD44mRNA和蛋白表达水平，在CD44配体低分子量透明质酸（HA）存在下，使MCC80-3表面下调的Fas分子显著增高，表达率从6．69％提高到16．81％（P〈0．01）。CD3AK对反义寡核苷酸处理的MGC80-3细胞杀伤活性显著增高，并呈效靶比依赖效应（P〈0．01）。MGC80-3细胞bcl-2mRNA的相对表达定量值由1．06降至0．32。结论：CD44反义寡核苷酸可通过抑制MGC80-3细胞CD44mRNA和蛋白表达，上调Fas分子的表达，下调凋亡抵抗基因bcl-2的表达，并提高其对免疫效应细胞的杀伤敏感性。     

异体CD3AK细胞对白血病细胞的体外杀伤作用

肿瘤生物治疗是近年来肿瘤治疗中的重要进展之一 ,有关免疫效应细胞在自体造血干细胞的体外净化中的应用也引起了国内外学者的兴趣。我们观察了ＣＤ3ＡＫ细胞对残留ＣＭＬ细胞系及原代白血病细胞的体外杀伤作用 ,以期ＣＤ3ＡＫ细胞应用于自体移植体外净化。材料与方法材料 :正常人外周血由健康志愿男性提供 ;ＣＭＬ患者骨髓由东南大学附属中大医院血液科提供。ＣＤ3ＡＫ细胞的制备 :取正常人肝素抗凝全血10ｍｌ,常规分离单个核细胞 ,调整浓度为 10 6 ｍｌ,加入包被有 3μｇＣＤ3单抗的 2 4孔板中 ,加入 2 0 0Ｕ ｍｌＩＬ 2 ,每 2～ 3ｄ换液 …     

CD3AK细胞的研究进展

ＣＤ３ＡＫ细胞是ＣＤ３单抗起始激活的杀伤细胞，不同的诱导方法可导致两种不同的细胞亚类，即ＣＤ３ＡＫ＾＋和ＣＤ３ＡＫ＾－，前者介导ＰＫＣ非依赖性快溶解细胞毒作用；后者介导ＰＫＣ依赖性慢溶解胞毒作用，本文归纳了在两种ＣＤ３ＡＫ细胞的诱导过程中，单核巨噬细胞，各种细胞因子以及谷胱苷肽等因素对其活化增殖，细胞毒活性的免疫调节作用。     

肿瘤患者自体CD3AK与LAK细胞生物学特性研究

目的：ＣＤ３ＡＫ细胞是由抗ＣＤ３单克隆抗体和ＩＬ－２共同激活诱导的肿瘤杀伤细胞。对３０例肿瘤患者自体ＤＣ３ＡＫ细胞及ＬＡＫ细胞进行了比较性研究。方法：采用ＭＴＴ法检测ＣＤ３ＡＫ细胞及ＬＡＫ细胞的杀瘤活性,应用流工细胞术进行免疫标志物分析。结果与结论：肿瘤患者ＰＢＭＮＣ诱导后产生的ＣＤ３ＡＫ细胞较ＬＡＫ细胞有更强的增殖能力,但对Ｒａｊｉ、Ｋ５６２细胞的生长抑制作用无明显区别;４０％～６０％ＣＤ３ＡＫ     

B7-H1阻断对CD3AK细胞体外生物学活性的影响

目的: 探讨B7-H1阻断对CD3AK细胞增殖活化及其抗肿瘤免疫效应的影响.方法: 利用CD3单克隆抗体(mAb)刺激健康人外周血淋巴细胞诱导产生CD3AK细胞,然后利用B7-H1阻断型抗体阻断B7-H1通路,3H-TdR渗入法检测阻断后CD3AK细胞的增殖能力,ELISA法检测阻断后CD3AK细胞分泌IFN-γ、 TNF-α和IL-10的水平,同时将CD3AK细胞作用于膀胱肿瘤BIU-87细胞,MTT法检测阻断后CD3AK细胞的杀伤活性.结果: B7-H1阻断后,CD3AK细胞的增殖能力明显增强,体外存活时间明显延长;其分泌IFN-γ、 TNF-α的水平明显提高,而分泌IL-10的水平明显下降;同时CD3AK细胞对BIU-87细胞的杀伤活性亦明显升高.结论: 阻断B7-H1通路可以促进和维持CD3AK细胞的增殖和活化,并增强其抗肿瘤的免疫效应.阻断B7-H1通路将有望成为肿瘤免疫治疗的新策略.     

