直接和间接共培养条件下人脐带间充质干细胞对恶性胶质瘤细胞系SHG44生长的抑制作用

背景:SHG44是一种恶性胶质瘤细胞系,其生物学性状稳定、易于培养,广泛应用于动物成瘤模型制作,目前对其研究主要集中在运用药物、基因转染及电离辐射等途径抑制其生长,未见间充质干细胞对其作用的相关报道。目的:通过直接和间接共培养的方法,探讨人脐带间充质干细胞对恶性胶质瘤细胞系SHG44的作用,观察SHG44胶质瘤细胞数量及细胞周期的变化。方法:将人脐带间充质干细胞与SHG44细胞,分别在24孔板进行直接共培养,在Transwell板进行间接共培养,分别设对照组。培养3d后在荧光显微镜下观察,并收集Transwell板中的SHG44胶质瘤细胞,应用流式细胞术分别检测SHG44细胞周期。结果与结论:直接接触共培养组SHG44胶质瘤细胞数量少于对照组(P<0.05)。Transwell间接接触共培养组SHG44胶质瘤细胞数量与对照组相比,差异无显著性意义(P>0.05),其细胞周期位于G0/G1期的SHG44胶质瘤细胞比率高于对照组(P<0.05)。证实,体外培养的人脐带间充质干细胞可以通过直接及间接接触抑制恶性胶质瘤细胞系SHG44细胞的生长。     

胶质瘤细胞系SHG44中肿瘤干细胞存在的可能性

[摘要] 目的 探讨人类胶质瘤SHG44干细胞存在的可能性。方法 应用N2无血清培养基进行培养，碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子刺激细胞扩增；应用免疫组织化学染色对培养的细胞及其分化的细胞进行鉴定。结果 SHG44在无血清的培养条件下细胞的形态明显改变，部分细胞聚集成球，类似神经干细胞的神经球，呈悬浮状态生长，其余细胞贴壁生长，细胞体呈球形或椭球形，伸出双极或多极的突起。细胞表达波形蛋白和巢蛋白两种神经干细胞的标志物，细胞表达胶质纤维酸性蛋白；大部分细胞也表达神经元的标志物神经元特异性烯醇化酶、神经微丝蛋白200和βⅢ管蛋白。结论 体外的培养条件下，胶质瘤细胞系SHG44可以同时表达神经元和星形胶质细胞表型，具有干细胞的性质。     

胶质瘤细胞系SHG44中肿瘤干细胞存在的可能性

目的:探讨人类胶质瘤细胞系SHG44中干细胞存在的可能性。方法:应用N2无血清培养基进行培养,碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子刺激细胞扩增,观察其增殖生长情况;应用免疫组织化学染色对培养的细胞及其分化的细胞进行鉴定。结果:胶质瘤细胞系SHG44在无血清的培养条件下细胞的形态发生改变,部分细胞聚集成类似神经干细胞的神经球,呈悬浮状态生长。免疫组织化学检查,细胞表达巢蛋白、波形蛋白和CD117这三种神经干细胞的标志物;分化后部分细胞表达神经元的标志物βⅢ型管蛋白、NF200、NSE和TrkC;大部分细胞表达星形胶质细胞的标志物胶质纤维酸性蛋白。结论:体外培养条件下,细胞表达神经干细胞的标志物,分化后同时表达神经元和星形胶质细胞表型,具有干细胞的性质。     

