Dickkopf(DKK1)在肝癌组织及多种人肿瘤细胞系中的表达分析

目的:检测dickkopf(DKK1)在肝癌组织及多种恶性肿瘤细胞系中的表达情况。方法:采用酶联免疫吸附实验、real time PCR、RT-PCR及Western blot对DKK1在肝癌组织及多种恶性肿瘤细胞系的表达情况进行检测。结果:肝癌组织检测RT-PCR,10/15肝癌中高表达;Real-time PCR方法检测,8/8肝癌中高表达;Western blot方法检测,5/8肝癌中高表达。酶联免疫吸附实验检测到DKK1在多种恶性肿瘤细胞系的细胞培养液上清液中均有表达,蛋白质表达量波动于5~210 ng/mL之间;10种人恶性肿瘤细胞系在mRNA水平和蛋白质水平DKK1的表达均能检测到。结论:DKK1高表达于肝癌组织及广泛表达于多种恶性肿瘤细胞系,提示DKK1可能在肿瘤的发生、发展中起到重要作用。     

DKK1在胶质瘤中的表达分析及其与肿瘤恶性程度的相关性

背景与目的：DKK基因在胶质瘤中的表达及意义尚不清楚,本研究检测分析胶质瘤中DKK1的表达情况及探讨与胶质瘤级别之间的关系。方法：ELISA、免疫组织化学检测培养细胞株/系、脑脊液、血清和胶质瘤组织标本中的蛋白表达,半定量RT-PCR检测DKK1胶质瘤培养细胞中培养细胞株/系、胶质瘤组织标本基因表达,统计不同级别胶质瘤间DKK1表达的差异。结果：ELISA检测结果示高级别胶质瘤细胞组中DKK1蛋白量显著高于低级别胶质瘤细胞及正常对照组（P〈0.05）。脑脊液中胶质瘤组DKK1含量显著高于神经系统良性肿瘤组及正常对照组;血清中胶质瘤组、神经系统良性肿瘤组及正常对照组之间DKK1含量差异均未见统计学意义。免疫组织化学结果显示胶质瘤组织中DKK1阳性率（91.5%,43/47）高于正常脑组织中阳性率（18.1%,2/11）,且DKK1在胶质瘤组织中的表达与肿瘤病理分级呈正相关。半定量RT-PCR结果显示胶质母细胞瘤细胞株/系的DKK1基因扩增产物均有特异性条带,SHG44、D341和正常对照组人脑星形胶质细胞则无;胶质瘤组织中灰度值高于正常组织,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：DKK1在胶质瘤中高表达,且随着肿瘤级别的增高而增高;胶质瘤脑脊液中DKK1含量显著高于神经系统良性肿瘤组及正常对照组,可作为胶质瘤鉴别诊断指标。     

水通道蛋白在人胃癌细胞株表达的初步研究

目的：研究水通道蛋白家族（Aquaponns，AQPs）在不同分化程度的人胃腺癌细胞株及人正常胃粘膜细胞株中的表达情况并初步探讨其意义。方法：采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测水通道蛋白AQP0～AQP12在人胃腺癌细胞株MKN45、AGS、SGC7901及人正常胃粘膜细胞株GES-1中的表达。结果：AGS、SGC7901与GES-1细胞株表达AQP0、1、3、4、5、7、11mRNA；低分化型细胞株MKN45仅表达AQP3mRNA。结论：不同分化程度的人胃癌细胞株中AQPs表达有差异，在低分化细胞株中仅少数AQPs表达，提示AQPs表达可能与胃癌的病理分级相关，并在胃癌发生、发展过程中发挥作用。     

胶质瘤干细胞样细胞中MGMT表达以及与替莫唑胺的耐药关系研究

背景与目的:O6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(O6-methylguanine DNA methyltranferase,MGMT)是一种能将鸟嘌呤DNA第六位氧氧原子上的甲基加合物移除和修复损伤DNA的酶,临床上能影响甲基化类化疗药物的疗效。胶质瘤干细胞样细胞被认为是胶质瘤复发的根源之一。本研究旨在探讨MGMT在胶质瘤干细胞样细胞中的表达以及与替莫唑胺耐药的关系。方法:采用悬浮克隆球形成法自胶质瘤细胞株U251、SKMG-4、SF295、SKMG-1、U373、U87、MGR1和MGR2中富集胶质瘤干细胞样细胞。应用免疫荧光技术检测胶质瘤干细胞样细胞相关分子标志;裸鼠移植瘤试验检测胶质瘤干细胞样细胞的成瘤能力。RT-PCR和Western blot检测胶质瘤干细胞样细胞中MGMT的表达;甲基化特异性PCR分析胶质瘤干细胞样细胞MGMT启动子甲基化状况;CCK-8法检测不同浓度替莫唑胺对胶质瘤干细胞样细胞和胶质瘤细胞增殖的作用。结果:分别自8个胶质瘤细胞株中成功富集胶质瘤干细胞样细胞:U251G、SKMG-4G、SF295G、SKMG-1G、U373G、U87G、MGR1G和MGR2G。胶质瘤干细胞样细胞高表达CD133、Nestin和Sox-2等干细胞标志,而且低表达GFAP和TUJ1。胶质瘤干细胞样细胞均能在裸鼠移植成瘤。MGMT在8株胶质瘤细胞及U87G、MGR1G和MGR2G中为阴性,而在U251G、SKMG-4G、SF295G、SKMG-1G和U373G中为阳性表达。替莫唑胺对胶质瘤干细胞样细胞和胶质瘤细胞的抑制作用差异具有显著性。胶质瘤干细胞样细胞与胶质瘤亲代细胞相比更加耐药(P<0.05)。另外,替莫唑胺对MGMT阳性及MGMT阴性胶质瘤干细胞样细胞IC50间的差异无统计学意义(P>0.05)。结论:MGMT阴性表达的胶质瘤细胞经干细胞样培养后,MGMT表达可转为阳性;胶质瘤干细胞样细胞较胶质瘤亲代细胞更耐受替莫唑胺;MGMT的表达与胶质瘤干细胞样细胞对替莫唑胺的耐受之间无明显关联,提示胶质瘤干细胞样细胞对替莫唑胺的耐药可能还有MGMT以外的机制参与。     