CD3AK细胞过继免疫治疗的实验研究

目的: 分析抗CD3分子的单克隆抗体 (mAb)yCD3的免疫学特性和生物学活性, 观察其激活的免疫活性细胞CD3AK体外及动物体内的抑瘤作用。方法: 用流式细胞术(FCM)测定yCD3的特异性, 以及CD3AK细胞的免疫表型和产生细胞因子的情况。用 3H -TdR法测定yCD3对淋巴细胞转化的作用; 乳酸脱氢酶法 (LDH)测定CD3AK细胞的体外细胞毒活性。建立荷瘤小鼠模型, 观察静脉注射CD3AK细胞后肿瘤生长的情况、转移灶数量和小鼠存活天数。结果: yCD3与T细胞呈特异性反应, 5μgyCD3可竞争抑制 70%的标准抗CD3抗体与细胞表面CD3分子的结合。yCD3刺激外周血淋巴细胞增殖的有效浓度为 8μg/L, 并与IL- 2、抗CD28抗体有协同作用。活化的CD3AK细胞中CD3 、CD8 和CD25 细胞增多; 产生IL- 2和IFN γ的CD3 细胞均有不同程度的增加, 在抗CD28抗体协同刺激下分别增加 3. 29和 2. 47倍。当效靶细胞比为 80∶1时, CD3AK细胞对体外肿瘤细胞杀伤的百分率为 57. 54%。分组观察荷瘤动物, CD3AK细胞治疗组的抑瘤率为 33. 17%, 对小鼠肿瘤肺转移的抑制率为39. 70%, 与LAK细胞联合治疗的疗效更显著。结论: yCD3可活化T细胞, 诱导的CD3AK细胞在体外及动物体内显示抑制肿瘤的作用, 在临床抗肿瘤过继性免疫治疗中具有重要意义。     

汉黄芩素提高人CD3AK细胞杀伤肝癌细胞的实验研究和机理探讨

目的:观察汉黄芩素对人CD3AK细胞增殖及对肝癌细胞SMMC-7721杀伤活性的影响,并探讨其发生的机制。方法:分离健康者外周血PBMC;在体外用多种细胞因子联合诱导培养CD3AK细胞。收集培养第7天的CD3AK细胞给予不同浓度汉黄芩素诱导48 h:CCK-8法检测人CD3AK细胞增殖率;MTT法检测汉黄芩素对SMMC-7721细胞生长的影响;流式细胞术(FCM)检测汉黄芩素作用前后CD3AK细胞穿孔素(PFP)、颗粒酶B(Gr B)、CD107a的表达;乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定汉黄芩素对CD3AK细胞杀伤肝癌细胞SMMC-7721活性;Western blot检测药物诱导前后CD3AK细胞胞外信号调节激酶(ERK1/2)蛋白表达。用transwell chambers小室进行药物诱导前后肝癌细胞SMMC-7721迁移率检测。划痕愈合实验观察药物诱导后肝癌细胞SMMC-7721生长融合情况。结果:汉黄芩素能明显促进CD3AK细胞增殖,汉黄芩素浓度为3.2 mg/L时,细胞增殖率比对照组(0 mg/L)高23%,两者比较有统计学差异(P0.05)。在汉黄芩素为3.2 mg/L时诱导的CD3AK细胞对靶细胞SMMC-7721杀伤活性最高(60.4%),与对照组(42.7%)比较差异有统计学意义(P0.05)。经汉黄芩素诱导后的CD3AK细胞PFP、Gr B、CD107a表达显著高于对照组(P0.05)。汉黄芩素作用48h后的CD3AK细胞其ERK1/2蛋白表达较对照组均有所上调,浓度在12.5~0.8 mg/L时,ERK1/2蛋白表达高于对照组(P0.05)。经浓度为50、12.5、3.2、0.8、0.2mg/L汉黄芩诱导48 h后,肝癌细胞SMMC-7721通过transwell小孔细胞数以汉黄芩浓度为12.5 mg/L时最低、肝癌细胞SMMC-7721的融合率以3.2 mg/L时最低,与对照组比较有统计学意义(P0.05)。结论:汉黄芩素在一定浓度范围内能够促进CD3AK细胞增殖,增强其对肝癌细胞SMMC-7721的杀伤活性,抑制SMMC-7721细胞生长、迁移和细胞的融合。汉黄芩素促进CD3AK细胞增殖和功能改变可能与活化细胞ERK1/2蛋白,上调CD3AK细胞表面PFP、Gr B、CD107a的表达有关。     