昆明白小鼠胎鼠成纤维细胞不同接种密度对人胚胎干细胞的影响

目的:以昆明白小鼠胎鼠成纤维细胞作为饲养细胞,观察其不同接种密度对人胚胎干细胞的克隆生长情况及分化率的影响。方法:实验于2003-07/2005-03华中科技大学同济医学院附属同济医院完成。首先进行小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养。选取2～5代的小鼠胚胎成纤维细胞,待其至对数生长期倒掉或吸掉培养基,加入含10mg/L丝裂霉素C的细胞全培养液5mL,置37℃,体积分数0.05的CO2饱和湿度温箱中培养二三小时,在6孔板中加入0.1%明胶包被,放置30min以上,倒掉或吸掉含丝裂霉素C的培养基,磷酸盐缓冲液(-)清洗5遍,尽量除去丝裂霉素C,加入2mL0.05%的胰蛋白酶消化细胞,镜下观察,当细胞间出现裂隙,细胞变圆时(约2～4min),立即加入等量的全培养液终止消化,并用吸管反复吹打,使之成为单细胞悬液,在细胞计数板中央放置专用的盖玻片,用玻璃虹吸管吸取细胞,让虹吸管在盖玻片上或下侧的计数板凹槽处流出悬液,至盖玻片下被液体充满为止。用细胞计数板计算活细胞数,并分别按3×108、5×108、1×109L-1密度接种,机械法平均分人胚胎干细胞克隆,5个克隆/孔接种于不同密度的小鼠胚胎成纤维细胞上。观察克隆的生长情况及分化率,分化率=(完全分化克隆数 部分分化克隆数)/(完全分化克隆数 部分分化克隆数 未分化的克隆数)。结果:胚胎干细胞克隆在3×108L-1密度的小鼠胚胎成纤维细胞上生长极易分化,贴壁48h后无生长,72～96h分化率(98.0±2.0)%;接种于5×108L-1的小鼠胚胎成纤维细胞上后,胚胎干细胞生长与分化共存,贴壁后48h部分克隆生长,下次传代前分化率分化效率为(30.0±5.0)%;在1×109L-1小鼠胚胎成纤维细胞上,胚胎干细胞克隆贴壁后48h即开始生长,分化率为(1.0±0.2)%。3组之间分化率差异有显著性意义(P<0.05)。结论:以昆明白小鼠胎鼠成纤维细胞作为饲养细胞,1×109L-1可以起到促进胚胎干细胞的增殖,并抑制其分化的作用。     

人胚胎脊髓神经干细胞的体外培养条件及分化特征

目的：观察人胚脊髓神经干细胞的体外培养条件及分化情况。 方法：实验于2004-10／2005-04在西安交通大学医学院神经生物教研室完成。①从7～10周胚龄流产人胚胎脊髓分离脊髓神经干细胞（家属知情同意），采用无血清培养技术进行原代和传代培养。培养液组成：DMEM／F12（1：1），表皮生长因子20μg／L，碱性成纤维细胞生长因子20μg／L，重组人白血病抑制因子10μg／L，N2添加剂（终浓度为10mL/L）。②并采用免疫荧光法检测细胞的分化情况。 结果：①人胚脊髓神经干细胞形态学观察：原代细胞培养得到大量悬浮生长的神经干细胞球，形态较规则，呈圆形，细胞边界清楚，折光性强。部分细胞贴壁生长继而分化。传代培养后，细胞团生长速度明显加快；传3代以后脊髓神经干细胞易贴壁。②人胚脊髓神经干细胞的鉴定和分化结果：神经干细胞球，巢蛋白染色阳性；可诱导分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。 结论：人胚胎脊髓分离培养得到的细胞具有脊髓神经干细胞的基本特征，可进一步用于基础及临床研究。     

人胚胎脊髓神经干细胞的体外培养条件及分化特征

目的:观察人胚脊髓神经干细胞的体外培养条件及分化情况。方法:实验于2004-10/2005-04在西安交通大学医学院神经生物教研室完成。①从7～10周胚龄流产人胚胎脊髓分离脊髓神经干细胞(家属知情同意),采用无血清培养技术进行原代和传代培养。培养液组成:DMEM/F12(1∶1),表皮生长因子20μg/L,碱性成纤维细胞生长因子20μg/L,重组人白血病抑制因子10μg/L,N2添加剂(终浓度为10mL/L)。②并采用免疫荧光法检测细胞的分化情况。结果:①人胚脊髓神经干细胞形态学观察:原代细胞培养得到大量悬浮生长的神经干细胞球,形态较规则,呈圆形,细胞边界清楚,折光性强。部分细胞贴壁生长继而分化。传代培养后,细胞团生长速度明显加快;传3代以后脊髓神经干细胞易贴壁。②人胚脊髓神经干细胞的鉴定和分化结果:神经干细胞球,巢蛋白染色阳性;可诱导分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结论:人胚胎脊髓分离培养得到的细胞具有脊髓神经干细胞的基本特征,可进一步用于基础及临床研究。     