肝癌DKK1基因的表达及突变分析

目的:探讨中国地区人肝癌发生发展过程中有无DKK1基因突变。方法:Northernblot方法分析12例肝癌患者癌和癌旁肝组织DKK1mRNA表达水平。采用PCRSSCP方法,检测20例肝癌患者(包括癌和癌旁肝组织)及8种人肝癌细胞株中有无DKK1基因突变,并采用DNA测序对PCRSSCP突变分析结果加以验证。结果:Northernblot显示12例肝癌患者中7例存在癌组织DKK1mRNA高表达而癌旁肝组织微弱表达或不表达。突变检测发现20例肝癌患者及8种人肝癌细胞株中仅1例肝癌患者存在DKK1基因的同义突变(单核苷酸多态现象)。结论:DKK1在中国人肝癌中存在高表达,但未发现突变发生,提示DKK1基因参与肝癌的癌变过程可能并不依赖于该基因的突变。     

Cox-2抑制剂celebrex对胰腺癌PC-3细胞系VEGF表达的影响

目的：探讨选择性环氧合酶-2(COX-2)抑制剂celebrcx对胰腺癌PC-3细胞系血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法：应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和酶联免疫吸附测定(ELISA)方法，检测选择性COX-2抑制剂celebrex与胰腺癌PC-3细胞株VEGF表达间的时-效关系和量-效关系。结果：celebrex在一定时间和剂量范围内可抑制PC-3细胞中VEGF的表达。结论：COX-2可能参与了胰腺癌PC-3细胞株VEGF的分泌，而选择性COX-2抑制剂celebrcx则可在一定时间和剂量范围内抑制VEGF的表达。     

Th2类细胞因子优势表达在人脑胶质瘤发生及发展中的作用

目的 探讨Th1／Th2类细胞因子基因在人脑胶质瘤中的分泌及表达情况,以及它们在脑胶质瘤发生及发展中的作用。方法 以IL—2、IFNγ代表Th1类细胞因子,IL—4、IL—6及IL—10代表Th2类细胞因子,采用ELISA法检测脑胶质瘤细胞株培养上清中细胞因子的活性,采用逆转录聚合酶链反应方法(RT—PCR)检测Th1／Th2类细胞因子基因在脑胶质瘤细胞、肿瘤浸润淋巴细胞及细胞株中的表达情况。结果 人脑胶质瘤细胞、肿瘤浸润淋巴细胞及脑胶质瘤细胞株均呈现明显的Th2类细胞因子基因优势表达,而正常人脑组织中则无这种表达趋势。结论 Th2类细胞因子在人脑胶质瘤中的优势表达可能是导致脑胶质瘤患者细胞免疫功能低下的原因之一,有可能在脑胶质瘤的发生及发展中起一定作用。     

非小细胞肺癌中hRAD17基因表达与淋巴结转移的关系

目的　研究非小细胞肺癌 (NSCLC)中hRAD17基因的表达频率及其与淋巴结转移的关系。方法　应用逆转录 多聚酶链反应 (RT PCR)方法检测了 5 0例肺癌标本的hRAD17表达。以人NSCLC细胞株SPC A1作为阳性对照 ,癌周正常肺组织作为阴性对照。结果　 5 0例肺癌中 38例hRAD17阳性表达 ,阳性率为 76 %。 38例阳性病例中有纵隔淋巴结转移者为 31例(81.5 % ) ,而 12例阴性表达病例中仅 3例 (2 5 % )有纵隔淋巴结转移 ,两组间差异具有统计学显著意义 (P <0 .0 1)。结论　hRAD17基因在肺癌中高表达 ,其阳性表达与淋巴结转移密切相关。     

PGE2对胰腺癌PC-3细胞株血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响

目的探讨PGE2对胰腺癌PC-3细胞株血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响.方法应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和酶联免疫吸附测定(ELISA)方法,在选择性环氧合酶(COX)-2抑制剂Celebres的干预的基础上,观测PGE2对胰腺癌PC-3细胞株VEGF表达的影响.结果 PGE2可上调胰腺癌PC-3细胞株VEGF的表达,且表现出一定的剂量依赖性关系.结论 PGE2可上调胰腺癌PC-3细胞株VEGF的分泌,其可能在COX-2参与胰腺癌新生血管生成的过程中起着重要的介导作用.     