人脐带血清不同组分对CD3AK细胞增殖的影响

人脐带血清有很好的支持ＣＤ３ＡＫ细胞增殖的活性，本文证明这种活性主要在大分子血清物质中。用截留分子量为１０５的滤膜超滤合并的人脐带血清，分成上下两部分，各占全血清的１／４和３／４。膜上部分为＞１０５血清；膜下部分为＜１０５血清。促进ＣＤ３ＡＫ细胞增殖的活性，主要在＞１０５血清；＜１０５血清的活性较低，尤其是对４天以上的增殖，即使增加浓度，添加＜１０５血清组的ＣＤ３Ａ细胞数目还是随培养天数下降。培养液中添加全脐带血清、＞１０５血清或重混合脐血清、ＣＤ３单抗和白细胞介素－１（ＩＬ－１），促进ＣＤ３ＡＫ细胞增殖；若培养液中改加＜１０５血清，则ＣＤ３单抗和ＩＬ－１反而使ＣＤ３ＡＫ细胞减少。此外，这两部分血清组分对ＣＤ３ＡＫ细胞合成ＤＮＡ和ＲＮＡ、对其表型、细胞表面分子表达和其杀伤活性均有不同影响。上述结果提示，人脐带血清中有分子量超过１０５的促进ＣＤ３ＡＫ细胞增殖的物质。     

PKC-α反义核酸对鼻咽癌CNE-2Z细胞增殖及c-myc和c-fos表达的影响

为探讨PKC α反义核酸对CNE 2Z细胞增殖及c myc、c fos表达的影响 ,采用脂质体 (LP)介导法 ,用 0 0 1～1 0 0 μmol/L各浓度PKC α反义核酸 (asODN)转染CNE 2Z ;MTT法及软琼脂克隆形成法分别检测CNE 2Z生长指数(growthindex ,GI)及其体外增殖能力 ;免疫组化法检测PKC α、及c myc、c fos的表达。结果表明 :PKC αasODN 0 0 5～ 1 0 0 μmol/L各浓度组CNE 2ZGI显著降低 (P <0 0 5 ) ,且呈量效依耐关系 ;其中 1 0 0 μmol/L和 0 5 0 μmol/LPKC αasODN对CNE 2Z生长有非常显著抑制作用 (P <0 0 1) ;0 5 0 μmol/LPKC αasODN组CNE 2Z软琼脂克隆形成率均低于对照组 (P <0 0 5 ) ,并可下调其PKC α、c Myc、c Fos的表达 (P <0 0 5 )。结果提示 :LP介导PKC αasODN转染CNE 2Z细胞 ,可有效阻断CNE 2ZPKC α的表达 ,抑制其体外增殖能力 ,下调c myc、c fos蛋白表达 ;PKC αasODN可能通过下调c myc、c fos表达发挥作用     

抗CD3单抗和rIL－2共刺激法诱生扩增的人CD3AK的免疫生物学特征

抗ＣＤ３单抗和ｒＩＬ－２共刺激法诱生扩增的人ＣＤ３ＡＫ是异质性细胞群，其细胞表型以ＣＤ３＋Ｔ淋巴细胞和ＣＤ５６＋ＮＫ细胞表型为主，具有活化的淋巴母细胞形态学特征，常形成集落，并表达活化淋巴细胞的表面标记，如ＩＬ－２受体和ＭＨＣⅡ类抗原。     