C6细胞中诱导体外培养大鼠神经干细胞迁移蛋白的初步分析

目的：许多体内实验表明神经干细胞具有向胶质瘤细胞迁移的特性，该特性使神经干细胞有可能成为基因治疗脑胶质瘤潜在的基因携带者。实验拟观察大鼠星形胶质瘤C6细胞诱导体外培养的大鼠神经于细胞的迁移作用，并初步分离C6细胞中诱导神经干细胞迁移的蛋白： 方法：实验于2005—01/2006—05在南通大学江苏省神经再生重点实验室完成。实验材料：C6细胞用含10％小牛血清的DMEM/F12培养基进行培养，使用时细胞处于对数生长期：清洁级的新生1周内的SD大鼠由南通大学实验动物中心提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。实验方法：从新生5～7dSD大鼠大脑皮质分离培养、纯化神经干细胞。从SD新生红皮鼠大脑皮质分离、培养、纯化星形胶质细胞。采用“Transwell Inserts”细胞培养室培养系统共培养36h，比较C6细胞和大鼠星形胶质细胞对体外培养的大鼠神经干细胞的迁移作用；自然系统聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳分离C6细胞和星形胶质细胞差异蛋白，观察各蛋白凝胶条带对神经干细胞的迁移作用。 结果：体外培养C6细胞能诱导神经干细胞迁移，迁移细胞数目与星形胶质细胞相比，差异有显著意义（P〈0．001）。将C6细胞中差异蛋白条带与神经干细胞共培养，与对应的星形胶质细胞蛋白条带相比，可观察到与相对分子质量约67000蛋白胶条共培养的神经细胞球在接近蛋白胶条的一侧细胞向胶条迁移生长。 结论：C6细胞可以诱导体外培养的神经干细胞迁移，其总蛋白在自然系统聚丙烯酰胺凝胶电泳分离实验中获得的相对分子质量为67000的蛋白组分具有诱导神经干细胞迁移的活性。     

小鼠囊胚在胚胎成纤维细胞饲养层上向胚胎干细胞的生长发育

背景:到目前为止已建立了数百个小鼠胚胎干细胞系,一般情况下实验室培养的胚胎干细胞有3个细胞来源,即胚泡内的内细胞群、胚胎生殖嵴的原始生殖细胞和应用克降技术制造人体胚胎并提取干细胞.目的:尝试用自制的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层分离培养小鼠胚胎干细胞.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-12/2007-09在辽宁医学院完成.材料:妊娠14.5 d的孕鼠40只,由辽宁医学院实验动物中心提供.方法:无菌条件下剪开孕鼠子宫壁,取出胚胎,去除头、尾、内脏和四肢后采用胰蛋白酶消化法分离培养小鼠胚胎成纤维细胞,经丝裂霉素C处理3.5 h后接种于6孔板中,细胞贴壁后即为成纤维细胞饲养层.收集3.5 d的小鼠囊胚,在显微镜下将囊胚置于上述6孔板的中央,五六_人后取隆起生长的内细胞团块,分离后再培养.主要观察指标:成纤维细胞饲养层的制备情况,胚胎干细胞的生长状态、碱性磷酸酶染色结果及分化趋势.结果:光镜下小鼠胚胎成纤维细胞呈不规则形,生长较快,传代比例为1:4,经丝裂霉素C处理后细胞贴壁较慢,失去分裂增殖能力.小鼠囊胚孵出透明带的时间为24～72 h,从胞膜中孵出约为1 d,3～5 d后可形成胚胎干细胞集落,7 d后集落呈"鸟巢"状.组织化学染色后可见细胞内有大量的蓝紫色颗粒沉积,连续培养20 d,期间不换培养液,可见胚胎干细胞团分化为亮度较小、界限清楚的单核细胞.结论:小鼠囊胚在胚胎成纤维细胞饲养层上可发育成胚胎干细胞,并能进行传代.     

