酵母双杂交技术筛选人胰腺细胞中HCV 1b NS3结合蛋白基因

目的:应用酵母双杂交技术筛选人胰腺cDNA文库中与HCV 1b亚型非结构蛋白NS3相互作用的结合蛋白的编码基因, 为进一步研究HCV影响糖、脂代谢机制奠定实验基础.方法:扩增人胰腺cDNA文库并纯化鉴定, 纯化后的文库质粒转化酵母菌Y187; 构建诱饵质粒PGBKT7-NS3并转化酵母菌AH109, 在色氨酸缺陷型培养基(SD/-Trp)上筛选阳性菌落.应用酵母双杂交系统3将阳性重组AH109菌株与重组酵母菌株Y187进行配合, 在四缺培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)和铺有X-α-gal的四缺培养基上进行筛选, 提取蓝色酵母菌落质粒, 电转化大肠埃希菌DH5α后提取质粒测序,对测序结果进行序列比对和分析.结果:成功构建人胰腺cDNA文库和pGBKT7-NS3重组质粒; 将pGBKT7-NS3质粒转化AH109酵母菌株后, 并从人胰腺cDNA文库中筛选出11种与HCV NS3蛋白相结合的蛋白基因.结论:筛选出的与HCV NS3蛋白结合的胰腺蛋白基因中, 部分与2型糖尿病、肝脏脂肪变性密切相关.     

酵母双杂交技术筛选人白细胞cDNA文库中HCV NS4B结合蛋白

目的筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白4B（HCV NS4B）在人白细胞eDNA文库中的相互作用蛋白。方法应用酵母双杂交技术筛选人白细胞文库中与HCV NS4B相互作用的蛋白,对筛选结果中目的蛋白的编码基因进行克隆,并构建其酵母表达载体,在酵母细胞中进行回交验证。结果共筛选出人白细胞eDNA文库中与能够与HCV NS4B相互作用的蛋白5种（溶菌酶前体、推测的人翻译起始因子、人选择素P配体、人HC7371基因和TNF—alpha转换酶）以及一个未知功能基因。对新基因成功克隆,在酵母细胞中回交验证了HCVNS4B与该基因的相互作用。结论在人白细胞cDNA文库中存在一些能够与HCV NS4B相互作用的蛋白,它们均与细胞的生长和代谢状态有着密切的关系,其具体作用机制尚有待进一步研究。     

酵母双杂交技术筛选HCV E1蛋白结合的肝细胞蛋白基因

目的:用酵母双杂交技术筛选肝细胞中与HCV E1蛋白结合蛋白的编码基因. 方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HCV E1基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提出质粒,转化入大肠杆菌(DH5α),提出质粒并测序, 进行生物信息学分析. 结果:获得了19个与E1蛋白特异陛结合的阳性克隆,其中16个克隆为已知蛋白基因和3个克隆为未知功能蛋白基因. 结论:成功克隆出与丙型肝炎病毒E1蛋白结合的肝细胞蛋白,为进一步研究HCV E1在HCV致病中的作用提供了新线索.     

酵母双杂交技术筛选与克隆白细胞中与NS5ATP7蛋白结合的蛋白编码基因

目的 应用酵母双杂交体系寻找与丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A反式激活蛋白7(human gene 5 transactivated by nonstructural protein 5A of hepatitis C virus,NS5ATP7)相互作用的白细胞蛋白,以探讨SN5ATP7的生物功能。方法 应用酵母双杂交系统3,构建NS5ATP7诱饵质粒,转化酵母AH109,与含人白细胞cDNA文库质粒的酵母Y187进行配合,于涂有X-α-gal营养缺陷型培养基(SD／-Trp-Leu-His-Ade)上筛选生长。挑选蓝色克隆,提取此酵母克隆的质粒转化大肠杆菌提取质粒。DNA后进行测序,然后进行生物信息学分析。结果 筛选出15个与NS5ATP7特异性相互作用的克隆,其中包括人类RhoGDF分裂抑制剂α、人类细胞色素b558a亚单位、人类MLL(MLL)基因外显子、人类S100钙结合蛋白A9(钙粒蛋白B)、人类移动抑制因子相关蛋白14变体E(S100A9)、人类金属硫蛋白2A、人类染色体序列及人类cDNA序列等,1个是未知功能基因。结论 初步克隆了NSSATP7与白细胞结合蛋白基因,根据所克隆到的基因,对以后研究NS5ATP7的功能有一定的提示作用;为以后研究这些能与NS5ATP7相互作用的基因在白细胞中的生理功能奠定了基础。     