抗CD3单抗和rIL－2共刺激法诱生扩增的人CD3AK的免疫生物学特征

抗ＣＤ３单抗和ｒＩＬ－２共刺激法诱生扩增的人ＣＤ３ＡＫ是异质性细胞群，其细胞表型以ＣＤ３＋Ｔ淋巴细胞和ＣＤ５６＋ＮＫ细胞表型为主，具有活化的淋巴母细胞形态学特征，常形成集落，并表达活化淋巴细胞的表面标记，如ＩＬ－２受体和ＭＨＣⅡ类抗原。     

介导RA538与反义c-myc腺病毒对肿瘤细胞的作用及其分子机理

目的　比较全反式维甲酸诱导基因 RA5 38及反义 c- myc对人胃癌细胞的生物学特性 ,并探讨其作用的分子机理。方法　采用细胞生长曲线、DNA梯度降解试验、原位末端标记、流式细胞仪、逆转录 -聚合酶链反应、蛋白质印迹分析、裸鼠致瘤性、裸鼠皮下移植瘤模型实验等方法 ,对 RA5 38、反义 c- myc重组腺病毒在人胃癌细胞系 (SGC790 1)中的生物学作用及其分子机理进行体内外研究。结果　 RA5 38及反义 c- myc重组体腺病毒 (Ad- RA5 38及 Ad- ASc- myc)对 SGC790 1细胞生长抑制率分别为 76 .3%和 44 .1%。 DNA梯度降解试验、原位末端标记、流式细胞仪显示 Ad- RA5 38及 Ad- ASc- myc诱导 SGC790 1细胞凋亡。它们均能抑制SGC790 1细胞 c- myc、bcl- 2、cyclin D1基因表达 ,并刺激 bax基因表达 ,对 p5 3、p16、TGase、ras基因的表达没有影响。经 Ad- RA5 38及 Ad- ASc- myc处理的 SGC790 1细胞致瘤性消失。Ad- RA5 38及 Ad- ASc- myc对裸鼠皮下移植瘤模型瘤内注射能有效降低肿瘤的生长速度 ,生长抑制率分别为 6 0 .7%和 6 8.9%。结论　 Ad-RA5 38、Ad- ASc- myc对胃癌细胞具有显著的生长抑制及凋亡诱导作用。其作用是 c- myc、bcl- 2、bax、cyclin D1等一系列基因表达变化及其相互作用的结果 ,与 p5 3、p16、TGa     

Regulation of ICAM-3 (CD50) membrane expression on human neutrophils through a proteolytic shedding mechanism

The regulation of the cell surface expression of ICAM-3 (CD50) was investigated in human neutrophils. Immunofluorescence flow cytometry analysis revealed a remarkable and very rapid down-regulation of the ICAM-3 cell surface expression upon neutrophil activation with stimulating agents such as phorbol myristate acetate (PMA) or calcium ionophore. A similar low expression of ICAM-3 was observed on neutrophils from patients undergoing hemodialysis with cell-activating cellulosic membranes. Internalization assays with ¹²⁵I-labeled anti-ICAM-3 monoclonal antibody (mAb) suggested that ICAM-3-down-regulation was due to antigen release from the cell surface towards the outer milieu, rather than to antigen internalization. Immunoprecipitation studies confirmed this down-regulatory effect, and revealed the presence of ICAM-3 in cell-free supernatants from activated neutrophils. Furthermore, the presence of a soluble form of ICAM-3 with a range of concentrations of 0–296 ng/ml in the plasma from healthy human volunteers was detected by using a two-site mAb radioimmunoassay. A proteolytic mechanism likely accounts for this process since protease inhibitors virtually abrogated the PMA-induced down-regulation of ICAM-3. Functional studies showed that anti-ICAM-3 mAb were able to trigger homotypic neutrophil aggregation both before and after ICAM-3 down-regulation, indicating that the fraction of ICAM-3 molecules remaining on the neutrophil surface upon activation are still capable of sustaining cell adhesion. In contrast, the loss of L-selectin (CD62L) on activated neutrophils was almost complete, thus leading to an impairment of L-selectin-mediated neutrophil-endothelial cell adhesion. These results indicate that ICAM-3 is released to the medium upon neutrophil stimulation and that both ICAM-3 and L-selectin have a role in the neutrophil adhesive phenomena.     