视神经离断对神经干细胞定向诱导分化的影响

目的探讨大鼠视神经离断对神经干细胞-上丘组织共培养诱导分化的影响。方法采用机械分离,无血清选择培养的方法从孕14d的胚鼠上丘中获取神经干细胞并进行传代培养。使用免疫荧光技术对神经干细胞进行鉴定。采用显微手术的方法建立大鼠视神经离断模型,分别取正常大鼠、假手术和视神经离断大鼠的上丘组织进行体外培养。使用组织．细胞共培养系统将大鼠上丘组织与神经干细胞共培养,观察干细胞分化过程,对分化细胞进行鉴定,并与干细胞的自然分化过程进行比较。结果从胚鼠上丘中获得的细胞在无血清培养条件下聚集呈球形悬浮生长,可形成单细胞克隆,具有多向分化能力,经免疫荧光鉴定证实为神经干细胞。视神经离断大鼠的上丘组织与胚胎上丘源神经干细胞共培养可以促进神经干细胞的分化,并诱导分化出Thyl．1阳性的视网膜神经节细胞。结论从胚胎大鼠上丘可以分离培养出神经干细胞,与视神经离断大鼠的上丘组织共培养可以诱导上丘源神经干细胞分化为视网膜神经节细胞。     

人脑神经干细胞对不同储存方式及分离培养和诱导分化条件的要求

背景：近年来发现神经干细胞可于体外增殖并分化为神经细胞，是用来修复替代损伤神经组织的较为理想的来源，但是神经干细胞的培养中如何提高它的增殖能力，诱导分化成需要的表现型，尚处于研究探讨阶段。目的：探讨细胞冻存和非冻存方法分离培养人脑神经干细胞及诱导其向成熟神经细胞分化的培养条件。设计：以细胞为观察对象，单一样本研究。单位：江西医学院泌尿外科研究所，江西医学院第二附属医院神经外科。材料：实验于2003-12／2004-06在江西医学院泌尿外科研究所完成。取16周龄新鲜人胚脑组织。方法：用胰蛋白酶消化法从人胚脑中分离单个细胞，细胞冻存1个月后复苏或／和新鲜细胞用无血清培养基进行体外培养，碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子刺激细胞生长，用血清诱导其分化；采用免疫荧光细胞化学染色方法检测培养的细胞神经巢蛋白抗原和分化后成熟神经细胞抗原神经元特异性烯醇化酶的表达。观察碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子及血清对分离培养的人脑神经干细胞增殖与分化的影响。主要观察指标：①冻存与新鲜细胞后续培养的生长状况。②细胞形态变化。③神经干细胞标志物神经巢蛋白及成熟神经细胞标志神经元特异性烯醇化酶的鉴定。结果：①从胚龄16周的新鲜人胚脑中成功分离出神经干细胞。人胚脑原代细胞为圆形亮球状，培养3d后可见细胞开始聚集成神经球，部分呈悬浮生长，2周后神经球增大，部分细胞增大数倍，具有极强折光性，可见分裂增殖。经传代后细胞仍保持原有特征，细胞形态不变。克隆细胞在有血清培养基中培养，24h后可见大部分细胞贴壁生长，细胞从神经球游出分散，形态不规则；48h后多数细胞分化为大量形态不一的、分散成片的多突起星状细胞和神经元样细胞，突起相互交织成网。②分离出的神经干细胞在体外培养条件下传代培养，并表达神经干细胞标志巢蛋白；含血清培养基培养48h分化后的细胞主要表达成熟神经细胞标志神经元特异性烯醇化酶。③冻存复苏的细胞95％，以上为活细胞，与新鲜细胞比较，细胞生长状况无明显差别。结论：用无血清培养条件下结合碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子的作用，使干细胞体外得到了分离培养、增殖和纯化，证实其方法可行，同时冻存和新鲜细胞的比较，说明可用冻存方法保存人胚脑细胞，复苏后使用。