共刺激分子4-1BBL和B7-1在人脑胶质瘤细胞中的表达

背景与目的：4-1BBL和B7-1为诱导和维持T细胞活化提供了重要的共刺激信号,目前被认为是提高抗肿瘤免疫的治疗靶点。本研究探讨4-1BBL和B7-1在7株胶质瘤细胞系表面的表达情况。方法：用流式细胞仪检测7株胶质瘤细胞株表面的共刺激分子4-1BBL和B7-1的表达,同时用MTT法分析胶质瘤细胞系对抗癌药物长春新碱（VCR）敏感性,并分析4-1BBL的表达与耐药性的相关性。结果：发现在所检测的胶质瘤细胞表面有不同程度的表达4-1BBL,但均不表达B7-1。其中T98G和MGR1细胞表面的4-1BBL表达〉30％,对VCR不敏感。UW28、SKMG1、MGR2、SF767、SKMG4细胞表面的4-1BBL表达〈10％。对VCR敏感。结论：本研究所检测的胶质瘤细胞均不表达共刺激分子B7-1。但有不同程度的表达4-1BBL,并且4-1BBL高表达的胶质瘤细胞对长春新碱敏感性差。     

Enhanced MGMT expression contributes to temozolomide resistance in glioma stem-like cells

O6-methylguanine DNA methyltransferase （MGMT） can remove DNA alkylation adducts, thereby repairing damaged DNA and contributing to the drug resistance of gliomas to alkylating agents. In addition, glioma stem-like cells （GSCs） have been demonstrated to be involved in the recurrence and treatment resistance of gliomas. In this study, we aimed to investigate MGMT expression and regulatory mechanisms in GSCs and the association of MGMT with temozolomide （TMZ） sensitivity. GSCs were enriched from one MGMT-positive cell line （SF-767） and 7 MGMT-negative cell lines （U251, SKMG-4, SKMG-1, SF295, U87, MGR1, and MGR2） through serum-free clone culture. GSCs from the U251G, SKMG-4G, SF295G, and SKMG-1G cell lines became MGMT-positive, but those from the U87G, MGR1G, and MGR2G cell lines remained MGMT-negative. However, aJl the GSCs and their parental glJoma cell lines were positive for nuclear factor-KB （NF-KB）. In addition, GSCs were more resistant to TMZ than their parental glioma cell lines （P 〈 0.05）. However, there was no significant difference in the 50% inhibition concentration （ICo） of TMZ between MGMT-positive and MGMT-negatJve GSCs （P 〉 0.05）. When we treated the MGMT-positive GSCs with TMZ plus MG-132 （an NF-KB inhibitor）, the antitumor activity was significantly enhanced compared to that of GSCs treated with TMZ alone （P 〈 0.05）. Furthermore, we found that MGMT expression decreased through the down-regulation of NF-KB expression by MG-132. Our results show that MG-132 may inhibit NF-KB expression and further decrease MGMT expression, resulting in a synergistic effect on MGMT-positive GSCs. These results indicate that enhanced MGMT expression contributes to TMZ resistance in MGMT-positive GSCs.     

Glutathione content and glutathione-S-transferase expression in 1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea-resistant human malignant astrocytoma cell lines

gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine (GSH) has been shown to inactivate 1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea (BCNU) and quench DNA crosslink precursors of BCNU. Because of the central role of 2-chloroethyl-nitrosoureas in brain tumor chemotherapy, we investigated the intracellular GSH content and the expression of specific glutathione-S-transferases (GSTs) in three human malignant astrocytoma cell lines (UWR1, UWR2, and UWR3) of varying BCNU resistance to determine the interrelationship of these parameters with brain tumor BCNU resistance. GSH was assayed by ion-exchange high performance liquid chromatography after derivatization with 1-fluoro-2,4 dinitrobenzene. Both bulk and specific GST (acid, near-neutral, and basic) activities were examined using substrates that show high specificities to the different GSTs. Western blot analyses with antisera against GST-alpha, -mu, and -tau subunits were also performed on partially purified GST from the cells of each cell line. The results showed GSH content of 91, 46.5, and 28.3 nmol GSH/mg protein for UWR1, UWR2, and UWR3, respectively. Bulk GST activity (with 1-chloro-2,4-dinitrobenzene as substrate) also correlated with increasing BCNU resistance. Of the three GST classes examined by both substrate specificities and Western blotting, only the expression of the acidic form, GST-tau, correlated significantly with the rank order of BCNU resistance of the cell lines. GST-mu and -alpha were present in only trace amounts in all three cell lines.