CD28单抗对CD3AK细胞增殖及表型的影响

CD3AK细胞是用小剂量CD3单抗交联CD3分子而活化的T细胞 ,它具有较强的细胞增殖和细胞毒效能。CD2 8分子则是T细胞激活过程中所需的协同刺激分子 ,可提供T细胞活化所需的第二信号。本文利用CD2 8单抗作为CD2 8分子的配体 ,观察了CD2 8信号途径的激活对CD3AK细胞的影响。结果显示CD2 8单抗可增强CD3AK细胞的增殖活性和趋化团聚形成集落的能力 ,并优先引起CD4+T细胞的增殖。     

STAT3反义表达载体的构建、稳定表达及对M1白血病细胞表型的影响

目的 探讨JAK／STATs通路在IL－6信号转导中的功能。方法 将含起始密码子在内的约1．2kbSTAT3cDNA反向插入到真核细胞表达载体pcDNA3中,采用电穿孔法重组质粒导入到M1小鼠急性髓系白血病细胞中,进行G418筛选。结果 G418筛选出抗性克隆后,基因组DNAPCR扩增表明STAT3反义基因片段已导入M1细胞中并在基因组中整合。STAT3反义RNA不影响M1细胞的生长动力学特征,但可显著拮抗IL－6诱导的STAT3激活,并拮抗IL－6对M1细胞的生长抑制效应。结论 STAT3反义RNA能够在M1细胞中稳定表达,成为进一步研究JAK／STATs途径功能的新模型。     

Analysis of the susceptibility of CD57 T cells to CD3-mediated apoptosis

After stimulation with anti-CD3 antibody in vitro, CD57(+) T cells showed a greater susceptibility to apoptosis than CD57(-)alphabetaT cell receptor (TCR)(+) T cells (regular alphabeta T cells). The apoptotic fraction of CD57(+) T cells showed an increased production of active caspase-3. An increase in both Fas expression and Fas-ligand (FasL) production was also observed in CD57(+) T cells, whereas the expression of survivin was suppressed in CD57(+) T cells compared to that of regular alphabeta T cells. CD57(+) T cells display a biased expansion of a few Vbeta T cell fractions in individuals, but such Vbeta T cells were not specifically susceptible to CD3-mediated apoptosis. The TCR expression level of CD57(+) T cells was much lower than that of regular T cells and anti-TCR antibody stimulation induced a smaller apoptotic proportion of CD57(+) T cells than did anti-CD3 antibody. Although the CD3epsilon expression levels were similar in both T cell subsets, the CD3zeta level of CD57(+) T cells was significantly higher than that of regular T cells. These results suggest that several apoptotic and anti-apoptotic molecules are involved in the CD3-induced apoptosis of CD57(+) T cells and raise the possibility that the imbalance in expression of the CD3epsilon and CD3zeta chains may also contribute to the susceptibility of CD57(+) T cells to undergo apoptosis.     

Lung CD11c+ cells from mice deficient in Epstein-Barr virus-induced gene 3 (EBI-3) prevent airway hyper-responsiveness in experimental asthma

Epstein-Barr virus-induced gene (EBI)-3 codes for a soluble type 1 cytokine receptor homologous to the p40 subunit of IL-12 that is expressed by antigen-presenting cells following activation. Here, we analyzed the functional role of EBI-3 in a murine model of asthma associated with airway hyper-responsiveness (AHR) in ovalbumin-sensitized mice. Upon allergen challenge, EBI-3-/- mice showed less severe AHR, decreased numbers and degranulation of eosinophils and a significantly reduced number of VCAM-1+ cells in the lungs as compared to wild-type littermates. We thus analyzed lung CD11c+ cells before and after allergen challenge in these mice and found that before allergen challenge, lung CD11c+ cells isolated from EBI-3-/- mice express markers of a more plasmacytoid phenotype without releasing IFN-alpha as compared to those from wild-type littermates. Moreover, allergen challenge induced the development of myeloid CD11c+ cells in the lungs of EBI-3-/- mice, which released increased amounts of IL-10 and IL-12 while not expressing IFN-alpha. Finally, inhibition of EBI-3 expression in lung DC could prevent AHR in adoptive transfer studies by suppressing mediator release of effector cells into the airways. These results indicate a novel role for EBI-3 in controlling local immune responses in the lungs in experimental asthma.