酵母双杂交技术筛选α干扰素结合蛋白的基因

目的 筛选人肝细胞cDNA文库中与α干扰素（IFNα）蛋白具有相互作用的蛋白基因。方法 用聚合酶链反应（PCR）扩增IFNα基因，连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒，转染酵母细胞AH109，Western blot证明IFNα蛋白能够在AH109中表达。然后将AH109与转染了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合，在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖（X-α-gal）上进行双重筛选阳性菌落，提取质粒后转化DH5α大肠埃希菌并经氨苄西林抗性筛选，提取单克隆菌落质粒，酶切答定正确者进行测序，再行生物信息学分析。结果 成功克隆化IFNα基因并在酵母细胞中表达，应用酵母双杂交筛选出阳性菌落34个，经生物信息学分析，排除读码框架不正确者，最后得到8种已知基因：玻璃体连接蛋白、纤维蛋白原α多肽、人类免疫缺陷病毒（HIV）1Tat相互作用蛋白2、精氨酸酶、NADH脱氢酶1β亚复合物、转铁蛋白受体2α、酒精脱氢酶IBβ多肽、肝细胞癌蛋白（HCC-1）；2种染色体基因：人染色体17，克隆RP11-35083，人染色体10，克隆RP11-35101。结论 成功克隆出IFNα基因，并从肝细胞cDNA文库中筛选出8种能与IFNα具有结合作用的蛋白基因。     

酵母双杂交筛选肝细胞中乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白结合蛋白基因

目的筛选并克隆人肝细胞中与HBsAg中蛋白(MHBs)相互作用肝细胞蛋白的基因,探讨MHBs的生物学功能。方法应用PCR法以HBV adr亚型全序质粒A7为模板扩增MHBs基因,克隆到pGEM-T载体中扩增并测序鉴定,EcoR I和BamH I双酶切后回收连接到酵母表达载体pGBWT- 7中并应用酵母双杂交系统3,构建MHBs诱饵质粒并转化酵母AH109,与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖苷酸上进行双重筛选阳性菌落,提取阳性酵母菌落的质粒转化大肠杆菌氨苄青霉素-LB平板上,选择并测序结果在GenBank中进行生物信息学分析。结果构建MHBs酵母细胞表达载体,配合后筛选出既能在四缺培养基(SD/-Trp-Leu-Ade-His)上培养也能在铺有X-α-半乳糖苷酸的四缺培养基上生长,并变成蓝色的真阳性菌落2个,其中一个克隆为人醛缩酶B、另一个克隆为未知功能基因,新基因命名为MBP1。结论扩增出MHBs基因,用酵母双杂交技术筛选出2个与MHBs相互作用的肝细胞结合蛋白编码基因,为阐明MHBs的生物学功能及HBV损害肝细胞、致癌等方面的作用提供了新线索。     

酵母双杂交技术筛选乙型肝炎e抗原反式激活蛋白结合蛋白的基因

目的筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与乙型肝炎e抗原反式激活蛋白(HBeAgTP)相互作用蛋白的基因。方法应用抑制性消减杂交技术及生物信息学技术筛选并克隆HBeAg反式激活的新型靶基因HBeAgTP。用聚合酶链反应(PCR)法扩增HBeAgTP基因,连接人酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α gal)上进行双重筛选阳性菌落,PCR从中扩增出目的片段并测序,进行生物信息学分析。结果成功克隆出HBeAgTP基因并在酵母细胞中表达,应用酵母双杂交筛选出阳性菌落24个,经生物信息学分析为15种已知基因。结论成功克隆出HBeAgTP的结合蛋白,包括一些与细胞内蛋白质的转录、翻译、免疫调节及物贡和能量代谢相关的基因。     

Screening of hepatocyte proteins binding to complete S protein of hepatitis B virus by yeast-two hybrid system

AIM: To investigate the biological function of complete S protein and to look for proteins interacting with complete S protein in hepatocytes. METHODS: We constructed bait plasmid expressing complete S protein of HBV by cloning the gene of complete S protein into pGBKT7, then the recombinant plasmid DNA was transformed into yeast AH109 (a type). The transformed yeast AH109 was mated with yeast Y187 (α type) containing liver cDNA library plasmid in 2×YPDA medium. Diploid yeast was plated on synthetic dropout nutrient medium (SD/-Trp-Leu-His-Ade) containing X-α-gal for selection and screening. After extracting and sequencing of plasmids from positive (blue) colonies, we underwent sequence analysis by bioinformatics. RESULTS: Nineteen colonies were selected and sequenced. Among them, five colonies were Homo sapiens solute carrier family 25, member 23 (SLC25A23), one was Homo sapiens calrer.iculin, one was human serum albumin (ALB) gene, one was Homo sapiens metallothionein 2A, two were Homo sapiens betaine-homocysteine methyltransferase, three were Homo sapiens Na+ and H+coupled amino acid transport system N, one was Homo sapiens CD81 antigen (target of anti-proliferative antibody 1) (CD81), three were Homo sapiens diazepam binding inhibitor, two colonies were new genes with unknown function. CONCLUSION: The yeast-two hybrid system is an effective method for identifying hepatocyte proteins interacting with complete S protein of HBV. The complete S protein may bind to different proteins i.e., its multiple functions in vivo.